Wpływ resweratrolu i jego pochodnych na adhezję komórek

Badania adhezji komórek przeprowadzono metodą fluorescencyjną po ich uprzednim wyznakowaniu kalceiną-AM. Celem oddania realiów panujących in vivo, ocenie poddano efektywność adhezji komórek raka jajnika do monowarstwy utworzonej przez LKMO. Wpływ stilbenów na proces adhezji został wyrażony względem grupy kontrolnej, tj. komórek nie poddawanych działaniu badanych związków. Podstawowy, bezwzględny stopień adhezji testowanych linii komórek raka jajnika do LKMO, wyrażony w procentach, został zbadany i opisany w trakcie realizacji wcześniejszych projektów [254].

4.9.1. Komórki A2780

Badania wykazały, że po 24 godzinach inkubacji resweratrol zmniejsza adhezję komórek A2780 do LKMO przy każdym z użytych stężeń. Dla stężenia 10 µM adhezja komórek była niższa o 52 ± 5%, dla stężenia 50 µM o 39 ± 7%, a dla stężenia 100 µM o 54 ± 8%. Podobny efekt wykazywały oba syntetyczne stilbeny, a stopień zahamowania tego zjawiska był w ich przypadku bardzo zbliżony do działania ich naturalnego prekursora (Rycina 29A).

W wyniku inkubacji komórek przedłużonej do 48 godzin pogłębieniu uległo działanie resweratrolu, który hamował właściwości adhezyjne komórek o 67 ± 3% przy stężeniu 10 µM, o 75 ± 1% przy stężeniu 50 µM i o 57 ± 3 % przy stężeniu 100 µM. Jednocześnie zaobserwowano odwrócenie efektu wywieranego przez obie jego syntetyczne pochodne. W przypadku 3,3',4,4'-THS, związek ten przy każdym z użytych stężeń pobudzał adhezję komórek nowotworowych, przy czym najwyższe pobudzenie odnotowano przy stężeniu 100 µM (wzrost o 202 ± 35%). Podobnie, pobudzenie adhezji zaobserwowano w odniesieniu do 3,3',4,4',5,5'-HHS, który przy stężeniu 10 µM wywierał efekt istotnie silniejszy niż 3,3',4,4'-THS (wzrost o 159 ± 42%), przy stężeniu 50 µM działał do niego podobnie, a przy stężeniu 100 µM efekty jego działania były słabsze niż 3,3',4,4'-THS (Rycina 29B).

Po 72 godzinach ekspozycji komórek na resweratrol nadal obserwowano zahamowanie adhezji do LKMO, przy czym najsilniejszy efekt stwierdzono przy stężeniu 100 µM. 3,3',4,4'-THS wykazywał działanie proadhezyjne, najsilniej wyrażone przy stężeniach 50 i 100 µM (wzrost, odpowiednio, o 104 ± 17% i 129 ± 29%). 3,3',4,4',5,5'-HHS w stężeniu 10 µM pobudzał adhezję komórek w stopniu podobnym do 3,3',4,4'-THS, natomiast w stężeniach 50 i 100 µM hamował właściwości adhezyjne (o 41 ± 6% przy stężeniu 50 µM i o 56 ± 3% przy stężeniu 100 µM) (Rycina 29C).

Angelika Kuczmarska

110

Rycina 29. Wpływ resweratrolu (Res), 3,3',4,4'-THS (THS) i 3,3',4,4',5,5'-HHS (HHS) na adhezję komórek raka jajnika A2780 do LKMO po 24 (A), 48 (B) i 72 (C) godzinach ekspozycji. Wyniki pochodzą z eksperymentów przeprowadzonych na 8 odrębnych

hodowlach komórek nowotworowych, z wykorzystaniem LKMO od 3 różnych dawców. Symbolem * oznaczono różnice istotne statystycznie (P<0,05) w porównaniu z komórkami nie poddawanymi działaniu związków badanych (komórki kontrolne; K). Symbolem # oznaczono różnice istotne statystycznie w porównaniu z komórkami eksponowanymi na resweratrol.

A.

B.

111

4.9.2. Komórki OVCAR-3

Badania wpływu stilbenów na adhezję komórek raka jajnika OVCAR-3 do monowarstwy młodych LKMO wykazały, że po 24 godzinach ekspozycji każdy z testowanych związków pobudza przyleganie komórek nowotworowych do komórek prawidłowych. Resweratrol użyty w stężeniu 10 µM wzmagał ten proces o 75 ± 11%, w stężeniu 50 µM o 93 ± 34%, a w stężeniu 100 µM o 114 ± 21%. Efekty wywierane przez 3,3',4,4'-THS nie różniły się statystycznie od tych, charakteryzujących resweratrol, za wyjątkiem najniższego ze stężeń, przy zastosowaniu którego adhezja komórek nowotworowych nie ulegała zmianie. Z kolei stilben 3,3',4,4',5,5'-HHS pobudzał adhezję przy każdym z użytych stężeń, a wywierane przez niego efekty były także porównywalne z resweratrolem. W odniesieniu do stężenia 10 µM, wpływ tego związku na adhezję komórek nowotworowych (pobudzenie zjawiska o 104 ± 28%) był istotnie wyższy w porównaniu z 3,3',4,4'-THS (Rycina 30A).

Także w wyniku ekspozycji komórek na stilbeny przedłużonej do 48 godzin zaobserwowano pobudzenie adhezji komórek nowotworowych pod wpływem każdego ze związków badanych, przy zastosowaniu każdego ze stężeń. Nie odnotowano natomiast istotnych statystycznie różnic w skali działania związków, za wyjątkiem efektów działania 3,3',4,4'-THS w stężeniu 50 µM, kiedy to związek ten co prawda nadal pobudzał adhezję komórek nowotworowych, jednak wywierany przez niego efekt biologiczny był istotnie słabszy zarówno w porównaniu z resweratrolem, jak i 3,3',4,4',5,5'-HHS (Rycina 30B).

Duże zmiany we wpływie stilbenów na adhezję komórek raka jajnika linii OVCAR-3 odnotowano natomiast po 72 godzinach inkubacji komórek. W tym punkcie czasowym nastąpiło znaczące osłabenie wcześniejszego efektu proadhezyjnego wszystkich związków, obserwowanego w pierwszej i drugiej dobie eksperymentu. W przypadku resweratrolu, związek ten użyty w stężeniu 10 µM pobudzał adhezję komórek o 45 ± 21%, jednak już przy stężeniu 50 µM hamował ten proces o 45 ± 9%, a przy stężeniu 100 µM o 50 ± 8%. Stlbeny 3,3',4,4'-THS oraz 3,3',4,4',5,5'-HHS w każdym z użytych stężeń pobudzały proces adhezji, przy czym ich efekty działania były bardzo zbliżone do siebie. Wywierane przez te związki efekty były także wyraźnie słabsze od tych, odnotowanych w drugiej dobie eksperymentu (Rycina 30C).

Angelika Kuczmarska

112

Rycina 30. Wpływ resweratrolu (Res), 3,3',4,4'-THS (THS) i 3,3',4,4',5,5'-HHS (HHS) na adhezję komórek raka jajnika OVCAR-3 do LKMO po 24 (A), 48 (B) i 72 (C) godzinach ekspozycji. Wyniki pochodzą z eksperymentów przeprowadzonych na 8

odrębnych hodowlach komórek nowotworowych, z wykorzystaniem LKMO od 3 różnych dawców. Symbolem * oznaczono różnice istotne statystycznie (P<0,05) w porównaniu z komórkami nie poddawanymi działaniu związków badanych (komórki kontrolne; K). Symbolem # oznaczono różnice istotne statystycznie w porównaniu z komórkami eksponowanymi na resweratrol.

A.

B.

113

4.9.3. Komórki SKOV-3

W wyniku 24-godzinnej ekspozycji komórek raka jajnika SKOV-3 na resweratrol wykazano, iż związek ten pobudza adhezję komórek nowotworowych do LKMO. Przy zastosowaniu stężenia 10 µM adhezja wzrosła o 88 ± 26% w porównaniu z grupą kontrolną, przy stężeniu 50 µM wzrosła o 50 ± 19%, a przy stężeniu 100 µM o 31 ± 25%. Jednocześnie, analog resweratrolu 3,3',4,4'-THS użyty w stężeniu 10 µM okazał się hamować proces adhezji (o 53 ± 5%), natomiast użyty w stężeniach 50 i 100 µM wywierał działanie pobudzające (wzrost, odpowiednio, o 134 ± 21% i 139 ± 37%). W przypadku dwóch najwyższych stężeń, efekty działania tego związku były znacząco wyższe w porównaniu z resweratrolem oraz porównywalne do efektów działania drugiej pochodnej, tj. 3,3',4,4',5,5'-HHS. Stilben 3,3',4,4',5,5'-HHS pobudzał adhezję komórek nowotworowych przy każdym z użytych stężeń, a przy dawce 10 µM jego efekty działania były porównywalne z działaniem resweratrolu (Rycina 31A).

Po dwóch dobach ekspozycji komórek na związki badane stwierdzono, że resweratrol utracił wcześniejsze działanie proadhezyjne, obserwowane uprzednio przy stężeniach 10 i 50 µM, natomiast użyty w stężeniu 100 µM rozpoczął działanie antyadhezyjne, hamując to zjawisko o 59 ± 10% w odniesieniu do grupy kontrolnej. Stilbeny 3,3',4,4'-THS i 3,3',4,4',5,5'-HHS pobudzały nadal adhezję komórek SKOV-3 przy zastosowaniu stężenia 10 µM, natomiast przy wyższych stężeniach nie wykazywały zdolności istotnego statystycznie modulowania tego zjawiska (efekt być może w pewnym stopniu zatarty przez relatywnie wysokie wartości SEM grup badanych). Efekty wywierane przez te związki były porównywalne (Rycina 31B).

W wyniku przedłużenia ekspozycji do 72 godzin, resweratrol wykazywał jeszcze silniejsze działanie przeciwadhezyjne, hamując ten element inwazyjności komórek nowotworowych przy stężeniach 50 i 100 µM o, odpowiednio, 46 ± 6% i 48 ± 4%. Stilben 3,3',4,4'-THS użyty w stężeniu 10 µM przestał wpływać na adhezję komórek nowotworowych, natomiast w stężeniach 50 i 100 µM ponownie stymulował to zjawisko, choć skala jego działania była wyraźnie niższa w porównaniu z pierwszą dobą eksperymentu. Z kolei 3,3',4,4',5,5'-HHS pobudzał adhezję przy każdym z użytych stężeń, jednak podobnie jak w przypadku drugiego analogu, jego działanie proadhezyjne uległo osłabieniu w porównaniu z wynikami uzyskanymi w pierwszej dobie (Rycina 31C).

Angelika Kuczmarska

114

Rycina 31. Wpływ resweratrolu (Res), 3,3',4,4'-THS (THS) i 3,3',4,4',5,5'-HHS (HHS) na adhezję komórek raka jajnika SKOV-3 do LKMO po 24 (A), 48 (B) i 72 (C) godzinach ekspozycji. Wyniki pochodzą z eksperymentów przeprowadzonych na 8

odrębnych hodowlach komórek nowotworowych, z wykorzystaniem LKMO od 3 różnych dawców. Symbolem * oznaczono różnice istotne statystycznie (P<0,05) w porównaniu z komórkami nie poddawanymi działaniu związków badanych (komórki kontrolne; K). Symbolem # oznaczono różnice istotne statystycznie w porównaniu z komórkami eksponowanymi na resweratrol.

A.

B.

115