Oligonukleotydy antysensowe typu 2′-O-metylo i gapmer działają według dwóch różnych

z kodonów AUG1 i AUG2 w lizacie z króliczych retykulocytów

Wyróżnia się dwa główne mechanizmy inhibicji translacji za pomocą oligonukleotydów antysensowych [205; 206]. Pierwszy z nich polega na degradacji docelowego mRNA przez RNazę H. Natomiast drugi zakłada, że przyłączony do mRNA oligonukleotyd antysensowy stanowi zawadę przestrzenną dla rybosomu. Oba mechanizmy wykorzystałam w celu modulacji translacji inicjowanej z kodonów AUG1 i AUG2. Zastosowałam oligomery nr 1 i nr 7b indukujące cięcia RNazą H i zaprojektowałam ich warianty w formie gapmerów LNA. Stosowałam również warianty obu oligomerów w formie 2′-O-metylowanej, tak aby nie aktywowały RNazy H, a stanowiły zawadę steryczną dla rybosomu, bądź indukowały takie zmiany strukturalne w regionie terminalnym 5′ mRNA p53, które mogłyby zaburzać tworzenie kompleksu inicjacyjnego.

Oligomer nr 7b typu gapmer indukował cięcia RNazą H w tych samych pozycjach co jego niemodyfikowany odpowiednik. Jest to spowodowane obecnością wewnętrznej sekwencji o długości 15 nukleotydów. Wcześniejsze prace pokazały, że oligonukleotydy antysensowe typu gapmer posiadające co najmniej 6-8 nukleotydową sekwencję wewnętrzną, są zdolne do aktywowania RNazy H [192; 207]. Aczkolwiek cięcia były słabsze niż w reakcji z oligomerem niemodyfikowanym (Rys. 55). Jest to dość zaskakujące, ponieważ oligomery typu gapmer posiadające na swoich końcach oligonukleotydy typu LNA najefektywniej indukowały cięcia za pomocą RNazy H [207]. W związku z tym, że oligomer nr 7b typu gapmer indukuje cięcia w tych samych pozycjach co wariant niemodyfikowany, można było spodziewać się podobnego efektu na translację inicjowaną z kodonów AUG1 i AUG2. Jednakże, oligomer nr 7b typu gapmer inhibował translację zarówno z kodonu AUG1 jak i AUG2 (Rys. 59). Inhibicja translacji z kodonu AUG1 jest następstwem cięć indukowanych w regionie A217-G226, gdyż wówczas usuwana jest spinka G56-C169 zawierająca kodon inicjacyjny AUG1. Jednakże, mimo skrócenia regionu terminalnego 5′, kompleks rybosomalny nie inicjował translacji wydajniej z kodonu AUG2, tak jak miało to miejsce w przypadku niemodyfikowanego oligomeru nr 7b. Przypuszczalnie, osłabienie translacji z kodonu AUG2 może mieć związek z utratą odpowiedniej struktury drugorzędowej regionu terminalnego 5′ mRNA p53, w obrębie którego postuluje się występowanie elementu IRES [11]. Przeprowadzone wcześniej badania wskazują, że translacja inicjowana z kodonu AUG2 jest raczej niezależna od kapu na końcu 5′ mRNA i prawdopodobnie zachodzi według

156 mechanizmu wewnętrznej inicjacji [151; 185]. Innym wytłumaczeniem zahamowania syntezy białka z kodonu AUG2 pod wpływem oligomeru nr 7b typu gamper, może być jego zwiększone powinowactwo do mRNA, dzięki występowaniu modyfikacji typu LNA. Wykazano, że obecność nukleotydów typu LNA zwiększa temperaturę topnienia heterodupleksu DNA-RNA [208]. W przypadku oligomerów posiadających na obu końcach trzy nukleotydy typu LNA, temperatura topnienia wzrasta o 1,5 - 2,7˚C na każdy modyfikowany nukleotyd [207]. Istnieje zatem możliwość, że pomimo indukowania cięcia przez RNazę H, gapmer nr 7b pozostaje związany z mRNA i stanowi przeszkodę dla rybosomu. Efekt zawady przestrzennej obserwowano także w przypadku gapmerów komplementarnych do regionu TAR wirusa HIV, chociaż zawierały one na przemian nukleotydy niemodyfikowane i typu LNA (tzw. miksmery DNA/LNA) [209].

Z kolei oligomer nr 1 typu gapmer, który podobnie jak jego niemodyfikowany wariant obniżał poziom białek powstających z kodonów AUG1 i AUG2, nie indukował cięć w obrębie miejsca hybrydyzacji (reszty C50-G68) (Rys. 59 i 55). Jest to dość niespodziewany efekt, ponieważ oligomer ten spełnia wszystkie warunki aby skutecznie aktywować RNazę H. W przypadku obu oligomerów, cięcia pojawiły się w regionie A151-G161, czyli po przeciwnej stronie spinki G56-C169. Było to tym bardziej zaskakujące, ponieważ komercyjnie dostępna RNaza H z E.coli, której aktywność jest zbliżona do RNazy H występującej w RRL, trawiła mRNA P1-Np53-Luc w obrębie heterodupleksu (Rys. 56). Aczkolwiek, w reakcji z gapmerem widoczne jest przesunięcie cięć w kierunku 3′ o trzy nukleotydy oraz silniejsze cięcie drugorzędowe. Może to wskazywać na nieco odmienne miejsce hybrydyzacji gapmeru lub mechanizm działania RNazy H, w porównaniu do niemodyfikowanego oligomeru. Ponadto, RNaza H z E.coli nie generowała cięć w regionie A151-G161, tak jak miało to miejsce w lizacie. Sugeruje to, że cięcia po stronie 3′ spinki G56-C169 nie są wynikiem przyłączenia oligomerów nr 1 i cięcia przez RNazę H. Dodatkowo obserwowano cięcia w tym regionie w obecności oligomeru nr 1 typu 2′-O-metylo, który nie posiada zdolności do aktywowania RNazy H (Rys. 55). W związku z powyższym istnieje możliwość, że wiązanie gapmeru nr 1 i nr 1 2′OMe do nukleotydów C50-A68 chroni ten region przed autodegradacją, o czym świadczy brak prążka w pozycji U52 w RRL w obecności obu oligomerów. Z drugiej strony, hybrydyzacja oligomerów nr 1 prowadzi do częściowego rozplatania spinki G56-C169 u jej podstawy, co w konsekwencji czyni region po jej stronie 3′ bardziej podatnym na autodegradację lub dostępnym dla działania innych rybonukleaz obecnych w RRL. Przemawia za tym

157 również fakt, że cięcia w pozycjach A151-G161 pojawiają się tylko w RRL oraz są obecne w linii z oligomerem nr 1 2′OMe, który nie aktywuje RNazy H.

Pomimo inhibującego wpływu gamperów nr 1 i nr 7b na translację inicjowaną z kodonów AUG1 i AUG2 nie można jednoznacznie określić mechanizmu ich działania na podstawie doświadczeń przeprowadzonych w RRL. Co więcej, również gampery kontrolne, które nie były komplementarne do mRNA P1-Np53-Luc, prowadziły do obniżenia poziomu syntetyzowanych białek (Rys. 59). Być może środowisko lizatu, obecność mRNA P1-Np53-Luc jako jedynej matrycy w reakcji translacji in vitro oraz nukleotydów typu LNA na obu końcach gapmerów umożliwiają ich wiązanie do mRNA na zasadzie częściowej komplementarności.

Wcześniejsze badania pokazały, że translacja z kodonu AUG1 inicjowana jest z udziałem kapu na końcu 5′ mRNA P1-Np53-Luc (Rys. 26). Ze względu na wiązanie się oligomeru nr 1 2′OMe blisko końca 5′ mRNA, może on utrudniać identyfikację kodonu AUG1 przez kompleks rybosomalny, czego wynikiem może być obniżona ilość białka powstającego od tego kodonu. Jednak bardziej prawdopodobne wydaje się, że za efekt inhibicji translacji odpowiadają niespecyficzne cięcia w pozycjach A153 i G161 czyli po drugiej stronie spinki G56-C169, obecne w liniach ze wszystkimi wariantami oligomeru nr 1 (Rys. 55). Jak już wcześniej wspomniałam, przypuszczalnie cięcia te mogą być wynikiem przyłączenia oligomeru nr 1 2′OMe do przeciwnej strony spinki G56-C169, co w konsekwencji prowadzi do autodegradacji RNA lub działania innych RNaz obecnych w RRL i odcinania spinki wraz z kodonem AUG1. Z kolei niecałkowita inhibicja translacji, może być spowodowana ochronnym działaniem oligomeru nr 1 2′OMe w regionie C50-G68, a przez to na spinkę G56-C169. Zmiany struktury drugorzędowej regionu terminalnego 5′ mRNA p53 spowodowane wiązaniem oligomeru nr 1 2′OMe do spinki G56-C169, mogą mieć wpływ na wiązanie kompleksu rybosomalnego do elementu IRES znajdującego się w jego obrębie. Ponieważ translacja z kodonu AUG2 inicjowana jest prawdopodobnie z wykorzystaniem elementu IRES, wszelkie zmiany struktury mogą odpowiadać za spadek syntezy białka z tego kodonu.

Metylowany oligomer nr 7b, w przeciwieństwie do wariantu niemodyfikowanego i typu gapmer hamował translację jedynie z kodonu AUG2 (Rys. 58). Na podstawie cięć RNazą H w RRL można stwierdzić, że wariant oligomeru typu 2′OMe pełni podczas translacji rolę zawady przestrzennej (Rys. 55). Ponieważ translacja z kodonu AUG2

158 inicjowana jest z wykorzystaniem elementu IRES, to przyłączenie oligomeru nr 7b 2′OMe do regionu terminalnego 5′ mRNA p53 może utrudniać oddziaływanie z rybosomem, co ostatecznie prowadzi do zahamowania translacji z tego kodonu (Rys. 57 i 58). Z kolei translacja z kodonu AUG1 inicjowana jest prawdopodobnie według mechanizmu skaningowego. Ponieważ oligomer nr 7b hybrydyzuje do mRNA poniżej kodonu AUG1, kompleks incicjacyjny może bez przeszkód związać się z mRNA i rozpocząć syntezę białka z kodonu AUG1. Następnie, po napotkaniu na heterodupleks rozplata go dzięki swojej aktywności helikazowej, dzięki czemu poziom białka z kodonu AUG1 nie zmienia się w porównaniu z reakcją kontrolną.

3.5.4. Oligonukleotydy antysensowe typu gapmer i 2’-O-metylo, które hybrydyzują