Inicjacja translacji z kodonu AUG2 wykazuje cechy inicjacji wewnętrznej

W reakcji translacji in vitro z modelowych mRNA P1-Np53-Luc i P0-Np53-Luc syntetyzowane było również białko reporterowe z kodonu AUG2 dla izoformy Np53, czego dowodem jest wolniej migrujący prążek w żelu (Rys. 22, warianty C i D).

106 Jednak w porównaniu z ilością białka powstającego z kodonu AUG1, wydajność inicjacji z kodonu AUG2 była 3- i 9-krotnie niższa (odpowiednio, dla niekapowanego i kapowanego mRNA), w przypadku zarówno mRNA P1-Np53-Luc jak i P0-Np53-Luc. Podobny wynik otrzymano dla pełnej długości mRNA p53 posiadającego kap na końcu 5′, z którego w reakcji translacji in vitro białka p53 i Np53 syntetyzowane były w stosunku 5:1 [151]. Sugeruje to, że również in vivo synteza izoformy Np53 z alternatywnego kodonu AUG2 w dojrzałym mRNA p53 zachodzi z mniejszą wydajnością niż pełnej długości białka p53. Potwierdza to także analiza poziomu białka p53 i Np53 w różnych liniach komórkowych [143].

Translacja z alternatywnych kodonów inicjacyjnych jest zazwyczaj procesem o mniejszej wydajności i może ona zachodzić na drodze reinicjacji, skaningu przeciekowego lub wewnętrznej inicjacji. Mechanizm reinicjacji polega na wznowieniu translacji z alternatywnego kodonu inicjacyjnego, po zakończeniu translacji krótkiej otwartej ramki odczytu położonej bliżej końca 5′ mRNA. Zatem, jeżeli izoforma Np53 miałaby powstawać według tego mechanizmu, kodon AUG2 musiałby być poprzedzony kodonem STOP, który wraz z kodonem AUG1 tworzyłby krótką otwartą ramkę odczytu. Sytuacja taka ma miejsce jedynie w przypadku transkryptu p53, w którym na skutek alternatywnego składania został zachowany intron 2. Tak więc, w przypadku dojrzałego mRNA p53 oraz modelowych mRNA P1-Np53-Luc i P0-Np53-Luc, które pozbawione są intronu 2 translacja z kodonu AUG2 może być inicjowana według mechanizmu kap-zależnego skaningu przeciekowego lub wewnętrznej inicjacji z wykorzystaniem elementu IRES.

Skaning przeciekowy polega na pominięciu przez kompleks rybosomalny kodonu inicjacyjnego znajdującego się bliżej końca 5′ mRNA, ze względu na jego umiejscowienie w słabym kontekście Kozak i inicjacji syntezy białka z kolejnego kodonu START. Kodon AUG1 jest zlokalizowany w obrębie sekwencji GCCAUGG, która odpowiada optymalnemu kontekstowi Kozak i jest raczej mało prawdopodobne aby był on pomijany przez skanujący kompleks inicjacyjny. Pomijanie kodonu AUG1 skutkowałoby spadkiem syntezy z tego kodonu oraz wiązałoby się ze wzrostem translacji z kodonu AUG2, do którego docierałaby większość kompleksów rybosomalnych. Taka zależność ma miejsce w przypadku białka p47 i białka p43 [57]. Ponieważ kodon AUG dla białka p47 umiejscowiony jest bliżej końca 5′ i znajduje się on w słabym kontekście Kozak, to większość kompleksów rybosomalnych inicjuje translację z położonego dalej w kierunku 3′ kodonu AUG dla białka p43, dzięki czemu ilość białka p43 jest o około 90% większa niż p47. Otrzymane przeze mnie

107 wyniki translacji in vitro, zarówno z mRNA P1-Np53-Luc jak i P0-Np53-Luc pokazują, że translacja z kodonu AUG1 jest inicjowana wydajniej niż z kodonu AUG2, co raczej wyklucza mechanizm skaningu przeciekowego (Rys. 22). Ponadto kodon AUG1 jest umiejscowiony w obrębie stabilnej termodynamicznie spinki G56-C169 (Rys. 32 i 33D). Wykazano wcześniej, że stabilne termodynamicznie motywy strukturalne położone poniżej kodonu inicjacyjnego spowalniają migrację rybosomu, co z kolei wpływa na dokładniejsze rozpoznanie kodonu inicjacyjnego oraz wydajniejszą syntezę białka [7].

Wydaje się, że mechanizmem, który odpowiada za syntezę izoformy Np53 jest wewnętrzna inicjacja translacji. Dowodem na to jest brak wpływu kapu na końcu 5′ mRNA P1-Np53-Luc na poziom białka syntetyzowanego z kodonu AUG2, podczas gdy dodanie kapu do końca 5′ skutkowało stymulacją translacji z kodonu AUG1 (Rys. 22, wariant C). Co więcej, obecność kapu na końcu 5′ mRNA P0-Np53-Luc hamowała translację inicjowaną z kodonu AUG2. Obserwacje te przeczą translacji według mechanizmu skaningu przeciekowego, ponieważ jest to mechanizm kap-zależny, w związku z czym obecność kapu powinna stymulować nie tylko translację z kodonu AUG1 ale i z kodonu AUG2.

Na udział elementu IRES w syntezie izoformy Np53 wskazuje również analiza wyników translacji in vitro z mRNA P1-Np53-Luc w obecności wolnego analogu kapu (Rys. 26). Translacja z kodonu AUG2 zachodziła pomimo zahamowania kap-zależnego procesu, na skutek związania czynnika eIF4E przez wolny analog kapu. Co więcej, wolny analog kapu w stężeniu 25 M powodował nawet 10% wzrost wydajności translacji. Oznacza to, że translacja z kodonu AUG2 może przebiegać bez udziału czynnika eIF4E. Według wcześniejszych doniesień, przy niskim stężeniu wolnego analogu kapu dochodziło również do wzrostu poziomu białka reporterowego, którego translacja zachodziła pod kontrolą regionu 5′UTR mRNA prekursora amyloidu APP oraz opóźnienia umysłowego zespołu łamliwego chromosomu X, FMRP [166; 167]. Dalsze zwiększanie stężenia wolnego analogu kapu do 100 M prowadziło do obniżenia wydajności translacji w obu przypadkach, aczkolwiek poziom białka był porównywalny z poziomem obserwowanym przy braku wolnego analogu kapu w reakcji. Wskazuje to na udział elementów IRES w syntezie białek APP i FMRP. Początkowy efekt stymulacji translacji autorzy tłumaczą współzawodnictwem o czynniki inicjacyjne pomiędzy kap- i IRES-zależnym procesem inicjacji. Z kolei, w przypadku mRNA P1-Np53-Luc wolny analog kapu o stężeniu 100 M stymulował translację z kodonu AUG2. Dopiero 750 M stężenie wolnego analogu kapu

108 inhibowało translację białka reporterowego powstającego z kodonu AUG2 o 50%. Mając na uwadze efekt inhibicji translacji z kodonu AUG1 pod wpływem wolnego analogu kapu, opisany w poprzednim rozdziale można sądzić, że translacja z kodonu AUG2 zachodzi również według mechanizmu zależnego od kapu. Należy jednak wziąć pod uwagę fakt, że inne grupy badawcze nie stosowały aż tak wysokiego stężenia wolnego analogu kapu. Kolejna różnica polegała na tym, że regiony 5′UTR mRNA APP i FMRP zawierały tylko jeden kodon AUG, w związku z tym wszystkie czynniki inicjacyjne oraz podjednostki rybosomalne wykorzystywane były do syntezy jednego białka. W przypadku mRNA P1-Np53-Luc translacja inicjowana jest z dwóch kodonów AUG1 i AUG2 i można przypuszczać, że spadek wydajności translacji z kodonu AUG2 przy najwyższym stężeniu wolnego analogu kapu wynika ze współzawodnictwa o czynniki translacyjne pomiędzy inicjacją z kodonu AUG1 i AUG2. To z kolei może prowadzić do wyczerpania lub ograniczenia dostępności składników maszynerii translacyjnej dla inicjacji z kodonu AUG2. Na podstawie opisanych powyżej wyników można stwierdzić, że w warunkach uniemożliwiających syntezę białka z udziałem kapu, translacja z kodonu AUG2 dla izoformy Np53 zachodzi najprawdopodobniej dzięki występowaniu elementu IRES w regionie terminalnym 5′ mRNA p53.

Na możliwość tworzenia się kompleksów rybosomalnych w obrębie AUG2 bez udziału kapu, wskazuje także obecność charakterystycznego „odcisku palca” na autoradiogramie, przedstawiającym produkty reakcji inhibicji odwrotnej transkrypcji w RRL w obecności wysokiego stężenia wolnego analogu kapu (Rys. 39). Przy takim samym stężeniu analogu kapu dochodziło do zaniku „odcisku palca” dla kodonu AUG1, z którego inicjacja w dużym stopniu zależy od kapu na końcu 5′ mRNA (Rys. 40). Co więcej, prążki odpowiadające „odciskowi palca” w reakcjach z inhibitorami kompleksów rybosomalnych obserwowałam także w reakcji kontrolnej (Rys. 39). Pokazuje to, że do zatrzymania kompleksów rybosomalnych w obrębie kodonu AUG2 dochodzi już bez udziału cykloheksimidu i GMP-PNP. Prawdopodobnie, w przypadku kodonu AUG2 struktura drugorzędowa regionu terminalnego 5′ mRNA p53 umożliwia bezpośrednie utworzenie kompleksu inicjacyjnego bez konieczności wcześniejszego oddziaływania z 5′ kapem. Wyniki te są zgodne z danymi literaturowymi, ponieważ w przypadku elementów IRES wirusa EMCV czy CrPV, pomimo zastosowania wysokiego stężenia wolnego analogu kapu również nie dochodziło do zaniku „odcisku palca” oraz był on także obecny w reakcji kontrolnej, bez dodatku inhibitorów kompleksów rybosomalnych [170; 171].

109 Do zaniku „odcisku palca” charakterystycznego dla kodonu AUG2 dochodziło dopiero w wysokim stężeniu jonów magnezu (Rys. 39). Wcześniejsze badania pokazały, że wysokie stężenie jonów magnezu wpływa na strukturę 18S rRNA i zaburza formowanie kompleksu inicjacyjnego [172]. W takich warunkach, w reakcji inhibicji odwrotnej transkrypcji w RRL dochodziło do zaniku „odcisku palca” dla kodonu AUG w RNA wirusa EMCV, z którego translacja inicjowana jest w sposób zależny od IRES [170]. Podsumowując, można stwierdzić, że translacja z kodonu AUG2 w dużej mierze wykazuje charakter niezależny od kapu. Jednocześnie można wykluczyć skaning przeciekowy jako mechanizm inicjacji translacji z tego kodonu, ponieważ zależy on od związania kompleksu inicjacyjnego z kapem na końcu 5′ mRNA, co w reakcji inhibicji odwrotnej transkrypcji w RRL prowadzonej w obecności wolnego analogu kapu powinno objawiać się przede wszystkim zanikiem „odcisku palca”.

Dodatkowych informacji na temat mechanizmu inicjacji translacji z kodonu AUG2 dostarczyły doświadczenia z mRNA P1-Np53-Luc, który na końcu 5′ posiadał niezdolny do oddziaływania z czynnikiem eIF4E analog kapu ApppG (Rys. 28). Obserwowany 25% wzrost poziomu syntetyzowanego białka reporterowego z kodonu AUG2, wskazuje kolejny raz na niezależną od kapu drogę inicjacji translacji. Gdyby translacja z kodonu AUG2 miała zachodzić z udziałem kapu, wówczas inhibicji translacji z kodonu AUG1 towarzyszyłby również spadek poziomu białka syntetyzowanego z kodonu AUG2. Do równoczesnej stymulacji translacji z kodonu AUG2 i inhibicji z kodonu AUG1, dochodziło w reakcji translacji modelowego mRNA Hp53-554 [151]. W tym przypadku, kap-zależna translacja z kodonu AUG1 była hamowana przez obecność stabilnej termodynamicznie spinki, wprowadzonej blisko końca 5′ mRNA. Brak inhibującego wpływu spinki na syntezę rozpoczynającą się z kodonu AUG2, wskazywał na mechanizm zależny od elementu IRES. Jak wykazano wcześniej, mRNA posiadające elementy IRES ulegają wydajnej translacji in vivo, nawet gdy na ich końcu 5′ znajduje się niefunkcjonalny analog kapu. Na przykład, translacja modelowego mRNA składającego się z regionu 5′UTR mRNA prekursora amyloidu APP oraz sekwencji kodującej białko reporterowe lucyferazy, zachodziła z 3-krotnie większą wydajnością gdy kap na końcu 5′ zastąpiono niefunkcjonalnym analogiem ApppG [166]. Również translacja szeregu komórkowych mRNA, w których postulowano obecność elementów IRES, zachodziła wydajniej pomimo ograniczenia kap-zależnego procesu za pomocą analogu kapu ApppG [169].

110

3.3.1.3. Obecność ogonu poli(A) nie wpływa stymulująco na translację w lizacie z króliczych