Proliferacja i starzenie

Wywołanie śmierci komórek nowotworowych, nekrotycznej i/lub apoptotycznej, jest jednym z podstawowych zjawisk wykorzystywanych w klasycznej chemioterapii [278]. Innym, popularnym sposobem ograniczania progresji komórek rakowych jest modulowanie określonych procesów, związanych z ich inwazyjnością, szczególnie aktywności proliferacyjnej [279]. W niniejszej rozprawie zbadano wpływ resweratrolu i jego pochodnych na aktywność podziałową komórek raka jajnika, wykorzystując w tym celu

Angelika Kuczmarska

148

metodę fluorescencyjną, opartą o wyznakowanie komórek sondą CFDA SE. Podstawową obserwacją płynącą z przeprowadzonych badań było to, że wszystkie trzy badane związki wykazują działanie antyproliferacyjne względem komórek raka jajnika, przy czym — jak można było się tego spodziewać na podstawie analizy wcześniejszych parametrów — odnotowywane efekty były w pewnym stopniu zależne od typu komórek poddawanych ekspozycji. W przypadku komórek A2780 najefektywniejsze działanie wykazywał resweratrol, który w trzeciej dobie eksperymentu hamował proliferację komórek przy każdym z użytych stężeń, a efekt ten był zależny od dawki. Działanie resweratrolu rosło także wraz z czasem ekspozycji. W przypadku dwóch pozostałych linii komórkowych, tj. OVCAR-3 i SKOV-3, najwyższą aktywność antyproliferacyjną wykazywał 3,3',4,4'-THS, przy czym różnica w sile działania tego związku i 3,3',4,4',5,5'-HHS była raczej niewielka. Potwierdzeniem antyproliferacyjnego działania stilbenów była cytometryczna ocena odsetka komórek w fazie S cyklu komórkowego (aktywnie replikujacych swoje DNA), której wyniki w pełni korespondowały z danymi uzyskanymi metodą fluorescencyjną. Antyproliferacyjny efekt syntetycznych analogów resweratrolu, szczególnie 3,3',4,4',5,5'-HHS, względem komórek raka jajnika był zgodny z obserwacjami innych autorów, w tym badaniami przeprowadzonymi na komórkach raka jelita grubego [220]. Obniżenie odsetka komórek w fazie S cyklu mitotycznego, obserwowane pod wpływem syntetycznych analogów resweratrolu potwierdzało natomiast wyniki badań przeprowadzonych na komórkach raka piersi, w przypadku których taki sam efekt wywołał syntetyczny stilben posiadający (podobnie jak badane związki) dwie grupy hydroksylowe w pozycjach 4 i 4' [223].

Fakt zahamowania tempa proliferacji komórek nowotworowych pod wpływem badanych związków zrodził pytanie o mechanizm tego zjawiska. Odnosząc się do tego problemu podjęto próbę zweryfikowania hipotezy mówiącej, że ograniczenie aktywności podziałowej może być związane z indukcją procesu starzenia, czyli stanu związanego w trwałym wyjściem komórek z cyklu podziałowego [280]. Dodatkową przesłanką do podjęcia tego kierunku badań było stwierdzenie za pomocą metody cytometrycznej, iż zmniejszeniu frakcji komórek replikujących DNA w fazie S cyklu towarzyszy zazwyczaj jednoczesny wzrost odsetka komórek w fazie G1, będący zjawiskiem typowym dla komórkowego starzenia [281]. Nasilone gromadzenie się komórek w fazie G1 cyklu opisano już wcześniej jako cechę typową dla syntetycznych stilbenów, posiadających dwie grupy hydroksylowe w pozycjach 4 i 4', przy czym podobnie jak w niniejszych badaniach zjawisko to utożasamiano z zatrzymaniem aktywności podziałowej komórek [224].

149

Zainicjowanie procesu starzenia komórkowego, jako sposobu ograniczania proliferacji komórek nowotworowych jest koncepcją relatywnie młodą, gdyż jeszcze do niedawna sądzono, że starzenie się jest zjawiskiem dotyczącym wyłącznie komórek prawidłowych. W ostatnich latach pogląd na tę kwestię zmienił się jednak diametralnie, czego podstawą było wykazanie wzrostu ekspresji biochemicznych markerów starzenia w komórkach nowotworowych, poddawanych działaniu szeregu stosowanych rutynowo leków chemioterapeutycznych [282-284]. Ponieważ efekt ten nie jest jeszcze dostatecznie poznany, a dodatkowo nigdy nie był analizowany w odniesieniu do działania stilbenów, w niniejszej rozprawie oceniono wpływ resweratrolu i jego analogów na aktywność β-galaktozydazy związanej ze starzeniem (SA-β-Gal), tj. enzymu, będącego najpopularniejszym markerem komórek starych [260]. W tym celu wykorzystano metodę fluorescencyjną, która pozwala na określenie zmian aktywności SA-β-Gal w całej populacji, zamiast w pojedynczych komórkach [250]. Za takim wyborem metody przemawiała z jednej strony możliwość skwantyfikowania wyników, a z drugiej to, że wcześniejsze badania śmierci komórkowej i proliferacji także odbywały się na poziomie całych hodowli komórkowych. Przeprowadzone badania pokazały, że antyproliferacyjny efekt stilbenów może być, rzeczywiście, w dużej mierze powodowany aktywacją programu starzenia w komórkach nowotworowych. Przykładem tej współzależności są m.in. komórki raka jajnika A2780, w przypadku których zależne od dawki obniżenie potencjału proliferacyjnego pod wpływem resweratrolu, odnotowane w trzeciej dobie eksperymentu, korespondowało z zależnym od dawki wzrostem aktywności SA-β-Gal w tym samym punkcie czasowym. Tę samą prawidłowość odnotowano dla komórek OVCAR-3 i SKOV-3, w przypadku których najsilniejsze działanie antyproliferacyjne, cechujące 3,3',4,4'-THS, zachodziło z jednoczesnym wzrostem aktywności SA-β-Gal.

Za prawdopodobną przyczynę indukcji starzenia komórek nowotworowych pod wpływem 3,3',4,4'-THS i 3,3',4,4',5,5'-HHS można uznać aktywność RFT, których działaniu przypisuje się także cytostatyczne i proapoptotyczne efekty działania analogów resweratrolu [198;221]. Jak wykazały niniejsze badania, obie syntetyczne pochodne resweratrolu zwiększały produkcję RFT przez komórki raka jajnika, przy czym w komórkach A2780 działanie obu związków miało zbliżoną siłę, w przypadku komórek OVCAR-3 silniejszą indukcję RFT powodował 3,3',4,4',5,5'-HHS, natomiast w przypadku komórek SKOV-3, silniej działającym związkiem był 3,3',4,4'-THS. Nasilenie stresu oksydacyjnego pod

Angelika Kuczmarska

150

wpływem syntetycznych stilbenów jest prawdopodobnie związane z ich budową chemiczną, a konkretnie obecnością dodatkowych grup hydroksylowych w pozycji orto-. Jak wykazały doświadczenia na modelu mikroskomalnym, pochodne orto- mają zdolność formowania cytotoksycznch semichinonów, a przez to stymulowania dodatkowej konsumpcji tlenu. Zachodzi to prawdopodobnie w cyklu oksydoredukcyjnym kosztem równoważników redukcyjnych, przenoszonych przez cytochrom b5, i prowadzi do formowania RFT [198]. Związki te, a w szczególności 3,3',4,4',5,5'-HHS mogą także wzmagać stres oksydacyjny poprzez hamowanie aktywności czynników antyoksydacyjnych, w tym dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy i glutationu zredukowanego [221]. Co ważne, sam resweratrol jest, przynajmniej teoretycznie, pozbawiony tych cech, co jednak wydaje się potwierdzać tylko w przypadku komórek A2780, w których obniżył on produkcję RFT, podobnie jak czynił to w przypadku wielu innych typów komórek i modeli doświadczalnych [285;286]. Niespodziewanie jednak, w przypadku linii OVCAR-3 i SKOV-3 także resweratrol zwiększał produkcję RFT, choć nie była to skala zjawiska tak wysoka, jak w przypadku jego syntetycznych orto-analogów. Można w tym kontekście domniemywać, że prooksydacyjny wpływ resweratrolu może być zjawiskiem komórkowo-specyficznym, zbliżonym w swej naturze to opisanego wcześniej wzbudzenia RFT w komórkach śródbłonka naczyniowego, starzejących się w sposób przedwczesny pod wpływem tego związku [287]. Nie sposób pominąć także faktu, że w przypadku niektórych typów komórek nowotworowych, np. komórek białaczkowych, resweratrol użyty w stężeniach do 50 µM w znaczący sposób nasilał generowanie RFT, co przekładało się w rezultacie na zahamowanie ich żywotności [288].