Koncepcja i realizacja badań

Aktualne badania, ukierunkowane na identyfikację nowych klas chemioterapeutyków, skutecznych w hamowaniu progresji raka jajnika koncentrują się głównie wokół możliwości ograniczania procesu neowaskularyzacji guza i/lub modulowania ścieżek sygnałowych, zaangażowanych w ten i inne elementy postępu choroby [119]. Z punktu widzenia współczesnej wiedzy o roli mikrośrodowiska tkankowego w rozwoju nowotworów i możliwości ich leczenia [255-257] można stwierdzić, że nieco niedocenianym elementem ekspansji komórek nowotworowych, w kontekście wykorzystania terapeutycznego, jest proces starzenia się komórek prawidłowych [258;259]. Jak wykazały badania przeprowadzone na modelach komórkowych i zwierzęcych, komórki stare, które gromadzą się w tkankach w miarę starzenia się organizmu [260], mogą aktywnie przyczyniać się do nasilenia rozwoju zmian nowotworowych [261;262]. W związku z tym, zasadnym wydaje się pytanie, czy alternatywnym sposobem ograniczenia postępu choroby nowotworowej może być stosowanie związków chemicznych, znanych ze swego działania przeciwstarzeniowego. Bezpośrednia odpowiedź na to pytanie jest jednak trudna, co wynika przede wszystkim z tego, iż pomimo dużego postępu wiedzy w zakresie molekularnych mechanizmów starzenia, dotychczasowe sukcesy w zakresie opóźnienia tempa tego procesu pod wpływem określonych substancji chemicznych dotyczyły niemal wyłącznie układów eksperymentalnych in vitro [246;263]. Wyjątkiem od tej reguły jest resweratrol, który prócz zwiększania możliwej do osiągnięcia przez komórki liczby podziałów (tzw. limitu

Hayflicka) [189-191], okazał się także zwiększać średnią długość życia wielu organizmów

modelowych [180-182]. Co nie mniej istotne, związek ten wykazuje także kilka innych działań, będących wysoce pożądanymi z punktu widzenia zmian zachodzących w starzejącym się organizmie, tj. działanie kardioprotekcyjne [136], neuroprotekcyjne [151] i przeciwzapalne [144]. Ostatnim, a zarazem kluczowym argumentem świadczącym o potencjale terapeutycznym resweratrolu jest jego zdolność do ograniczania postępu choroby nowotworowej, na praktycznie każdym z jej etapów [158]. Pomimo tych walorów, wykorzystanie resweratrolu w praktyce jest ograniczane przez jego niską biodostępność i szybki rozkład do mniej aktywnych metabolitów [196]. Ponadto, jak wykazały niektóre

Angelika Kuczmarska

142

badania, wyraźny przeciwnowotworowy wpływ resweratrolu obserwowany in vitro niekiedy nie idzie w parze z zahamowaniem progresji nowotworu w warunkach in vivo [264].

Fakty te, limitujące wartość terapeutyczną resweratrolu, otworzyły drogę do syntezy i badań aktywności biologicznej różnego typu jego pochodnych [198;219-221;264]. Jak się wkrótce okazało, szereg właściwości biologicznych tych związków był częstokroć dużo silniej wyrażony w porównaniu z ich naturalnym prekursorem [198;224]. W odniesieniu jednak do wiedzy, jaką na dziś dzień dysponujemy na temat resweratrolu, znajomość cech biologicznych i potencjału terapeutycznego jego pochodnych jest bardzo fragmentaryczna.

Niniejsza rozprawa wpisuje się w powyższy nurt badań, gdyż jest próbą kompleksowej oceny działania dwóch syntetycznych, dodatkowo hydroksylowanych analogów resweratrolu, tj. 3,3',4,4'-THS i 3,3',4,4',5,5'-HHS, skierowanego przeciwko komórkom raka jajnika w modelu in vitro. Punktem wyjścia do wykorzystania tych właśnie związków była obserwacja, iż obecność dwóch grup hydroksylowych, odpowiednio w pozycji 4 i 4' pierścienia aromatycznego znacząco zwiększa antyproliferacyjne działanie stilbenów [224]. W dostępnej literaturze można jednak odnaleźć zaledwie kilka prac poświęconych tym analogom, a konkretnie osiem publikacji dotyczących aktywności 3,3',4,4',5,5'-HHS [166;198;218-222;265] i dwie na temat 3,3',4,4'-THS [166;266]. Żadna z tych prac nie porusza jednak kwestii wykorzystania któregoś z tych związków przeciwko komórkom raka jajnika, co z jednej strony czyni niniejsze badania pionierskimi, a z drugiej znacznie utrudnia interpretację uzyskanych wyników.

Pragnąc sprostać postawionym celom stworzono układ eksperymentalny, obejmujący ocenę wpływu 3,3',4,4'-THS i 3,3',4,4',5,5'-HHS na kluczowe wykładniki inwazyjności komórek nowotworowych, wykorzystując jako modele komórkowe trzy komercyjnie dostępne linie komórek raka jajnika (A2780, OVCAR-3, SKOV-3), różniące się pod względem morfologii, dynamiki i charakteru wzrostu oraz reakcji na leki [229;231;232;236-241]. Zastosowanie odrębnych typów komórek rakowych pozwoliło określić, czy uzyskiwane efekty biologiczne mają charakter uniwersalny, czy też są związane ze specyfiką danej linii komórkowej. Jest to istotne także przez wzgląd na doniesienia, mówiące o dużej heterogenności różnego typu komórek raka jajnika, m.in. pod kątem ekspresji kluczowych mediatorów, zaangażowanych w progresję choroby [267].

Ważnym elementem badań było także porównanie efektów wywieranych przez oba syntetyczne stilbeny z działaniem resweratrolu. Aby doszczegółowić charakter reakcji komórek nowotworowych na badane związki przeprowadzono doświadczenia typu

143

"odpowiedź zależna od dawki" (ang. dose-response) i "przebieg reakcji w funkcji czasu" (ang. time-course), stosując w tym celu, odpowiednio, stężenia: 10, 50 i 100 µM oraz czasy ekspozycji: 24, 48 i 72 godziny.

Wybór stężeń związków został dokonany w sposób arbitralny, na podstawie obserwacji krzywych przeżywalności komórek, w ten sposób, aby stosowane dawki z jednej strony gwarantowały istotne obniżenie żywotności komórek w ustalonych interwałach czasowych, a z drugiej strony, aby nie była to cytotoksyczność tak znamienna, by wykluczała możliwość i celowość monitorowania pozostałych wykładników progresji komórek rakowych. Bardzo zbliżone zakresy stężeń stosowane były z powodzeniem w badaniach nad aktywnością analogów resweratrolu, w tym 3,3',4,4',5,5'-HHS przez innych badaczy [218;219].

Dotychczas prowadzone badania nad aktywnością stilbenów obejmowały różne czasy ekspozycji, począwszy od 24 godzin [221], poprzez eksperymenty 72-godzinne [219], kończąc na ekspozycjach ponad tygodniowych [225]. Dość często wykorzystywana była także ocena własciwości komórek poddawanych działaniu stilbenów w trzech interwałach dobowych, tj. po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji [218]. Te same punkty czasowe wykorzystano w niniejszym projekcie, jednak główną przesłanką do ich wyboru była kinetyka rozkładu badanych związków w medium hodowlanym, określona na potrzeby tych i wcześniejszych badań za pomocą metody HPLC [247]. W tym kontekście uwagę zwraca fakt, że resweratrol znacząco przewyższa swoje pochodne pod kątem stabilności, co widać właściwie w każdym z badanych punktów czasowych. W przypadku dwóch syntetycznych stilbenów, 72 godziny ekspozycji stanowiły wartość progową, korespondującą z niemalże całkowitą ich degradacją. Gdyby wynik ten traktować tylko w kategoriach reakcji chemicznej, można by uznać już na tym etapie, że przydatność terapeutyczna syntetycznych stilbenów jest nieporównywalnie mniejsza niż resweratrolu. Takie rozumowanie byłoby jednak zbyt uproszczone, o czym świadczą przeprowadzone w niniejszym projekcie badania wpływu tych związków na różnorakie wykładniki inwazyjności komórek nowotworowych. Jak wykazały bowiem przeprowadzone badania, analogi resweratrolu wielokrotnie charakteryzowały się silniejszym działaniem od swego prekursora, co może sugerować, że kluczowe z punktu widzenia farmakoterapii efekty biologiczne mogły zachodzić pod ich wpływem już w pierwszych godzinach eksperymentu.

Angelika Kuczmarska

144