Wpływ regionu terminalnego 5′ mRNA p53 z zachowanym intronem 2 na wydajność

Oprócz w pełni dojrzałego mRNA p53, w kilku liniach komórek ludzkich zidentyfikowano również transkrypt p53(EII), w którym na skutek alternatywnego składania pre-mRNA p53 został zachowany intron 2 [13]. Analiza PCR w czasie rzeczywistym pokazała, że ilość transkryptu zawierającego intron 2 jest w komórkach dużo niższa, w porównaniu z ilością dojrzałego mRNA p53. Ponadto wykazano, że transkrypt p53(EII) związany był z polirybosomami co oznacza, że może powstawać z niego białko. Ponieważ w intronie 2 znajduje się kodon terminacyjny UGA zgodny z ramką odczytu dla białka p53 oraz poprzedza on kodon AUG2, to z takiego mRNA może powstawać jedynie izoforma Np53. Zaproponowany został mechanizm generowania izoformy Np53 z transkryptu z zachowanym intronem 2, według którego po zsyntetyzowaniu 25-aminokwasowego peptydu z kodonu AUG1, wznawiany był proces translacji z kodonu AUG2 (Rys. 20). W celu określenia wydajności translacyjnej regionu terminalnego 5' zawierającego intron 2, przeprowadziłam reakcję translacji in vitro w RRL z wykorzystaniem modelowych mRNA P1-Np53(int2)-Luc oraz P0-Np53(int2)-Luc (Rys. 22, warianty E i F). Z obu mRNA powstawało jedynie białko reporterowe, którego translacja inicjowana była z kodonu AUG2. W porównaniu z mRNA kontrolnym, poziom białka syntetyzowanego z mRNA zawierających intron 2 wynosił około 1%. Podobna ilość białka generowana była z kodonu AUG2 z mRNA P1-Np53-Luc i P0-Np53-Luc, nie zawierających intronu 2.

3.2.1.2.1. Aktywność translacyjna kodonu AUG1 w mRNA ze zmutowanym kodonem STOP w intronie 2

Aby sprawdzić, czy kodon AUG1 w transkryptach z intronem 2 jest również aktywny translacyjnie i inicjowana jest z niego synteza 25-aminokwasowego peptydu, postanowiłam zmutować kodon terminacyjny znajdujący w obrębie intronu 2. Na drodze ukierunkowanej

mutagenezy konstruktów dsDNA P1-Np53(int2)-Luc oraz P0-Np53(int2)-Luc,

uzyskałam pochodne konstrukty P1-Np53(int2-mut)-Luc oraz P0-Np53(int2-mut)-Luc, w których kodon UGA zastąpiony był kodonem GCG, kodującym alaninę (Rys. 23). Następnie w reakcji transkrypcji in vitro otrzymałam mRNA ze zmutowanym kodonem STOP, które różniły się obecnością kapu na końcu 5′. W reakcjach kontrolnych wykorzystałam mRNA z niezmutowanym kodonem terminacyjnym oraz mRNA, które nie zawierały intronu 2.

69 W reakcjach translacji in vitro z wykorzystaniem mRNA posiadających mutację UGA/GCG, oprócz białka lucyferazy powstawał produkt białkowy reprezentowany przez wolniej migrujący prążek w żelu. Wolniejsza migracja tego produktu, w porównaniu z białkiem fuzyjnym syntetyzowanym z mRNA bez intronu 2 (mRNA P1-Np53-Luc), dowodzi że translacja inicjowana jest z kodonu AUG1. Na skutek zastąpienia kodonu UGA kodonem GCG, nie dochodziło do terminacji translacji, wobec czego proces inicjowany z kodonu AUG1 był kontynuowany do momentu napotkania kodonu STOP na końcu mRNA. W konsekwencji, białko było dłuższe o fragment odpowiadający sekwencji kodującej intron 2.

Rys. 23 Efekt mutacji kodonu STOP znajdującego się w obrębie intronu 2 na poziom translacji in vitro inicjowanej z kodonu AUG2. W konstruktach P1-Np53(int2)-Luc i P0-Np53(int2)-Luc kodon STOP UGA zastąpiono kodonem GCG. Autoradiogramy przedstawiają poziom syntezy białek inicjowanej z kodonów AUG1 i AUG2.

70 W przypadku mRNA P1-Np53(int2-mut)-Luc nie posiadającego kapu na końcu 5′, oba białka były syntetyzowane w stosunku 1:1. Jednakże, brak kodonu STOP i związana z tym translacja z kodonu AUG1, nieznacznie obniżyły poziom białka z kodonu AUG2 z 4,0 do 2,6 (wartości znormalizowane w stosunku do translacji kontrolnego mRNA Luc). Z kolei, obecność analogu kapu na końcu 5' spowodowała wzrost efektywności translacji z kodonu AUG1, czemu towarzyszył silny spadek syntezy białka z kodonu AUG2 do poziomu 0,9. Ilość białka powstającego z kodonu AUG2 była mniejsza również w przypadku kapowanego mRNA P1-Np53(int2)-Luc. Sugeruje to, że również w tych konstruktach kodon AUG1 jest aktywny translacyjnie. Podobne wyniki otrzymałam dla konstruktu P0-Np53(int2-mut)-Luc. Tak jak poprzednio, z mRNA nie posiadającego kapu na końcu 5' ilość powstających białek z kodonów AUG1 i AUG2 była taka sama. Natomiast dodanie kapu do mRNA doprowadziło do stymulacji translacji z kodonu AUG1 oraz drastycznie obniżyło poziom białka z kodonu AUG2. Sugeruje to, że translacja z modelowych mRNA zawierających intron 2 jest inicjowana z obu kodonów AUG1 i AUG2 według mechanizmu zależnego od kapu na ich końcu 5′.

Wydłużenie mRNA P1-Np53(int2-mut)-Luc o region P0-P1 nie wpływało na poziom translacji z mRNA bez kapu na końcu 5'. Podobny wynik otrzymałam dla mRNA

P1-Np53(int2)-Luc i P0-Np53(int2)-Luc. Inhibujący wpływ regionu P0-P1

zaobserwowałam jedynie dla mRNA P0-Np53(int2)-Luc, lecz dopiero wtedy gdy matrycę w reakcji translacji stanowił mRNA z kapem na końcu 5′. Zmniejszoną ilość białka

obserwowano tylko w przypadku translacji inicjowanej z kodonu AUG1.

Sugeruje to, że struktura drugorzędowa regionu P0-P1 może utrudniać proces skanowania mRNA przez rybosom, w poszukiwaniu tego kodonu inicjacyjnego.

3.2.1.2.2. Rola uORF w wariancie regionu terminalnego 5′ mRNA p53 z zachowanym intronem 2, w inicjacji translacji z kodonu AUG2

Regiony terminalne 5′ niektórych mRNA zawierają dodatkowe kodony AUG, które mogą tworzyć krótkie otwarte ramki odczytu tzw. uORF (ang. upstream open reading frames) powyżej głównej ramki odczytu. Obecność uORF jest charakterystyczna dla frakcji mRNA posiadających długie regiony terminalne 5′ oraz sekwencje intronowe, zachowane w wyniku alternatywnego składania pre-mRNA [145]. Analiza transkryptomu ujawniła, że około 30-40% wszystkich mRNA posiada uORF, które poprzedzają główną ramkę odczytu [146; 147].Gdy znajdują się one blisko końca 5′ mRNA, uczestniczą w tzw. mechanizmie

71 reinicjacji translacji, który polega na syntezie peptydu kodowanego przez uORF, a następnie pełnej długości białka, ze znajdującej się poniżej w sekwencji mRNA głównej ramki odczytu. Uważa się, że rola uORF polega na hamowaniu translacji białka pełnej długości. Ghosh i współpracownicy [13] opisali alternatywny mechanizm powstawania

izoformy Np53 z transkryptu p53(EII) z zachowanym intronem 2.

Zakłada on, że po syntezie krótkiego peptydu i oddysocjowaniu dużej podjednostki rybosomalnej w obrębie kodonu STOP, który znajduje się w intronie 2, mała podjednostka rybosomalna pozostaje związana z mRNA i translacja reinicjowana jest z kolejnego kodonu inicjacyjnego AUG2 (Rys. 6).

Wcześniejsze doświadczenia z mRNA ze zmutowanym kodonem terminacyjnym pokazały, że kodon AUG1 jest aktywny translacyjnie. Postanowiłam zatem sprawdzić czy w wyniku translacji inicjowanej z kodonu AUG1 może obniżać się poziom białka, powstającego z kodonu AUG2. W tym celu kodon inicjacyjny AUG1 w mRNA

P1-Np53(int2)-Luc oraz P1-Np53(int2-mut)-Luc zastępowałam kodonem GCA

dla alaniny. Na rysunku 24 schematycznie przedstawione są matrycowe mRNA, które testowałam w reakcji translacji w RRL.

Rys. 24 Translacja in vitro mRNA P1-Np53(int2)-Luc ze zmutowanym kodonem AUG1. W reakcjach kontrolnych translacji poddano również mRNA niezmutowany, P1-Np53(int2)-Luc oraz mRNA z mutacją kodonu STOP, a także mRNA zawierający oba zmutowane kodony AUG1 i STOP.

72 W reakcjach, w których translacji ulegały mRNA z mutacją AUG1/GCA syntetyzowane było tylko białko lucyferazy z kodonu AUG2, o czym świadczy brak górnego prążka na autoradiogramie, który był obecny w reakcji translacji mRNA P1-Np53(int2-mut)-Luc ze zmutowanym kodonem STOP. W przypadku niezmutowanego mRNA P1-Np53(int2)-Luc, syntetyzowane było również tylko białko lucyferazy. W przypadku obu wariantów ze zmutowanym kodonem AUG1, ilość białka powstającego z kodonu AUG2 wzrosła w porównaniu z mRNA P1-Np53(int2)-Luc oraz mRNA P1-Np53(int2-mut)-Luc. Sugeruje to, że translacja uORF, kodującej 25-aminokwasowy peptyd ma wpływ na poziom białka lucyferazy syntetyzowanej z kodonu AUG2.

3.2.2. Translacja inicjowana z kodonów AUG1 i AUG2 w modelowym mRNA P1-Np53-Luc