Mapy połączeń funkcjonalnych w kulturach organotypowych hipokampu

Wykorzystując techniki poszukiwania połączeń pobudzających i hamujących, Rysunek 5-4 można uzupełnić połączeniami pobudzającymi i hamującymi w postaci linii gradientowych. Pozwala to na stworzenie pełnej mapy neuronów i występujących między nimi połączeń funkcjonalnych. Dodatkowo, mapę można uzupełnić o informacje na temat prawdopodobnego typu znalezionego neuronu. Określenie „prawdopodobnego” oznacza, że przypisanie komórki do danej klasy nie opiera się na metodzie pozwalającej ze 100% pewnością stwierdzić, z jaką komórką mamy do czynienia. Metodą taką jest n.p. barwienie immunologiczne barwnikami fluorescencyjnymi (ang. Immunostaining) [98], jednak zastosowana klasyfikacja opiera się na liczbie połączeń dominującego typu. Dla przejrzystości, połączenia typu pobudzającego i hamującego przedstawione zostały na oddzielnych rysunkach (Rysunek 5-5, Rysunek 5-6).

Rysunek 5-5: Mapa połączeń funkcjonalnych uzyskana z eksperymentu 2011-06-26-2 prezentująca połączenia pobudzające oraz podział neuronów na pobudzające (komórki piramidalne, niebieskie trójkąty), hamujące (interneurony, zielone okręgi) oraz neurony nieokreślonego typu (czarne kwadraty).

Na pierwszych zaprezentowanych mapach połączeń funkcjonalnych przedstawiony został podział neuronów na pobudzające, oznaczane na omawianych rysunkach i wszystkich następnych jako niebieskie trójkąty, hamujące (zielone okręgi) oraz niezidentyfikowane (czarne kwadraty). Na pierwszy rzut oka widać, że spośród znalezionych 79 neuronów, tylko 4 zidentyfikowane zostały jako neurony hamujące, 45 jako neurony pobudzające, w przypadku pozostałych 30 neuronów nie można określić typu ponieważ albo są to tylko neurony postsynaptyczne (nie będące źródłem oddziaływania), albo nie uczestniczą w sieci połączeń funkcjonalnych.

102

Rysunek 5-6: Mapa połączeń funkcjonalnych uzyskana z eksperymentu 2011-06-26-2 prezentująca połączenia hamujące oraz podział neuronów na pobudzające (komórki piramidalne, niebieskie trójkąty), hamujące (interneurony, zielone okręgi) oraz neurony nieokreślonego typu (czarne kwadraty).

Często stosowanym parametrem określającym własności sieci neuronowej jest gęstość połączeń funkcjonalnych. Jeżeli jako N oznaczymy liczbę zidentyfikowanych neuronów, a jako CE liczbę znalezionych połączeń pobudzających, gęstość połączeń DE wyrazimy wzorem:

D

N(N ) ^5-1

Mianownik powyższego wyrażenia oznacza liczbę potencjalnie możliwych połączeń. Gęstość połączeń pobudzających na Rysunku 5-5 wynosi 0.0209, gęstość połączeń hamujących na Rysunku 5-6 wynosi 0.0039. Jak widać, zarówno liczba neuronów hamujących jak i połączeń hamujących jest mniejsza niż neuronów i połączeń pobudzających. Wniosek ten, wyciągnięty na podstawie pierwszego zestawu wyników eksperymentalnych pozostaje w zgodzie z obserwacjami mikroskopowymi oraz eksperymentami prowadzonymi techniką elektrod wkłuwanych (rozdział 1.3.2 oraz [10] i [99]).

Poniżej przedstawionych zostanie kilka przykładów map neuronów wraz z połączeniami funkcjonalnymi uzyskanymi z danych eksperymentalnych:

A) Eksperyment 2011-06-28-1

Interesujący wynik uzyskany został w eksperymencie 2011-06-28-1, który pozwolił zarejestrować aktywność neuronów hipokampa oraz neuronów kory. Według danych literaturowych, preferowanym kierunkiem transmisji potencjałów czynnościowych jest od obszaru CA3 do CA1 oraz od kory do CA1 lub CA3. Dokładna analiza połączeń pozwala dojść do wniosku, że faktycznie kierunki te można określić jako „preferowane”. Oznacza to, że nie wszystkie, ale większość połączeń funkcjonalnych ukierunkowana jest właśnie w taki sposób, choć zidentyfikowane zostały też połączenia w kierunkach przeciwnych.

103

Analizując rozkład gęstości połączeń w badanym skrawku, można wyróżnić dwa duże obszary zagęszczenia połączeń pobudzających: pierwszy to obszar hipokampa, drugi to znajdujący się na matrycy rejon kory. Gęstość połączeń pomiędzy tymi obszarami jest bardzo niska (jest to tylko 13 połączeń). Mapa neuronów nałożona na zdjęcie pierwszego dnia hodowli przedstawiona została na Rysunku 5-7.

Rysunek 5-7: Mapa neuronów, eksperyment 2011-06-28-1. Zaznaczone zostały obszary hipokampa CA1, CA3, DG. Oprócz neuronów hipokampa, zarejestrowana została aktywność neuronów kory.

Mapa połączeń pobudzających przedstawiona została na Rysunku 5-8. Podział połączeń funkcjonalnych w obszarze hipokampa i kory widoczny jest doskonale na mapie połączeń pobudzających.

Rysunek 5-8: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2011-06-28-1. Zaznaczone zostały obszary hipokampa CA1, CA3.

Również w przypadku mapy połączeń hamujących (Rysunek 5-9) widoczny jest podział na dwie strefy aktywności: hipokamp i korę. Gęstość połączeń hamujących wynosi 0.0071 i jest niższa od gęstości połączeń pobudzających równej 0.0162.

104

Rysunek 5-9: Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-06-28-1. Znaleziono tylko jedno połączenie w kierunku od hipokampa do kory.

B) Eksperyment 2012-04-17-1

W zależności od pozycjonowania kultury organotypowej na matrycy, zauważyć można różne charakterystyki połączeń. W eksperymencie 2012-04-17-1, zidentyfikowanych zostało 151 neuronów, z czego większość w obszarze hipokampa. Rozkład neuronów przedstawia Rysunek 5-10.

Rysunek 5-10: Mapa neuronów, eksperyment 2012-04-17-1. Zaznaczone zostały obszary hipokampa CA1, CA3, DG. 113 z 151 neuronów znajduje się w obszarze hipokampa.

Przedstawiony przypadek jest szczególny pod względem bardzo równomiernego rozkładu neuronów w obszarach DG, CA1 i CA3. Obszar hipokampa dokładnie pokrywa matrycę mikroelektrod, choć takie ułożenie najczęściej jest dziełem przypadku. Znalezione zostały neurony pobudzające, jak również hamujące we wszystkich obszarach hipokampa, niestety ciężko wyróżnić warstwową strukturę rozkładu komórek. Podobnie w przypadku połączeń funkcjonalnych pobudzających i hamujących, rozkład wydaje się być „homogeniczny”. Najprawdopodobniej jest to spowodowane wykryciem aktywności wielu komórek poprzez rejestrację sygnałów z aksonów lub dendrytów, a nie z ciała

105

neuronu. Gęstość połączeń pobudzających wynosi 0.0080131, połączeń hamujących 0.0011166.

Rysunek 5-11: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2012-04-17-1. Zaznaczone zostały obszary hipokampa CA1, CA3.

Rysunek 5-12:Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-04-17-1.

C) Eksperyment 2012-04-19-0

Rozkład zidentyfikowanych neuronów w eksperymentach z użyciem kultur organotypowych nie zawsze jest jednorodny, jak w poprzednim przykładzie. Eksperyment 2012-04-19-0 pozwolił na rejestrację aktywności 109 neuronów (Rysunek 5-13), z czego 99 w obszarze hipokampa. Zdecydowanie najwięcej komórek znalezionych zostało w obszarze CA1.

Gęstość połączeń funkcjonalnych rozkłada się proporcjonalnie do gęstości neuronów. W obszarze CA1 gęstość połączeń pobudzających jest najwyższa. Interesujący jest fakt znalezienia połączeń z obszaru CA3 w kierunku CA1, zgodnie z przewidywaniami wynikającymi z danych literaturowych (patrz rozdział 1.3.4), choć liczba połączeń w obszarze CA3 jest bardzo niska. Podobnie w przypadku połączeń hamujących, najwyższa gęstość występuje w obszarze CA1.

106

Rysunek 5-13: Mapa neuronów, eksperyment 2012-04-19-0. Zaznaczone zostały obszary hipokampa CA1, CA3, DG. 99 z 109 neuronów znajduje się w obszarze hipokampa.

Rysunek 5-14: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2012-04-19-0. Zaznaczone zostały obszary hipokampa CA1, CA3.

107

Gęstość połączeń pobudzających wynosi 0.008641, gęstość połączeń hamujących 0.003968. Stosunek gęstości połączeń pobudzających do hamujących równy 2,17 jest bardzo niski w porównaniu do innych wykonanych eksperymentów.

D) Eksperyment 2012-05-21-0

Rysunek 5-16: Mapa neuronów, eksperyment 2012-05-21-0. Zaznaczone zostały obszary hipokampa CA1, CA3, DG. 97 z 165 neuronów znajduje się w obszarze hipokampa.

W przeciwieństwie do eksperymentu 2011-04-19-0, w którym większość aktywności skupiona była w obszarze CA1, w kulturze organotypowej 2012-05-21-0 liczba zidentyfikowanych połączeń funkcjonalnych w obszarze C1 jest bardzo niska, natomiast w CA3 jest bardzo wysoka. Co ciekawe, w obszarze CA1 udało się zidentyfikować znaczącą liczbę neuronów, które są zgrupowane warstwowo na poziomie warstwy komórek piramidalnych.

Rysunek 5-17: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2012-05-21-0. W obszarze CA1 wyznaczona gęstość połączeń jest bardzo niska, w przeciwieństwie do wysokiej gęstości połączeń w obszarze CA3.

108

Również zidentyfikowana liczba połączeń hamujących jest bardzo mała. W lewym górnym rogu matrycy oraz na jej górnej krawędzi zarejestrowano aktywność neuronów kory, pomiędzy którymi znaleziono połączenia funkcjonalne pobudzające i hamujące. Neurony kory tworzą jednak oddzielną grupę funkcjonalną nie połączoną z neuronami hipokampa. Gęstość znalezionych połączeń pobudzających w eksperymencie 2012-05-21-0 wynosi 0.009239, połączeń hamujących 0.001737.

Rysunek 5-18: Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-05-21-0. Neurony kory tworzą oddzielną grupę funkcjonalną od neuronów hipokampa.

E) Eksperyment 2012-05-22-1

W eksperymencie 2012-05-22-1 wykrytych zostało 289 neuronów, co jest jedną z najwyższych liczb spośród wszystkich przeprowadzonych eksperymentów. Neurony zlokalizowane zostały na całej powierzchni matrycy we wszystkich strukturach hipokampa, jak również w obszarze kory. Na Rysunku 5-19 widoczna jest duża grupa neuronów blisko prawej krawędzi matrycy, która nie została sklasyfikowana jako neurony pobudzające ani hamujące.

Rysunek 5-19: Mapa neuronów, eksperyment 2012-05-22-1. Zaznaczone zostały obszary hipokampa CA1, CA3, DG. 171 z 289 neuronów znajduje się w obszarze hipokampa.

109

Jest to wynikiem braku znalezionych połączeń funkcjonalnych wewnątrz tego obszaru (podpory wzgórka, S - Subiculum), jak również połączeń funkcjonalnych tego obszaru z pozostałymi. Gęstość połączeń pobudzających wynosi 0.003785, hamujących 0.001130.

Rysunek 5-20: Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2012-05-22-1. W obszarze CA1 występuje wysoka gęstość neuronów, wysoka gęstość połączeń oraz duża liczba połączeń z innymi obszarami, również z korą. Obszar S wykazuje dużą gęstość neuronów przy braku połączeń funkcjonalnych.

Rysunek 5-21:Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-05-22-1.

F) Eksperyment 2011-06-27-1

Eksperyment 2011-06-27-1 jest kolejnym, w którym pozycjonowanie kultury pozwoliło na rejestrację aktywności prawie całego hipokampa. Zidentyfikowanych zostało 98 neuronów, wszystkie jako neurony hipokampa. Gęstość neuronów nie jest homogeniczna, widoczna jest wyraźna, ciągła warstwa neuronów, głównie w obszarze CA1, najniższa gęstość neuronów występuje w obszarze CA3. Obszar oznaczony jako CA3 może w rzeczywistości być już obszarem CA2, jednak tak dokładne pozycjonowanie nie jest możliwe bez wybarwiania pojedynczych komórek.

110

Rysunek 5-22: Mapa neuronów, eksperyment 2011-06-27-1. Zaznaczone zostały obszary hipokampa CA1, CA3, DG. 171 z 289 neuronów znajduje się w obszarze hipokampa

Na Rysunku 5-23 przedstawione zostały połączenia pobudzające. Większość połączeń pomiędzy obszarem CA3 a CA1 jest zorientowana w kierunku od CA3 do CA1, brakuje natomiast klarownej polaryzacji kierunku pomiędzy DG - CA1 oraz DG - CA3.

Rysunek 5-23:Mapa połączeń pobudzających, eksperyment 2011-06-27-1. W tym eksperymencie zachowana została wyraźna warstwowa struktura neuronów w obszarach CA1 i CA3.

W przypadku połączeń hamujących, widać wyraźny podział na 3 obszary – pierwszy to grupa połączeń w DG, drugi w CA3 i trzeci w CA1 z dużym prawdopodobieństwem zazębiający się z CA2. Na Rysunku 5-24 widoczna jest jeszcze jedna cecha odróżniająca połączenia funkcjonalne hamujące od pobudzających, która nie została podkreślona w opisach poprzednich wyników, mianowicie zasięg oddziaływania. W przypadku oddziaływań hamujących średni zasięg połączenia jest krótszy niż dla połączeń pobudzających. Jest to cecha, którą spodziewalibyśmy się znaleźć jeżeli w kulturach organotypowych nie zaszłyby patologiczne zmiany. Warto przypomnieć, iż jedną z cech interneuronów, inaczej zwanych neuronami hamującymi, jest krótki zasięg aksonów. Gęstość połączeń pobudzających wynosi 0.01778, połączeń hamujących wynosi 0.004103.

111

Rysunek 5-24:Mapa połączeń hamujących, eksperyment 2011-06-27-1. Powyższa mapa połączeń jest przykładem krótkiego zasięgu połączeń hamujących.