Udział ogona poli(A) w inicjacji translacji z kodonu AUG1 i AUG2

Przełomowe prace na temat stymulującego wpływu kapu i ogona poli(A) na translację mRNA zostały opublikowane w latach ’90 przez Gallie’ego [149]. Okazuje się, że translacja większości eukariotycznych mRNA wymaga synergistycznego oddziaływania kapu z ogonem poli(A) na etapie inicjacji. Wykazano również pozytywny wpływ ogona poli(A) na IRES-zależną translację u picornawirusów [150].

Aby dowiedzieć się, czy ogon poli(A) uczestniczy w translacji inicjowanej z kodonów AUG1 i AUG2, za pomocą polimerazy poli(A) dodawałam ogon poli(A) o długości około 100 nukleotydów do końca 3′ kapowanych mRNA P1-p53-Luc i P1-Np53-Luc. Reakcję poliadenylacji przeprowadzałam zawsze w takich samych warunkach, aby uzyskać mRNA z ogonem poli(A) o stałej długości. Długość ogona poli(A) sprawdzałam za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym. Otrzymane mRNA posiadające kap na końcu 5′ i ogon poli(A) na końcu 3′ ulegały translacji w RRL. Doświadczenie obejmowało również reakcje translacji na matrycach mRNA P1-p53-Luc i P1-Np53-Luc z niefunkcjonalnym analogiem kapu ApppG wbudowanym na końcu 5′, z którym nie wiąże się czynnik inicjacyjny eIF4E (Rys. 28). Wydajność translacji takich mRNA określałam w stosunku do mRNA posiadających funkcjonalny kap na końcu 5′. Zarówno w przypadku mRNA z jednym kodonem AUG1 (mRNA P1-p53-Luc) jak i dwoma kodonami AUG1 i AUG2 (mRNA P1-Np53-Luc), obecność ogonu poli(A) inhibowała translację. Ilość białka syntetyzowanego z kodonu AUG1 w obu mRNA, spadła do poziomu 0,21 i 0,44. Podobny wynik otrzymałam w przypadku kodonu AUG2 w mRNA P1-Np53-Luc, z którego poziom syntetyzowanego białka po dodaniu ogona poli(A) był niższy o około 50%.

Rys. 28 Wpływ ogonu poli(A) na końcu 3′ mRNA P1-Np53-Luc (A) i P1-p53-Luc (B) oraz niefunkcjonalnego kapu ApppG na końcu 5′ na translację in vitro. Wartości liczbowe w nawiasach oznaczają stopień inhibicji lub stymulacji reakcji, w porównaniu z poziomem białek otrzymywanych

z mRNA z kapem na końcu 5′.

77 Również niefunkcjonalny kap, ApppG wpływał inhibująco na translację z kodonu AUG1, a jej poziom był porównywalny z efektem dodania do obu mRNA ogona poli(A). Zaskakujący wynik otrzymałam dla kodonu AUG2, z którego translacja była stymulowana po dodaniu niefunkcjonalnego analogu ApppG do końca 5′.

Aby sprawdzić jak ogon poli(A) wpływa na translację mRNA, który nie posiada trwałych termodynamicznie motywów strukturalnych w regionie terminalnym 5′ mRNA, przeprowadziłam szereg reakcji translacji w RRL z kontrolnym mRNA Luc, który koduje białko reporterowe lucyferazy. Zastosowałam różne modyfikacje końca 5′ i 3′ mRNA, polegające na dodaniu kapu i ogona poli(A). Wpływ wszystkich modyfikacji odnosiłam do efektywności translacji mRNA z wbudowanym na końcu 5′ funkcjonalnym kapem (Rys. 29).

Rys. 29 Translacja in vitro kontrolnego mRNA Luc oraz jego pochodnych posiadających analogi kapu na końcu 5′ i ogon poli(A).

Synteza lucyferazy z mRNA Luc w RRL zachodziła na podobnym poziomie, gdy mRNA nie posiadał kapu na końcu 5′ lub gdy był to kap niefunkcjonalny, ApppG. Widoczny jest również inhibujący wpływ ogona poli(A) na translację. Aczkolwiek mRNA Luc, który zawierał zarówno 5′ kap jak i 3′ poli(A), wykazywał zbliżoną aktywność translacyjną do kontrolnego mRNA z kapem na końcu 5′.

3.2.3. Translacja modelowych mRNA zawierających warianty regionu terminalnego 5′ mRNA p53 w komórkach HeLa i MCF-7

Aby dowiedzieć się w jaki sposób warianty regionu terminalnego 5′ mRNA p53 wpływają na efektywność translacji białka reporterowego lucyferazy Renilla w środowisku komórkowym, komórki raka szyjki macicy HeLa i raka piersi MCF-7 transfekowałam modelowymi konstruktami mRNA. Wszystkie mRNA posiadały kap na końcu 5′, aby zwiększyć ich trwałość w komórce i zapobiec przedwczesnej degradacji. Równocześnie

78 z każdym konstruktem mRNA kodującym lucyferazę Renilla (Rluc), wprowadzałam do komórek mRNA lucyferazy Firefly (Fluc), posiadający kap na końcu 5′ i ogon poli(A) na końcu 3′. Wykorzystanie technologii podwójnego reportera opartej o dwa białka reporterowe, pozwala na normalizację różnic w wydajności transfekcji, która może wynikać ze zmiennej liczby komórek lub warunków transfekcji w kolejnych doświadczeniach.

Obie lucyferazy są enzymami katalizującymi utlenianie lucyferyny, w wyniku czego dochodzi do emisji fali świetlnej (Rys. 30). Jednak ze względu na odmienną strukturę, oba enzymy wykazują inne wymagania względem substratu, dzięki czemu możliwe jest określenie poziomu obydwu lucyferaz podczas jednego pomiaru luminescencji.

Rys. 30 Reakcje chemiluminescencji katalizowane przez enzymy: lucyferazę Renilla i Firefly.

Gdy komórki obu linii osiągnęły odpowiedni stopień konfluencji, kotransferowałam je równomolowymi ilościami mRNA za pomocą odczynnika TransMessenger (Qiagen). Po określonym czasie (w zakresie kilku godzin), komórki poddawałam lizie i przeprowadzałam pomiar aktywności obu lucyferaz. W tym celu wykorzystałam komercyjny zestaw zawierający substraty dla lucyferazy Firefly i Renilla. Następnie dokonywałam pomiaru chemiluminescencji. Otrzymane wartości dla lucyferazy Renilla, która powstawała pod kontrolą wariantów regionu terminalnego 5′ mRNA p53, normalizowałam do wartości otrzymanej dla lucyferazy Firefly, która była syntetyzowana z kontrolnego mRNA Fluc. Następnie znormalizowane wartości odnosiłam do poziomu lucyferazy Renilla syntetyzowanej z kontrolnego mRNA Rluc.

79 Rys. 31 Poziom białka reporterowego lucyferazy Renilla powstającego pod kontrolą wariantów regionu terminalnego 5′ mRNA p53 w komórkach HeLa i MCF-7.

Diagram na rysunku 31 ilustruje wpływ wariantów regionu terminalnego 5′ mRNA p53 na poziom białka lucyferazy Renilla w komórkach HeLa i MCF-7. W przypadku konstruktów mRNA zawierających jeden kodon inicjacyjny AUG1 (oznaczone jako A i B), ilość powstającego białka była niższa w obu liniach komórkowych, w porównaniu z kontrolnym mRNA Rluc (oznaczonym jako L). Przy czym mRNA P1-p53-Luc

80 i P0-p53-Luc ulegają translacji na podobnym poziomie w komórkach HeLa. Z kolei, obecność regionu P0-P1 powoduje 3-krotny spadek ilości syntetyzowanego białka w komórkach MCF-7. W przypadku konstruktów mRNA z dwoma kodonami inicjacyjnymi AUG, czyli P1-Np53-Luc i P0-Np53-Luc, rozróżnienie białek powstających z kodonu AUG1 i AUG2 za pomocą pomiaru aktywności lucyferazy było niemożliwe. Z tego powodu, aktywność translacyjna kodonów AUG1 i AUG2 podawana jest sumarycznie (warianty C i D). Wydłużenie mRNA P1-Np53-Luc o region P0-P1 zredukowało ilość powstającego białka 2-krotnie w komórkach HeLa i 3-krotnie w komórkach MCF-7 (oznaczone jako C i D). Najniższą wydajność translacyjną wykazywały mRNA zawierające intron 2 w obrębie regionu terminalnego 5′ (warianty E i F). Ilość syntetyzowanej lucyferazy w komórkach HeLa wynosiła około 10%, w stosunku do ilości białka powstającego z kontrolnego mRNA. Natomiast w komórkach MCF-7 obecność intronu 2 obniżała poziom białka lucyferazy do 6% powstającego z mRNA P1-Np53(int2)-Luc i do 20% w przypadku mRNA P0-Np53(int2)-Luc.

3.2.4. Analiza struktury drugorzędowej regionu terminalnego 5′ mRNA p53 w modelowym