Index of /rozprawy2/10843

Pełen tekst

(1)AKADEMIA GÓRNICZO-HUTNICZA IM. STANISŁAWA STASZICA W KRAKOWIE. Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej. Praca doktorska mgr inż. Przemysław Rydygier. Rozwój specjalizowanych układów scalonych oraz technik analizy danych do badań żywych sieci neuronowych z wykorzystaniem matryc mikroelektrod. Promotor: prof. dr hab. inż. Władysław Dąbrowski. Kraków 2014.

(2) 2.

(3) Oświadczenie autora rozprawy: Oświadczam, świadomy odpowiedzialności karnej za poświadczenie nieprawdy, że niniejszą pracę doktorską wykonałem osobiście i samodzielnie i że nie korzystałem ze źródeł innych niż wymienione w pracy.. data, podpis autora Oświadczenie promotora rozprawy: Niniejsza rozprawa jest gotowa do oceny przez recenzentów.. data, podpis promotora rozprawy. 3.

(4) Rozprawa doktorska przygotowywana była w : Zespół Elektroniki Jądrowej i Detekcji Promieniowania Zakład Oddziaływań i Detekcji Cząstek Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej AGH w Krakowie The Santa Cruz Institute for Particle Physics University of California, Santa Cruz. Podziękowania: Pragnę złożyć podziękowania Polsko-Amerykańskiej Komisji Fulbrighta za przyznanie stypendium wyjazdowego „Fulbright Junior Advanced Research Award”, które umożliwiło mi uczestniczenie w eksperymentach badawczych w Stanach Zjednoczonych, bez których ta praca doktorska nie mogłaby powstać, a także Ministerstwu Nauki i Szkolnictwa Wyższego za finansowanie prac badawczych w ramach grantu Nr N N515 335736 „Rozwój specjalizowanych układów scalonych o małym poborze mocy do wielokanałowej stymulacji elektrycznej i rejestracji sygnałów z komórek nerwowych w eksperymentach in-vivo” Pragnę podziękować wszystkim, bez których ta praca doktorska nie mogłaby powstać, przede wszystkim mojemu promotorowi Panu Profesorowi Władysławowi Dąbrowskiemu za ukierunkowanie naukowe pracy oraz udzieloną pomoc, oraz Panu Profesorowi Alanowi Litke za wprowadzenie w zagadnienia badań neurobiologicznych oraz opiekę naukową podczas stażu w Uniwersytecie Kalifornijskim w Santa Cruz. Szczególne podziękowania dla mojej żony Marzeny za cierpliwość, pomoc oraz wsparcie.. 4.

(5) SUMMARY The main subjects of the Dissertation are: development of application specific integrated circuits for simultaneous electrical stimulation and recording from neural cells using microelectrode arrays and. development of methods for automated. recognition of functional connectivity in live neural networks. First chapter describes biological and physical fundamentals of electrical phenomena in neural systems: neuron structure, initiation and propagation of the action potential, neuron types, synapse structure and its properties, electrical model of the synapse. A brief review of mouse brain anatomy is presented, focusing on hippocampal structure and propagation paths of neural activities. Second chapter presents state-of-the-art techniques of neural signals recording based on microelectrode arrays. Various types of microelectrodes, needles and silicon probes in context of extracellular recording are presented. Description of 512 electrode system for recoding spontaneous and evoked activity in vitro is presented. Although presented system, developed in Department of Particle Interaction and Detection Techniques WFiIS AGH, has been used successfully for many years in neurobiological experiments, it has some limitations, namely bandwidth of the recording circuitry not does not cover the frequency spectrum of the Local Field Potentials (LFPs). Requirements for a new recording/stimulating integrated circuit are presented to overcome limitations of the currently used system. A design of new integrated circuit comprising both, readout and electrical stimulation functionality, is presented in third chapter. The chip comprises readout front-end recording circuits, stimulation circuits with digital-to-analog converter, and an analog multiplexer. Details of circuit architecture, advantages and limitations, as well as electrical tests results are discussed. Presented chip is foreseen for both, in vitro as well as in vivo systems, for recording neural signals. Development of the recording techniques must be accompanied by data analysis. An introduction to statistical analysis of spontaneous neural activity recorded during long (over 10 hours) experiments on brain slices is presented in forth chapter. Preparation techniques, various approaches to data analysis, direction-sensitive and insensitive methods are discussed briefly. The main focus has been put on crosscorrelation of two neurons activity as the method allowing to extract maximum information from recorded activity. Cross-correlation of activity of neuron pairs allows us to detect functional connections between correlated neurons. It also carries information about connection type, direction, synapse type and synapse dynamics. Cross-correlation method has been employed as basis of the algorithm developed for automated recognition of functional connections between pairs of neurons. The algorithm of finding functional connectivity has been applied to data recorded during 52 experiments on cultured brain slices, which took place in Santa Cruz Institute for Particle Physics. The results are described and discussed in the last 5.

(6) chapter. The subject of the experiments was strain Black 6 mouse brain hippocampal structure. Results of functional connectivity of excitatory and inhibitory connections, superimposed on slices’ photographs are presented. Also a method based on wavelet transform for gamma rhythm synchronized pairs of neurons detection is presented. Regarding development of the electronic circuits the goal of this dissertation was to design a an integrated circuit capable of recording wide spectrum of neurobiological signals (Spike Potentials and Local Field Potentials) and stimulating single neurons. To address the first issue, a recording electronics has been designed. Single channel comprises a preamplifier, followed by two parallel band-pass filters (500 Hz - 2 kHz band for Spikes and 1 Hz – 300 Hz for LFPs), and two output amplifiers. 64 channels are integrated in a single chip including also an analog multiplexer. A novel multiplexing scheme has been elaborated and implement in the design resulting in reduction of the clocking signal feed-through and significant improvement of multiplexing precision at multiplexing frequency of 2.5 MHz. Low power, 20 kHz, 9-bit, digital to analogue converter (DAC) has been designed to be employed as stimulation pulse generator. To achieve balance between many contradictory requirements, successive charge sharing architecture has been chosen. The DAC is equipped with analogue memory cell and voltage buffer, controlled by digital circuit to minimize digital signals feed-through. Low Differential Non-Linearity (below 0.5 LSB) and Integral Non-Linearity (below 2 LSB) makes the signal generator suitable for the purpose of electrical stimulation of neurons. A novel method for finding functional connectivity between pairs of neurons, many times more computationally effective compared to currently used spike jittering has been proposed. Wavelet transform has been employed to detect pairs of neurons spiking synchronously with frequency in a range typical for gamma rhythm (30 - 70 Hz). Recordings from 52 experiments on cultured hippocampal slices were analyzed in search for excitatory, inhibitory and gamma rhythm. 18 out of 52 slices were extracted from genetically altered Fragile X mice. No statistical differences in terms of functional connectivity density between Wild-type and Fragile X have been identified. Neural connectivity maps with neurons’ locations and functional connections, superimposed on Day In vitro 1 photographs show good coherence with data found in the literature in terms of excitation propagation paths between different regions of the hippocampal structure. Detailed analysis of cross correlograms’ shapes proves that it is possible to extract information about synaptic dynamics and synapse type from extracellular recordings.. 6.

(7) SPIS TREŚCI Wstęp ........................................................................................................................................................................ 10 1. Geneza potencjałów czynnościowych w komórkach nerwowych. Rozkład potencjału wokół komórki nerwowej w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków....... 12 1.1. Budowa i działanie komórki nerwowej.........................................................................................12 1.1.1. Budowa komórki nerwowej....................................................................................................... 12 1.1.2. Powstawanie i przewodzenie potencjału czynnościowego .......................................... 13 1.1.3. Propagacja potencjału czynnościowego wzdłuż aksonu ............................................... 15 1.2. Synapsa jako podstawowa jednostka organizacji żywych sieci neuronowych.............17 1.2.1. Budowa i rodzaje synaps ............................................................................................................. 17 1.2.2. Model elektryczny synapsy chemicznej ................................................................................ 19 1.3. Budowa mózgu myszy ze szczególnym uwzględnieniem hipokampa. .............................21 1.3.1. Budowa mózgu myszy .................................................................................................................. 21 1.3.2. Hipokamp – budowa morfologiczna i występujące w nim typy neuronów ........... 22 1.3.3. Interneurony i ich rola w działaniu hipokampa ................................................................ 24 1.3.4. Budowa hipokampa a połączenia funkcjonalne z innymi obszarami mózgu ........ 25 1.4. Obrazowanie elektrofizjologiczne, pole potencjału wokół komórki nerwowej. ..........26 2. Systemy do rejestracji aktywności elektrycznej kultur neuronowych wykorzystujące matryce mikroelektrod .............................................................................................. 28 2.1. Rola matryc mikroelektrod w rejestracji aktywności komórek nerwowych. Rejestracja wewnątrz i zewnątrzkomórkowa ............................................................................28 2.2. Sondy elektrodowe i mikroigły - najnowsze metody rejestracji potencjałów zewnątrzkomórkowych .......................................................................................................................30 2.3. Budowa systemu 512-elektrodowego do rejestracji aktywności elektrycznej żywych sieci neuronowych .................................................................................................................32 2.4. Wymagania projektowe dla nowego układu scalonego do równoczesnej stymulacji i odczytu aktywności komórek nerwowych w eksperymentach In-vitro oraz In-vivo...............................................................................................................................35 2.4.1. Dyskusja i założenia projektowe poszczególnych bloków funkcjonalnych ........... 35 1.1.1. Schemat blokowy układu scalonego NEUROSTIM. Odczyt / generowanie sygnałów analogowych ................................................................................................................ 39 1.1.2. Interfejs komunikacyjny .............................................................................................................. 40 3. Projekt i testy wybranych bloków funkcjonalnych specjalizowanego układu scalonego NEUROSTIM ................................................................................................................................ 41 3.1. Przetwornik cyfrowo-analogowy w układzie do stymulacji elektrycznej ......................41 3.1.1. Architektura przetwornika cyfrowo-analogowego.......................................................... 42 3.1.2. Ograniczenia architektury i źródła nieliniowości przetwornika................................ 43 7.

(8) 3.1.3. Pamięć analogowa i układ redukcji pasożytniczego wstrzykiwania ładunku...... 46 3.1.4. Wyniki pomiarów przetwornika cyfrowo-analogowego .............................................. 48 3.2. Układ do rejestracji sygnałów neurobiologicznych ................................................................. 52 3.2.1. Filtr wejściowy i przedwzmacniacz ....................................................................................... 53 3.2.2. Filtry pasmowo-przepustowe .................................................................................................. 54 3.2.3. Wzmacniacze wyjściowe ............................................................................................................ 57 3.2.4. Wyniki pomiarów charakterystyk częstotliwościowych i liniowości ...................... 58 3.3. Multiplekser analogowy ...................................................................................................................... 59 3.3.1. Architektura i zasada działania multipleksera .................................................................. 59 3.3.2. Komórka pamięci i wzmacniacz operacyjny ...................................................................... 60 3.3.3. Rejestr przesuwny, blok logiki kontrolnej i 4 tryby pracy. .......................................... 63 4. Analiza statystyczna aktywności dużej liczby komórek nerwowych ...................................... 66 4.1. Preparatyka wycinków mózgu myszy, hodowanie kultur i rejestracja aktywności elektrycznej neuronów hipokampa i kory mózgowej .................................... 66 4.2. Wstępna analiza danych – wykrywanie i sortowanie potencjałów czynnościowych ...................................................................................................................................... 68 4.3. Metody poszukiwania połączeń funkcjonalnych pomiędzy neuronami ......................... 69 4.3.1. Metody bezkierunkowe – metoda informacji wzajemnej ............................................. 69 4.3.2. Metody kierunkowe - Entropia Przejściowa ...................................................................... 69 4.3.3. Korelacja wzajemna ...................................................................................................................... 70 4.4. Związek kształtu funkcji korelacji wzajemnej z typem połączenia funkcjonalnego ........................................................................................................................................ 71 4.4.1. Geneza kształtu funkcji korelacji wzajemnej ..................................................................... 71 4.4.2. Model formalny neuronu całkuj i strzelaj, model synapsy pobudzającej i hamującej .......................................................................................................................................... 72 4.4.3. Kształty wykresów funkcji korelacji wzajemnej oraz odpowiadające im konfiguracje połączeń synaptycznych. ................................................................................. 77 4.4.4. Wykrywanie połączeń synaptycznych metodą drgań losowych. Wady i ograniczenia metody. ................................................................................................................... 81 4.5. Wydajny obliczeniowo algorytm detekcji połączeń synaptycznych................................. 83 4.5.1. Zastąpienie drgań losowych filtracją dolnoprzepustową ............................................. 84 4.5.2 Wybór filtru cyfrowego ............................................................................................................... 85 4.5.3. Określenie istotności statystycznej korelacji wzajemnej .............................................. 89 4.5.4. Podsumowanie opracowanej metody i wnioski: .............................................................. 91 4.6. Sposoby określania rodzaju znalezionej komórki nerwowej .............................................. 93 4.6.1. Klastrowanie w przestrzeni częstotliwość - szerokość impulsu - średnia z autokorelacji ................................................................................................................................. 94 8.

(9) 4.6.2. Określenie typu komórki na podstawie korelacji wzajemnej ...................................... 95 5. Badanie połączeń funkcjonalnych w kulturach organotypowych mózgu myszy. ............... 97 5.1. Badanie połączeń pobudzających i hamujących, rozpoznawanie komórek pobudzających i hamujących .............................................................................................................97 5.1.1. Mikrofotografie kultur organotypowych i ich rola w identyfikacji aktywności elektrycznej poszczególnych struktur anatomicznych. ......................... 97 5.1.2. Mapy połączeń funkcjonalnych w kulturach organotypowych hipokampu mózgu myszy ................................................................................................................................. 101 5.2. Identyfikacja połączeń zsynchronizowanych w rytmie gamma ...................................... 111 5.2.1. Geneza rytmów (fal) mózgowych. Hipotetyczny układ neuronów generujący rytm gamma ........................................................................................................... 112 5.2.2. Wykorzystanie transformaty falkowej do automatycznego wykrywania połączeń neuronów zsynchronizowanych........................................................................ 113 5.2.3. Półautomatyczna metoda poszukiwania par neuronów zsynchronizowanych w rytmie gamma.............................................................................. 115 5.2.4. Wyniki półautomatycznej analizy poszukiwania par neuronów zsynchronizowanych w zakresie rytmu fal mózgowych gamma ............................ 117 5.3. Analiza dynamiki synaptycznej połączeń pobudzających .................................................. 121 5.4. Podsumowanie wyników i wnioski.............................................................................................. 124 Podsumowanie ................................................................................................................................................... 128 Dodatek A: Sortowanie potencjałów czynnościowych ...................................................................... 130 Dodatek B: Własności transformaty falkowej i jej zastosowanie do wykrywania kształtów na wykresach korelacji wzajemnej................................................................................. 133 Bibliografia........................................................................................................................................................... 136 Spis Rysunków ................................................................................................................................................... 141 Spis tabel ............................................................................................................................................................... 145. 9.

(10) WSTĘP Pierwsze techniki rejestracji aktywności elektrycznej komórek nerwowych opracowane zostały już w XIX wieku. Juliusz Bernstein przeprowadził rejestrację potencjału czynnościowego neuronu w roku 1868 [1]. Również koncepcja stymulacji komórki nerwowej nie jest nowa. Pierwszą udaną próbę stymulacji przeprowadził i opisał w roku 1933 Ralph Waldo Gerard [2]. Opisu zjawiska generacji potencjału czynnościowego w komórkach nerwowych kałamarnicy na bazie zjawisk fizycznych dokonali Alan Hodgkin oraz Andrew Huxley [3]. Był to pierwszy fizyczny model komórki nerwowej odwzorowujący pracę kanałów jonowych, na którym opiera się większość modeli stosowanych współcześnie. Wszystkie te przełomowe odkrycia bazowały na badaniach prowadzonych przy użyciu pojedynczej elektrody, których przedmiotem była pojedyncza komórka nerwowa. Dostępne techniki eksperymentalne pozwalały na równoczesne badanie tylko kilku neuronów – ograniczenie stanowiła możliwość fizycznego pozycjonowania dużej liczby elektrod. W roku 1972 po raz pierwszy w badaniach neurobiologicznych zastosowano matrycę mikroelektrod [4]; było to otwarcie nowego rozdziału w historii badań neurobiologicznych, związane z możliwością równoczesnej rejestracji aktywności wielu neuronów. W eksperymentach rejestracji potencjałów zewnątrzkomórkowych in vitro wycinek tkanki nerwowej umieszczany jest na matrycy mikroelektrod. Każda elektroda połączona jest z układem elektroniki odczytu, wzmacniającym i filtrującym sygnały. Elektrody zewnątrzkomórkowe znajdują się w pewnej odległości od komórek nerwowych, przez co wartości rejestrowanych potencjałów zewnątrzkomórkowych są dużo niższe od potencjałów transbłonowych. Może to budzić wątpliwości, czy ta metoda pozwala badać te same własności neuronów co elektrody wkłuwane? Należy jednak pamiętać, że wkłucie dużej liczby elektrod szklanych może prowadzić do zniszczenia niektórych komórek i zaburzenia dział ania sieci neuronowej jako całości. Zastosowanie matryc mikroelektrod jest metodą bardzo mało inwazyjną i zasadniczo rozwiązuje wspomniany problem. Matryce mikroelektrod stosowane są przez wiele grup naukowych badających działanie żywych sieci neuronowych na różnych poziomach, od pojedynczych komórek, skupiając się na zależnościach kształtu potencjału komórkowego od gęstości kanałów jonowych [5] aż do relacji pomiędzy grupami neuronów w mózgach ssaków [6]. Badana tkanka i neurony rozmieszczone są na matrycy w sposób losowy, konsekwencją czego jest rejestracja potencjałów pochodzących z wielu komórek na pojedynczej elektrodzie, i oczywiście rejestracja napięcia pochodzącego z jednej komórki na wielu elektrodach. Takie nieuporządkowanie w rejestrowanych danych wymusza zastosowanie algorytmów sortujących potencjały czynnościowe. Pozwalają one na identyfikację pojedynczych neuronów na podstawie różnic kształtów zarejestrowanych potencjałów. Potencjały czynnościowe można sprowadzić do zapisu binarnego o określonym interwale czasowym, gdzie 0 oznacza brak potencjału, 1 – wystąpienie potencjału czynnościowego. Zapis binarny może zostać użyty do poszukiwania połączeń funkcjonalnych na podstawie statystyki aktywacji neuronów w czasie w zależności od aktywacji innych neuronów. Poszukiwanie połączeń funkcjonalnych w dużych grupach neuronów jest podstawowym celem analizy danych przeprowadzonej w niniejszej pracy doktorskiej. Materiałem badawczym, który był wykorzystywany do pracy nad metodami poszukiwań połączeń funkcjonalnych między neuronami były kultury organotypowe z wycinków mózgu myszy. Techniki hodowania kultur organotypowych znane były już 10.

(11) w latach 80 XXw., jednak dopiero zastosowanie matryc mikroelektrod oraz dużej mocy obliczeniowej dostępnej dzięki nowoczesnym komputerom umożliwiło badanie połączeń funkcjonalnych między dużymi grupami komórek nerwowych (nawet do kilkuset) w kulturach organotypowych. Przebieg typowego eksperymentu został przedstawiony schematycznie na Rysunku i.1.. Rysunek i.1. Główne etapy eksperymentu mającego na celu sporządzenie mapy połączeń funkcjonalnych w mózgu myszy: a) ekstrakcja plasterka mózgu, b) hodowla kultury organotypowej, c) rejestracja aktywności spontanicznej, d) wykrywanie i sortowanie potencjałów czynnościowych, e) binaryzacja, f) analiza danych, g) mapa połączeń funkcjonalnych.. Skonstruowany w Katedrze Oddziaływań i Detekcji Cząstek WFiIS AGH system do rejestracji oraz stymulacji elektrycznej komórek nerwowych, stosowany obecnie w Instytucie Cząstek Elementarnych w Santa Cruz oraz Instytucie Salka w La Jola (Kalifornia, USA) oparty jest na układach scalonych umożliwiających rejestrację potencjałów czynnościowych. System ten wykorzystywany był także przez autora niniejszej rozprawy do badań wycinków mózgu myszy. Nie umożliwia on jednak (lub umożliwia w bardzo ograniczonym zakresie) rejestracji potencjałów polowych, sygnałów w zakresie częstotliwości 0.1-10Hz. Ponieważ technika rejestracji oraz analizy potencjałów czynnościowych została w wysokim stopniu opanowana i udoskonalona, kolejnym krokiem na drodze poznawania praw rządzących działaniem żywych sieci neuronowych jest umożliwienie rejestracji właśnie potencjałów polowych równolegle z potencjałami czynnościowymi i poszukiwanie relacji pomiędzy tymi dwoma klasami sygnałów. Aby umożliwić rozpoczęcie tego typu badań, konieczne jest zaprojektowanie nowego układu scalonego, który umożliwi rejestrację potencjałów polowych oraz czynnościowych, jak również stymulację elektryczną neuronów. W rozdziale 3. przedstawiony zostanie projekt układu scalonego, który umożliwia rejestrację aktywności potencjałów czynnościowych, potencjałów polowych jak również stymulację elektryczną komórek nerwowych.. 11.

(12) 1. GENEZA. POTENCJAŁÓW CZYNNOŚCIOWYCH W KOMÓRKACH NERWOWYCH.. ROZKŁAD. POTENCJAŁU WOKÓŁ KOMÓRKI NERWOWEJ W OŚRODKOWYM UKŁADZIE NERWOWYM SSAKÓW.. 1.1. Budowa i działanie komórki nerwowej 1.1.1. Budowa komórki nerwowej Podstawową jednostką czynnościową systemu nerwowego ssaków jest neuron. Budowa typowej komórki nerwowej przedstawiona została na Rysunku 1-1.. Rysunek 1-1: Budowa komórki nerwowej [7].. Budowa morfologiczna neuronu jest złożona i można w nim wyróżnić 3 zasadnicze elementy:  drzewo dendrytów – jego zadaniem jest odbieranie sygnałów wejściowych (impulsów z innych neuronów lub z komórek receptorowych np. komórek czuciowych w skórze – ciałek dotykowych Meissnera)  ciało komórki (soma) – w nim następuje sumowanie sygnałów wejściowych oraz generacja potencjału czynnościowego, jeśli został przekroczony próg pobudzenia. Ciało komórki nerwowej może mieć różnorodne kształty i wymiary od 4 µm do 150 µm. W tym miejscu zachodzą główne procesy metaboliczne i synteza składników komórkowych.  akson – długa, cylindryczna wypustka, poprzez którą potencjał czynnościowy jest przesyłany do kolejnych komórek (innych neuronów lub komórek efektorowych). Akson może się rozgałęziać w pobliżu ciała komórki lub osiągać długość do 1,2m, średnica może dochodzić do 1mm. Włókno aksonu może być izolowane za pomocą osłonki mielinowej. Długie aksony posiadają osłonkę mielinową, która nie jest ciągła lecz posiada przerwy co ok. 1mm, tzw. przewężenia Ranviera. Oprócz neuronów tkanki nerwowe zbudowane są z komórek glejowych. Kilkakrotnie liczniejsze od komórek nerwowych, pełnią funkcje tkanki nośnej a także zaopatrującej neurony w substancje metaboliczne. Do neurogleju zaliczamy: Oligodendrocyty wytwarzające mielinę, spełniającą funkcję izolatora oddzielającego komórki przewodzące, Astrocyty pośredniczące w wymianie substancji budulcowych i metabolicznych między krwioobiegiem a neuronami oraz Komórki mikrogleju wykazujące właściwości żerne [8]. 12.

(13) 1.1.2. Powstawanie i przewodzenie potencjału czynnościowego Neuron posiada dwa stany funkcjonalne: A. Stan spoczynkowy B. Stan przewodzenia. W stanie spoczynkowym jak i przewodzenia, na poziomie molekularnym zachodzą procesy wymagające dostarczenia energii w postaci wysokoenergetycznych wiązań chemicznych w ATP (adenoz ynotrójfosforan) [8]. Oba stany funkcjonalne opierają się na działaniu białek błonowych transportujących jony w poprzek błony komórkowej. Białka te nazywane są napięciowo zależnymi kanałami jonowymi, ponieważ napięcie panujące na błonie komórkowej decyduje o stanie czynnościowym, w jakim znajdują się w danej chwili. Przejście ze stanu spoczynkowego do stanu przewodzenia odbywa się w wyniku wystąpienia wystarczająco silnych bodźców pobudzających w drzewie dendrytów. W wyniku czasoprzestrzennego sumowania sygnałów przez drzewo dendrytów, w obrębie ciała neuronu dochodzi do wygenerowania pojedynczego impulsu nerwowego (lub krótkiej serii kilku impulsów, ang. bursting), który propaguje się wzdłuż aksonu komórki nerwowej. W organizmach żywych skutkiem powstania i propagacji impulsu nerwowego jest dotarcie impulsu do innego neuronu lub do komórki efektorowej, dla której impuls nerwowy jest sygnałem do modyfikacji jej metabolizmu (np. skurcz komórki mięśniowej, uwolnienie do krwi hormonów przez komórki wydzielnicze itp.). A) Stan spoczynkowy Występuje, gdy komórka nie odbiera z zewnątrz żadnych bodźców lub występujące bodźce nie są wystarczające, aby wywołać przejście do stanu przewodzenia. Koncentracje poszczególnych jonów we wnętrzu i na zewnątrz komórki są różne, w stanie spoczynkowym występuje równowaga pomiędzy siłami osmotycznymi (wynikającymi z różnych stężeń jonów po obu stronach błony komórkowej) i siłami elektrycznymi, które wynikają z gradientu gęstości ładunku elektrycznego. Najważniejszymi jonami, które znajdują się w cytoplazmie neuronów i ich otoczeniu są: kation potasowy K+, kation sodowy Na+, anion chlorkowy Cl-. Dla każdego z tych jonów występuje napięcie równowagi, opisane równaniem Nernsta [9]. W praktyce, do utrzymania napięcia spoczynkowego na stałym poziomie, komórka nerwowa wykorzystuje białka błonowe transportujące jony. B) Stan przewodzenia Opis generacji i rozprzestrzeniania się potencjału czynnościowego wymaga wyjaśnienia, w jaki sposób działają kanały jonowe w błonie komórkowej neuronu. Wyróżnia się dwa rodzaje kanałów jonowych: kanały sodowe i kanały potasowe. Kanały te różnią się budową i sposobem działania. Napięciowo zależne kanały sodowe zbudowane są z dwóch podjednostek zwanych bramką m i bramką h (Rysunek 1-2 po stronie lewej). W stanie spoczynkowym bramka m pozostaje zamknięta, bramka h jest otwarta. Gdy potencjał błony komórkowej zmienia się w wyniku depolaryzacji (potencjał po wewnętrznej stronie staje się mniej ujemny w stosunku do środowiska zewnątrzkomórkowego, przyjmując wartość powyżej - 50mV), kanał sodowy zostaje aktywowany. Reakcja bramek nie jest równoczesna, bramka m reaguje natychmiast i otwiera się, podczas gdy bramka h zamyka się dopiero po 1 - 2ms (Rysunek 1-2.B). Przez pewien czas (ok. 1ms), gdy bramka m jest już otwarta, a bramka h jeszcze się nie zamknęła, kanał pozostaje otwarty dla przepływu jonów sodowych.. 13.

(14) Rysunek 1-2: Sekwencja działania kanałów błonowych w kolejnych fazach generacji potencjału czynnościowego. A – stan spoczynkowy. B – depolaryzacja błony i aktywacja kanałów sodowych prowadząca do dalszego wzrostu napięcia. C – repolaryzacja – dezaktywacja kanałów sodowych i otwarcie kanałów potasowych, napięcie przyjmuje wartość poniżej wartości spoczynkowej (-70mV). D – hiperpolaryzacja błony – kanały potasowe pozostają otwarte przez pewien czas po zaniknięciu depolaryzacji [9].. Gdy polaryzacja elektryczna aktywująca białko zanika, bramki powracają do położenia spoczynkowego w takiej samej kolejności – najpierw zamyka się bramka m, a następnie otwiera się bramka h.. 14.

(15) Aktywowany napięciem kanał potasowy zawiera tylko jedną bramkę – w nomenklaturze neurobiologicznej nazywana jest bramką n. Bramka n w stanie spoczynkowym pozostaje zamknięta. Gdy pojawia się wzrost wartości ujemnego potencjału błonowego od -70mV do -50mV, bramka otwiera się z opóźnieniem podobnie jak bramka h w kanale sodowym. Kanał potasowy pozostaje otwarty dopóki napięcie błonowe nie powróci do wartości spoczynkowej. Schematyczną budowa i działanie kanału potasowego przestawia Rysunek 1-2 (po stronie prawej). W wyniku depolaryzacji błony komórkowej, pierwszym, natychmiastowym efektem jest otwarcie bramek m w kanałach sodowych, zwiększenie przewodności błony komórkowej dla sodu, napływ jonów sodowych do wnętrza komórki i zaburzenie stanu równowagi jonowej. Układ dąży do wyrównania stężeń kationów sodowych po obu stronach błony komórkowej. Wzrost potencjału po wewnętrznej stronie błony komórkowej powoduje wypływ kationów potasowych K+ na zewnątrz komórki. Jeśli liczba aktywowanych kanałów sodowych jest mała, to przewodność błony dla potasu może być wyższa niż dla sodu i odkomórkowy prąd potasowy zrównoważy dokomórkowy prąd sodowy. Wypadkowy potencjał błonowy nie ulegnie zmianie i nie wystąpi potencjał czynnościowy. Jeżeli ma miejsce silna depolaryzacja błony, szczególnie w miejscach o wysokim zagęszczeniu kanałów sodowych (początkowy odcinek aksonu, tzw. wzgórek aksonu), dochodzi do silnego napływu jonów sodowych do wnętrza komórki i odkomórkowy prąd potasowy nie jest w stanie zrównoważyć zmian napięcia. Potencjał po wewnętrznej stronie staje się coraz wyższy, na zasadzie dodatniego sprzężenia zwrotnego coraz więcej kanałów sodowych zostaje otwartych aż do inicjacji potencjału czynnościowego. W szczytowym momencie depolaryzacji polarność błony komórkowej ulega odwróceniu i napięcie błonowe osiąga wartość +30mV. Przewodność kanałów sodowych jest w tym momencie kilkadziesiąt razy większa niż kanałów potasowych. Kanały sodowe pozostają otwarte przez 1-2ms, po czym bramka h zamyka się i kanał sodowy staje się nieprzewodzący niezależnie od stanu bramki m. Przez ten czas błona komórkowa pozostaje niewrażliwa na bodźce. Następnie ulegają otwarciu kanały potasowe, kationy potasowe wypływają na zewnątrz komórki – błona komórkowa ulega repolaryzacji. W tym etapie przewodność dla jonów potasowych jest maksymalna, powracając do polaryzacji spoczynkowej, napięcie błonowe na okres ok. 35-40ms spada do wartości bardziej ujemnej niż wartość spoczynkowa, czyli poniżej -70mV. Okres ten nazywany jest fazą hiperpolaryzacji, w tym czasie komórka wykazuje zmniejszoną wrażliwość na pobudzenie [8], [9].. 1.1.3. Propagacja potencjału czynnościowego wzdłuż aksonu Potencjał czynnościowy to depolaryzacja błony komórkowej (chwilowe odwrócenie napięcia błonowego), która występuje po przekroczeniu na błonie komórkowej napięcia -50mV. Depolaryzacja związana jest z lawinowym napływem kationów sodowych do wnętrza komórki. Kationy mają tendencję do rozprzestrzeniania się na sąsiednie fragmenty błony komórkowej. Jeżeli napięcie przekroczy wartość progową -50mV, dochodzi do wygenerowania potencjału czynnościowego w sąsiednim, do tej pory pozostającym w stanie spoczynku fragmencie błony. Potencjał czynnościowy jest swego rodzaju „rozprzestrzeniającą się wzdłuż włókna nerwowego falą depolaryzacji” (Rysunek 1-3). Cykliczna zmiana potencjału błonowego może przebyć drogę wzdłuż całej długości włókna. 15.

(16) Rysunek 1-3: Propagacja potencjału czynnościowego: miejsce, do którego dociera potencjał czynnościowy ulega depolaryzacji (napływ jonów Na+). Na podstawie [8], [9].. Równomierne rozmieszczenie kanałów błonowych pozwala na propagację potencjału w obie strony aksonu, jednak najczęściej potencjał propaguje się tylko w kierunku od ciała komórki do synapsy na zakończeniu aksonu (kierunek ortodromowy). Dzieje się tak dlatego, że potencjał pierwotnie generowany jest w ciele komórki i zaczyna się przemieszczać w kierunku synapsy – miejsca, które zostały zdepolaryzowane chwile wcześniej, są niewrażliwe na pobudzenie, więc potencjał propaguje się tylko w jednym kierunku. Przewodzenie w obu kierunkach może zostać sztucznie wywołane poprzez stymulację środkowego fragmentu aksonu za pomocą na przykład stymulacji zewnętrznym prądem lub napięciem doprowadzanym za pomocą elektrody wkłutej do wnętrza komórki. Szybkość propagacji potencjału czynnościowego zależy od rodzaju neuronu i waha się w granicach od 0,1 do 100m/s. W głównej mierze szybkość przewodzenia jest definiowana przez stosunek przewodności elektrycznej wnętrza aksonu σa do przewodności błony komórkowej σb, (σa i σb są zdefiniowane jako przewodność na jednostkę długości włókna). Im wyższy iloraz przewodności σa/σb, tym mniejszy przepływ prądu sodowego na zewnątrz komórki. Depolaryzacja związana z generacją impulsu w danym fragmencie błony propaguje się efektywniej na kolejne obszary, co zwiększa szybkość przemieszczania się potencjału. Przewodność wnętrza aksonu σa jest proporcjonalna do drugiej potęgi promienia aksonu, natomiast przewodność błony σb zależy od promienia liniowo. Jeżeli szybkość propagacji zależy od stosunku σa/σb, to w aksonach o większej grubości potencjał czynnościowy będzie się propagował szybciej, niż w aksonach cienkich [9]. Największą prędkość przenoszenia potencjału posiadają włókna otoczone osłonką mielinową (działającą jak izolator, Rysunek 1-1). W osłonce mielinowej znajdują się regularnie występujące przerwy (przewężenia Ranviera). Depolaryzacja w jednym węźle przemieszcza się wzdłuż wnętrza aksonu do następnego węzła, z pominięciem fragmentu otoczonego osłonką mielinową. Jest to tzw. przewodnictwo skokowe, znacznie szybsze w stosunku do przewodnictwa ciągłego nawet w bardzo cienkich włóknach [8], [9].. 16.

(17) 1.2. Synapsa jako neuronowych. podstawowa. jednostka. organizacji. żywych. sieci. Interakcje pomiędzy neuronami zachodzą dzięki połączeniom zwanym synapsami. W najprostszy sposób synapsę można opisać jako połączenie, poprzez które wybrany neuron może aktywować lub zahamować potencjał czynnościowy innego neuronu. Wiele dowodów eksperymentalnych oraz modeli fizycznych synapsy wskazuje na to, że transmisja synaptyczna odbywa się w sposób stochastyczny. Pobudzenie lub hamowanie nie odbywa się ze 100% prawdopodobieństwem, również czas jaki upływa od wystąpienia potencjału czynnościowego w neuronie pobudzającym i pobudzanym (hamującym i hamowanym) podlega rozkładowi statystycznemu [10].. 1.2.1. Budowa i rodzaje synaps Ze względu na fizyczny sposób przesyłania pobudzenia (sygnału) synapsy dzielą się na elektryczne i chemiczne. Synapsa elektryczna to bezpośrednie połączenie powierzchni błon komórkowych dwóch neuronów mające średnicę 3-4 nm. Kanały jonowe przeszywające obie błony komórkowe umożliwiają przepływ jonów i bezpośrednie pobudzanie jednego neuronu przez drugi. Synapsy elektryczne zazwyczaj działają dwukierunkowo, obecne są najczęściej w systemach nerwowych wymagających najszybszego przesyłania sygnałów (mechanizmy obronne). Ich liczebność jest znacznie niższa, a budowa znacznie prostsza w porównaniu do synaps chemicznych. Budowa i mechanizm działania synapsy chemicznej przedstawione zostały na Rysunku 1-4. W synapsie możemy wyróżnić błonę presynaptyczną i postsynaptyczną, tworzące obszar aktywny. W przeciwieństwie do synapsy elektrycznej, synapsa chemiczna. Rysunek 1-4: Budowa i działanie synapsy. Transmitery i modulatory zostają uwolnione z pęcherzyków synaptycznych do przestrzeni synaptycznej, wiążą się z receptorami błony pre- i postsynaptycznej, następnie zostają przeniesione do wnętrza komórki. Rysunek zaczerpnięty z [8].. 17.

(18) działa w sposób jednokierunkowy. Wyróżnić można fazę presynaptyczną oraz postsynaptyczną. Faza presynaptyczna polega na uwolnieniu neurotransmitera, który oddziałuje na błonę postsynaptyczną. Potencjał czynnościowy docierający do obszaru kolby synaptycznej powoduje fuzję pęcherzyków zawierających neurotransmiter z błoną komórkową. Uwolniony neurotransmiter przedostaje się do przestrzeni międzysynaptycznej. Tam jego część jest wychwytywana zwrotnie (odzyskiwana) przez receptory białkowe na powierzchni błony presynaptycznej. Pozostałe cząsteczki neurotransmitera wiążą się z receptorami białkowymi w błonie postsynaptycznej i są transportowane do wnętrza neuronu pobudzanego. Wzrost stężenia neurotransmitera w przestrzeni postsynaptycznej, wywołuje kolejne efekty: w synapsie pobudzającej wzrost przewodności błony komórkowej w rejonie kolby postsynaptycznej, uwolnienie przez receptory białkowe jonów wapnia Ca2+ i powstanie potencjału czynnościowego w neuronie postsynaptycznym. W przypadku synapsy hamującej, efektem jest wzrost depolaryzacji błony komórkowej neuronu postsynaptycznego i zmniejszenie możliwości pobudzenia komórki przez inne synapsy. Synapsy chemiczne możemy podzielić na synapsy pobudzające i synapsy hamujące. Różnice między nimi zostały przedstawione na Rysunku 1-5. . . Synapsy pobudzające wykazują asymetrię w grubości błon pre- i postsynaptycznej, mają również małe i okrągłe pęcherzyki zawierające neurotransmiter [10]. Jako neurotransmitery najczęściej występują: acetylocholina, dopamina, noradrenalina, serotonina, adenozyna aminokwasy pobudzające [8]. Synapsy hamujące mają błony pre- i postsynaptyczne podobnej grubości. Pęcherzyki synaptyczne są spłaszczone lub bezkształtne, synapsa tego typu jest synapsą hamującą [10]. Neurotransmiterem jest kwas gamma-aminomasłowy (GABA), który utrzymuje błonę postsynaptyczną na niższym potencjale niż potencjał spoczynkowy, przez co zmniejsza jej podatność na pobudzenie [8].. Rysunek 1-5: Dwa główne typy synaps chemicznych [10]. Na poziomie dużych grup neuronów synapsa pełni funkcję mikroukładu integrującego działanie wielu neuronów. Rozmiary synaps są bardzo małe w porównaniu do rozmiarów całego ośrodkowego układu nerwowego. Średnica obszaru kontaktu błon prei postsynaptycznej wynosi 0.5-2μm. Tak małe rozmiary pozwalają na gęste upakowanie dużej liczby synaps w jednostkowej objętości tkanki mózgowej. Na przykład w korze wzrokowej kota 1mm3 istoty szarej zawiera średnio 50,000 neuronów. Każdy z neuronów posiada średnio 6000 synaps, co daje 300 milionów synaps w 1mm3 [11]. W korze mózgowej myszy (która obok hipokampa była przedmiotem badań opisanych w rozdziale 4 niniejszej pracy) znajduje się średnio 92,000 neuronów/mm3, i 720 milionów synaps/mm3 [12]. 18.

(19) 1.2.2. Model elektryczny synapsy chemicznej W badaniach neurobiologicznych pierwszym etapem jest zawsze opis jakościowy zjawisk, które odpowiadają za działanie sieci neuronowej. Następnie, zjawiska opisywane są w sposób ilościowy oraz tworzone są modele matematyczno-fizyczne. Rozprzestrzenienie się potencjału czynnościowego zostało opisane przez Hodgkina i Huxleya w roku 1952 [3]. Model ten, przedstawiony na Rysunku 1-6, wyjaśnia zjawisko rozprzestrzeniania się potencjału czynnościowego opisując błonę komórkową neuronu jako równoległe połączenie pojemności (reprezentującej błonę komórkową Cm) oraz trzech zmiennych konduktancji (GK, GNa, EL z szeregowo połączonymi źródłami napięciowymi EK, ENa, EL), reprezentujących dynamiczną przewodność kanałów jonowych. Model Hodgkina-Huxleya został przyjęty jako punkt startowy do rozwoju wielu innych, zarówno uproszczonych modeli służących do symulacji zachowania setek neuronów [13] jak i bardziej skomplikowanych, stosowanych w badaniach przebiegów napięć w poszczególnych elementach neuronów [5].. Rysunek 1-6: Model elektryczny błony komórkowej wg. Hodgkina-Huxleya [5].. Mniejszą uwagę poświęcano stworzeniu modelu fizycznego synapsy chemicznej, w większości analiz systemów nerwowych traktując je jako elementy przewodzące pobudzenie nerwowe w sposób progowy. Jednak synapsy chemiczne nie są elementami jednorodnymi i identycznymi. Poza podziałem na synapsy pobudzające i hamujące, podzielić można je ze względu na rodzaj przekaźnika chemicznego, jaki uwalniany jest do przestrzeni synaptycznej. Niestety w literaturze brak spójnych danych na temat wpływu różnych neuroprzekaźników na działanie synapsy i jej charakterystyki elektryczne. Najwięcej danych literaturowych dostępnych jest na temat synapsy, w której neuroprzekaźnikiem jest AMPA [14] [15] [16]. Przykładowy model fizyczny synapsy zaprezentowany został przez Savtchenko w [17]. Elektryczny schemat zastępczy synapsy przedstawiony został na Rysunku 1-7. Model uwzględnia pojemności błon komórkowych (Cm), przewodności napięciowo zależnych kanałów jonowych (Gi,GS) oraz źródła napięciowe, przywracające potencjał błonowy do stanu spoczynkowego (Ei). Zakłada się, że pierwotny transport ładunku na drodze uwalniania neuroprzekaźników chemicznych modulowany jest poprzez elektryczne sprzężenie zwrotne.. 19.

(20) Rysunek 1-7: Model elektryczny synapsy chemicznej. Widoczne jest rozdzielenie części prei postsynaptycznej. Kolor szary oznacza akson, linie przerywane - kolbę synaptyczną [17].. Innymi słowy, zmiany napięcia w danym fragmencie synapsy powodują modyfikację działania kanałów jonowych we fragmentach, do których potencjał czynnościowy dotarł wcześniej. Model ten zakłada więc przesyłanie sygnału na sposób chemiczny modyfikowany elektrycznym sprzężeniem zwrotnym. Model ten tłumaczy różnice pomiędzy kształtami przebiegów wewnątrz i zewnątrzkomórkowych mierzonych na błonie komórkowej synaps jako wynik elektrycznego sprzężenia zwrotnego pomiędzy ulegającymi sukcesywnej depolaryzacji fragmentami błony komórkowej. Elektryczne sprzężenie zwrotne może też modyfikować przewodność kanałów Ca2+, i wypływ jonów Ca2+ do przestrzeni międzysynaptycznej, zwiększając prawdopodobieństwo wystąpienia wtórnego potencjału czynnościowego. Akson, oznaczony kolorem szarym, zawiera napięciowo-zależną konduktancję Gia i pojemność Cma, odseparowaną od właściwej synapsy rezystancją Ra. Część presynaptyczna podzielona jest na 2 obszary: graniczny pomiędzy aksonem i kolbą synaptyczną (Gi1, Ei1, Cm1) oraz reprezentujący błonę presynaptyczną (Gi2, Ei2, Cm2). Oba obszary części presynaptycznej zawierają napięciowo zależne kanały jonowe o charakterystycznych przewodnościach Gi i potencjałach spoczynkowych Ei. Indeks „i” oznacza jony Na, K, Ca. W stanie spoczynkowym potencjał transbłonowy oraz pojemność błony w obszarze przestrzeni synaptycznej różni się od potencjału i pojemności błony komórkowej aksonu. Część postsynaptyczną można przedstawić jako fragment błony komórkowej o całkowitej pojemności Cm3 wraz z przewodnością kanałów jonowych GS. Zarówno błona presynaptyczna, jak i postsynaptyczna reprezentują pewien układ równoległego połączenia rezystancji R i pojemności C, który charakteryzuje się wielkością zwaną stałą czasową .. 20.

(21) 1.3. Budowa mózgu myszy ze szczególnym uwzględnieniem hipokampa. W części badawczej niniejszej rozprawy (rozdziały 4. i 5.) zaprezentowane zostały metody oraz wyniki analizy połączeń funkcjonalnych wycinka mózgu mysz. Z tego względu celowe jest omówienie budowy mózgu tego zwierzęcia, ze szczególnym zwróceniem uwagi na budowę hipokampa. Budowa anatomiczna i histologiczna hipokampa, struktura jego połączeń z innymi częściami mózgu jest obecnie bardzo dobrze poznana [10]. Również preferowane kierunki przesyłania potencjałów czynnościowych pomiędzy poszczególnymi obszarami zostały szczegółowo zbadane dzięki eksperymentom z użyciem elektrod wkłuwanych. To czyni hipokamp szczególnie interesującym obiektem ze względu na możliwość odniesienia wyników z eksperymentów z użyciem matrycy mikroelektrod, pozwalających na rejestrację aktywności dziesiątek, a nawet setek neuronów, do jego budowy anatomicznej. Hipokamp stanowi też dobry punkt startowy dla badań tej struktury pod kątem poszukiwania połączeń funkcjonalnych pomiędzy pojedynczymi neuronami, dzięki znajomości kierunków przesyłania potencjałów czynnościowych pomiędzy poszczególnymi jego strukturami anatomicznymi. W badaniach połączeń funkcjonalnych mózgu używany był szczep wsobny myszy o zabarwieniu czarnym C57bl/6 (ang. Black 6).. 1.3.1. Budowa mózgu myszy Schematyczny obraz mózgu myszy przedstawiony został na Rysunku 1-8. Ponieważ badaniu aktywności elektrycznej poddawane były tylko hipokamp oraz kora mózgowa, szczegółowe omówienie wszystkich elementów mózgu wykraczałoby poza ramy tej pracy.. Rysunek 1-8: Schemat mózgu myszy z przekrojem kory dla uwidocznienia położenia hipokampa [10].. Hipokamp jest strukturą parzystą (występującą w lewej i w prawej półkuli) stanowi część systemu limbicznego. Umiejscowiony jest pod korą mózgową i ma kształt przypominający „rogal” (u człowieka kształt porównywany jest do konika morskiego). W przekroju, hipokamp jest łatwo rozróżnialną strukturą zarówno na poziomie obserwacji mikroskopowej wycinka, jak również obrazu histologicznego. Hipokamp ma bardzo wyraźną, warstwową strukturę. Ciała neuronów oraz obszary połączeń synaptycznych zorganizowane są w odrębnych warstwach. Hipokamp jest elementem grupy struktur należących do układu limbicznego zwaną formacją hipokampa, na którą składają się: zakręt zębaty (DG – Dentate Gyrus), hipokamp, podpora (Subiculum), przedpodpora (Presubiculum), przypodpora (Parasubiculum), kora (stara) węchowa (Entorhinal Cortex). Zakręt zębaty, hipokamp i podpora posiadają jedną warstwę 21.

(22) neuronów oraz ubogą w neurony lub bezkomórkową warstwę poniżej oraz powyżej warstwy neuronów. Pozostałe elementy formacji hipokampa zbudowane są z kilku warstw komórek.. 1.3.2. Hipokamp – budowa morfologiczna i występujące w nim typy neuronów Rysunek 1-9 przedstawia przekrój poprzeczny hipokampa. Ciała komórek nerwowych zabarwione zostały na czarno. Obszary niezabarwione zawierają dendryty neuronów tworzących hipokamp oraz aksony wchodzące oraz wychodzące z omawianego obszaru. Hipokamp dzieli się na trzy sekcje: CA1, CA2 i CA3. Budowa histologiczna hipokampa ma charakter warstwowy. Wyróżnia się 3 warstwy; pierwsza tworzona przez dendryty komórek piramidalnych zwana jest warstwą początkową (o – stratum oriens). Drugą jest warstwa komórek piramidalnych (p – pyramidal cell layer), w której zlokalizowane są ciała komórek piramidalnych. Ostatnią, trzecią, jest warstwa promienista (r – stratum radiatum), w której znajdują się dendryty wierzchołkowe komórek piramidalnych. Na Rysunku 1-9 zaznaczone zostały również podpora wzgórka (S - subiculum), przedpodpora (PrS – Presubiculum), kora (stara) węchowa (EC - Entorhinal Cortex). Głównym szlakiem włókien nerwowych jest strzępek hipokampa (f – fimbria). Wiązka kątowa (ab – angular bundle) to obszar włókien nerwowych perforujących, w którym włókna biegną od kory węchowej do różnych obszarów hipokampa. W obszarze zakrętu zębatego najważniejsze (i najgęściej występujące) są komórki ziarniste, natomiast w obszarze hipokampa występują głównie neurony piramidalne. Warstwa komórek piramidalnych podzielona została ze względu na rozmiary i występowanie tego rodzaju komórek (CA1, CA2, CA3). Komórki ziarniste mają małe, okrągłe ciała o średnicy ok. 10μm. W przekroju poprzecznym hipokampa zorganizowane są po 4-6 ciał komórek w warstwie „g” (Rysunek 1-9). Dendryty komórek ziarnistych ułożone są poprzecznie w stosunku do warstwy komórek „g”, swoje zakończenia mają w warstwie molekularnej „m”, skąd odbierają impulsy nerwowe pochodzące z różnych źródeł. Ponieważ dendryty komórek ziarnistych wyrastają tylko w kierunku od warstwy „g” do „m”, komórki ziarniste uważane są za neurony jednokierunkowe. Aksony tych komórek wyrastają w kierunku warstwy komórek polimorficznych. Komórki polimorficzne, jak sama nazwa wskazuje, są komórkami różnych typów, ale impulsy nerwowe przesyłają tylko do innych części zakrętu zębatego. Włókna mszyste (ang. mossy fibers), czyli aksony komórek mszystych wychodzą z warstwy komórek polimorficznych i łączą się z obszarem CA3. Rozłożenie przestrzenne dendrytów przedstawione zostało na Rysunku 1-10.. 22.

(23) Rysunek 1-9: Przekrój poprzeczny hipokampu myszy ukazujący warstwowe ułożenie komórek (strona wewnętrzna z lewej, zewnętrzna z prawej, góra obrazka – kierunek „na zewnątrz” czaszki). m – warstwa molekularna, g – komórki ziarniste , pl – komórki polimorficzne, p – warstwa komórek piramidalnych, f – strzępek hipokampa, ab – wiązka kątowa [18].. W warstwie komórek piramidalnych znaleźć można od 3 do 6 ciał komórek mszystych. Neurony te wykształciły drzewa dendrytów prostopadłe do warstwy komórek w obu kierunkach, stąd zwane są też komórkami dwukierunkowymi. Dendryty wyrastające ze szczytów komórek są dłuższe niż wyrastające z podstaw komórek – szczyty skierowane są w kierunku „do wewnątrz” hipokampu.. Rysunek 1-10: Rycina ukazująca kształt i ilość kluczowych neuronów w zakręcie zębatym (DG) i hipokampie (CA3, CA1). Liczby oznaczają całkowitą długość dendrytów komórek ziarnistych (w obszarze DG) oraz częściowe długości drzew dendrytów w poszczególnych obszarach hipokampu. Wymiary podane w μm. [10].. Obszar CA1 odróżnia się od CA3 brakiem połączeń synaptycznych ze strony komórek mszystych (z obszaru „pl”), w obszarze CA3 ciała komórek piramidalnych są większe niż w CA1. Istnieje pewien wąski obszar pomiędzy CA1 i CA3, nazywany CA2, w którym podobnie jak w CA1 nie występują połączenia z obszarem „pl”, ale rozmiary ciała 23.

(24) neuronów piramidalnych są stosunkowo duże (jak w CA3) [19]. Ze względu na fakt, że obszar CA2 jest trudny do rozpoznania w obserwacji mikroskopem optycznym, jego oznaczenie jest najczęściej pomijane. Oprócz neuronów piramidalnych oraz ziarnistych ważną rolę pełnią też interneurony neurony pośredniczące (z ang. inteneurons). Interneuronami nazywa się neurony o ograniczonym (lokalnym) zasięgu aksonów.. 1.3.3. Interneurony i ich rola w działaniu hipokampa W obrębie hipokampa wyróżnia się wiele podtypów interneuronów, jednak wszystkie cechuje okrągłe ciało komórki, lokalny zasięg przesyłania sygnałów oraz transmisja synaptyczna, w której przekaźnikiem chemicznym jest kwas gamma aminomasłowy (GABA): interneurony są zatem komórkami o działaniu hamującym [20]. W zakręcie hipokampa najczęściej występującym typem jest neuron piramidalny-koszyczkowy, ciała tych neuronów zlokalizowane są na granicy warstwy komórek ziarnistych i warstwy komórek polimorficznych. Aksony tych komórek unerwiają ciała komórek ziarnistych. Wyróżnić można co najmniej 5 rodzajów interneuronów koszyczkowych. Do interneuronów zaliczamy również neurony mszyste – w odróżnieniu od pozostałych, są to neurony pobudzające. Ich aksony rozciągają się na długie odległości od warstwy polimorficznej we wszystkich kierunkach hipokampa. Ze względu na sposób połączenia synaptycznego z komórkami piramidalnymi można wyróżnić 3 klasy interneuronów [10]:  Akso-aksonalny – synapsy jego aksonów zlokalizowane są w początkowych odcinkach aksonów innych neuronów (głównie komórek piramidalnych).  Neurony koszyczkowe – ich synapsy połączone są z ciałami komórek piramidalnych. Zakończenia aksonów posiadają wiele synaps, które tworzą „koszyczek” wokół ciała komórki piramidalnej.  Neurony dwuwarstwowe – aksony tych komórek łączą się synaptycznie z dendrytami komórek piramidalnych. Połączenia synaptyczne występują zarówno na dendrytach od strony zewnętrznej, jak i wewnętrznej hipokampa. W kolejnych rozdziałach przedstawiona zostanie analiza aktywności komórek nerwowych hipokampa pozwalająca na zlokalizowanie interneuronów, jednak wskazanie poszczególnych podtypów nie będzie możliwe. Z tego względu bardziej szczegółowy ich podział nie zostanie przedstawiony. W hipokampie interneurony stanowią tylko 10% populacji wszystkich komórek, co może sugerować, że nie pełnią one znaczącej roli w działaniu sieci neuronowej. W praktyce nie jest to prawdą. Na podstawie obserwacji mikroskopowych wiadomo, że pojedyncza komórka piramidalna łączy się z 100 interneuronami, natomiast każdy interneuron łączy się aż z 1000-3000 komórek piramidalnych. Komórki piramidalne i ziarniste mają charakter pobudzający, natomiast interneurony hamujący. Wypływa stąd wniosek, że pełnią one funkcję stabilizującą, komunikacyjną oraz ujemnego sprzężenia zwrotnego. Hamowanie aktywności nerwowej poprzez ujemne sprzężenie zwrotne odbywać się może szybciej niż trwa okres refrakcji komórek wzbudzających. Interneurony wydają się też odgrywać krytyczną rolę we wzbudzaniu i utrzymywaniu oscylacji sieci neuronowej w zakresie fal theta (10Hz), gamma (40-100Hz) i ultrawysokich częstotliwości (200Hz) [20]. Rola interneuronów jako neuronów o działaniu hamującym w utrzymywaniu oscylacji będzie w dalszej części pracy tematem szerszej dyskusji opartej na wynikach zebranych przez autora rozprawy. 24.

(25) 1.3.4. Budowa hipokampa a połączenia funkcjonalne z innymi obszarami mózgu Jeśli hipokamp potraktować jako sieć neuronową podzieloną na fragmenty zgodnie z budową morfologiczną, można określić „preferowany” kierunek przewodzenia nerwowego od jednego obszaru do drugiego. Schemat omawianych połączeń, zaproponowany przez Andersena [21], przedstawiony został na Rysunku 1-11. Dla przejrzystości, kora węchowa rozważana jest jako punkt startowy ze względu na to, iż większość informacji „zmysłowych” ze świata zewnętrznego docierająca do hipokampa przepływa właśnie przez korę węchową (starą). Impulsy nerwowe od narządów zmysłów docierają do hipokampa poprzez dwa równoległe szlaki:  korę przynosową (z ang. perirhinal cortex)  korę zanosową (z ang. postrhinal cortex) Te obszary mózgu uwalniają do kory węchowej informację wyższego rzędu, czyli łączącą impulsy odbierane przez wiele zmysłów. Sygnały przesyłane do kory węchowej mają charakter pobudzający [22]. Neurony zlokalizowane w II warstwie kory węchowej przesyłają impulsy poprzez aksony perforujące (przechodzące bez połączeń synaptycznych) przez podporę (S) i kończące się w zakręcie zębatym oraz obszarze CA3 hipokampa. Neurony zlokalizowane w warstwie III kory węchowej nie posiadają połączeń. Rysunek 1-11: Diagram połączeń formacji hipokampu mózgu oraz wybranych struktur kory mózgowej rodziny myszowatych. Ukazane zostały równoległe i szeregowe szlaki transmisji impulsów nerwowych. RSP Ctx – retrospinal cortex, Par/Oc Ctx. – parietal/occipal cortices, pozostałe oznaczenia jak na Rysunku 1-9. [21].. synaptycznych z zakrętem zębatym ani obszarem CA3, występuje natomiast aktywność od warstwy III do obszaru CA1 i podpory. Transfer impulsów (informacji) nie odbywa się warstwowo, lecz zgodnie z podziałem morfologicznym. Zakręt hipokampa (DG) daje początek komórkom mszystym, które poprzez aksony przesyłają impulsy nerwowe do dendrytów komórek piramidalnych obszaru CA3. Komórki ziarniste zakrętu hipokampa łączą się synaptycznie z neuronami warstwy polimorficznej – neuronami mszystymi, które są połączone z innymi warstwami zakrętu zębatego. Komórki piramidalne obszaru CA3 przesyłają impulsy do pozostałych warstw w CA3 oraz do obszaru CA1. Komórki piramidalne z obszaru CA1 mogą wzbudzać obszar podpory i głębokie warstwy kory węchowej. Również neurony podpory mogą wzbudzać głębokie warstwy kory węchowej. Głębokie warstwy kory węchowej mogą przesyłać impulsy w drugą stronę – do obszarów 25.

(26) kory, z których może pochodzić pierwotne pobudzenie. W ten sposób, informacja wpływająca do kory węchowej z innego fragmentu kory może przepłynąć cały obszar hipokampa przez wyżej opisane szlaki i ostatecznie wrócić do obszaru kory, z którego pochodziła. Przedstawiona w niniejszym podrozdziale jednokierunkowa transmisja impulsów znana z eksperymentów wykonywanych techniką elektrod wkłuwanych będzie stanowić referencję dla badań kierunku połączeń synaptycznych przedstawionych w rozdziale 4, wykonywanych przy użyciu matrycy mikroelektrod.. 1.4. Obrazowanie elektrofizjologiczne, pole potencjału wokół komórki nerwowej. Rejestracja zewnątrzkomórkowa potencjału czynnościowego stanowi współcześnie jedną z podstawowych metod w badaniach aktywności elektrycznej żywego mózgu. Zarejestrowane zmiany napięcia zewnątrzkomórkowego pozwalają na określenie, czy w komórce wystąpił potencjał czynnościowy. Jeśli wartość napięcia przekroczyła pewien próg, oznacza to wystąpienie potencjału czynnościowego. Zakłada się przy tym, że kształt zarejestrowanego potencjału nie niesie ze sobą żadnej informacji. W przypadku pojedynczego potencjału czynnościowego założenie to jest słuszne ze względu na niski stosunek sygnału do szumu dla aparatury używanej podczas rejestracji. Uśrednienie wielu zarejestrowanych przebiegów napięcia pozwala znacząco zredukować wpływ szumu na zarejestrowany kształt. Jeśli rejestracja napięcia odbywa się z wystarczająco wysoką rozdzielczością czasową (poniżej 1ms, np. 50us.), uśrednione przebiegi napięcia pozwalają wyciągać wnioski na temat własności badanego neuronu. Charakterystyczne cechy zarejestrowanego potencjału mogą być wykorzystane do rozróżniania różnych klas neuronów [23] a także separowania poszczególnych neuronów należących do jednej klasy [24]. Istnieje niewiele źródeł literaturowych, w których autorzy próbowali przypisać znaczenie biologiczne kształtom uśrednionych przebiegów napięcia zarejestrowanego za pomocą elektrod zewnątrzkomórkowych. Jedną z najciekawszych prac jest [5], w której autorzy pokazali zgodność wyników eksperymentalnych z modelowaniem komputerowym opartym o model Hodgkina-Huxley’a. Zapis aktywności elektrycznej neuronów, uzyskany za pomocą 512-elektrodowego systemu do rejestracji potencjałów zewnątrzkomórkowych (omówionego w rozdziale 2), umożliwia uzyskiwanie obrazów elektrofizjologicznych, których precyzja pozwala na użycie ich w procesie rozróżniania typów komórek nerwowych. Obrazy elektrofizjologiczne używane są również w procesie usuwania duplikatów zidentyfikowanych neuronów (rozdział 4.2). W rejestracji potencjałów czynnościowych za pomocą elektrod zewnątrzkomórkowych istotne jest zrozumienie, jakie zjawiska zachodzą na drodze od błony komórkowej do elektrody. Płyn zewnątrzkomórkowy otaczający neurony można przybliżyć jako środowisko homogeniczne, w którym efekty pojemnościowe mogą zostać pominięte w zakresie częstotliwości 1-3000Hz. Można zatem opisać środowisko zewnątrzkomórkowe używając tylko przewodności omowej [25], a potencjał w przestrzeni zewnątrzkomórkowej wyrazić równaniem Laplace’a: (1-1). gdzie oznacza potencjał zewnątrzkomórkowy. Przyjmując granicę rozwiązania powyższego równania jako. 26.

(27) ( ⁄ ). (1-2). gdzie Јm jest gęstością prądu transbłonowego a jest rezystywnością ośrodka otaczającego komórkę, dla źródła punktowego prądu o amplitudzie І w nieograniczonej objętości, rozwiązanie równania (1-1) wynika wprost z prawa Coulomba: ⁄(. ). (1-3). gdzie І to prąd ze źródła punktowego, r – odległość od źródła do miejsca pomiaru. W rzeczywistych neuronach źródła prądu rozłożone są wzdłuż aksonu (dendrytu) o kształcie zbliżonym do cylindra o wysokim stosunku długości do średnicy. Można obliczyć superpozycję wielu źródeł, jednak w praktyce używa się przybliżenia źródła liniowego (z ang. Line Source Approximation) [26]. Zakładając liniowy rozkład prądu wzdłuż aksonu, równanie potencjału we współrzędnych sferycznych ma postać: (. ). ( ⁄. )∫ ( ⁄. (. √ ). ). |[√. ] ⁄[ √. gdzie r to promień, h – odległość od końca aksonu, aksonu.. (1-4). ]| to odległość od początku. Przybliżenie źródła liniowego jest poprawne poza obszarem bardzo blisko aksonu. W przypadku eksperymentów z rejestracją zewnątrzkomórkową warunek ten jest zazwyczaj spełniony, gdyż odległość elektrody od neuronu wynosi typowo co najmniej kilkadziesiąt mikrometrów. Model źródła liniowego zakłada, że płyn zewnątrzkomórkowy jest homogeniczny. Jednak dokładne pomiary przedstawione w [27] wskazują, że w obszarze CA1 warstwa komórek piramidalnych ma rezystancję dwukrotnie większą niż otaczające warstwa promienista i warstwa początkowa (oporność właściwa odpowiednio = 640, 260, 290 Ωcm). Co więcej, rezystywność może wzrosnąć o 50% w okresie wysokiej aktywności neuronów. Dla rzeczywistego odwzorowania dynamicznych zmian napięcia w poprzek błony komórkowej, modele symulacyjne bazujące na modelu Hodgkin-Huxley’a uwzględniają kilkanaście rodzajów napięciowo-zależnych kanałów jonowych transportujących jony Na+, K+, Ca2+. Kanały transportujące poszczególne jony dzielą się na podklasy, które występują z różnym zagęszczeniem w różnych częściach neuronu. Nierównomierny rozkład przestrzenny kanałów jonowych danego typu powoduje różnice kształtów przebiegów napięć zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych w zależności od ich lokalnego zagęszczenia.. 27.

(28) 2. SYSTEMY. DO. REJESTRACJI. AKTYWNOŚCI. ELEKTRYCZNEJ. KULTUR. NEURONOWYCH. WYKORZYSTUJĄCE MATRYCE MIKROELEKTROD. W tym rozdziale opisane zostaną systemy do rejestracji aktywności elektrycznej kultur neuronowych oraz podstawy rejestracji napięć błonowych z użyciem elektrod zewnątrzkomórkowych. Jako przykład posłuży system zbudowany w oparciu o układy scalone zaprojektowane w Zakładzie Elektroniki Jądrowej Wydziału Fizyki i Informatyki Stosowanej AGH w Krakowie (Obecnie Katedra Oddziaływań i Detekcji Cząstek). System ten używany jest od 2008 roku przez grupę neurobiologów w Instytucie Fizyki Cząstek Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz oraz Instytucie Salka w La Jola, Kalifornia, USA do badań siatkówki oka, wycinków mózgu myszy bezpośrednio po ekstrakcji (ang. Accute Slices), jak również po hodowli w inkubatorach (ang. Cultured Slices). Celem badań jest rozwijanie technik rejestracji, preparatyki tkanek oraz poszukiwanie powtarzalnych wzorców połączeń (ang. connectivity patterns) między neuronami. Oprócz układów scalonych do odczytu aktywności i stymulacji elektrycznej neuronów, aby rejestracja była możliwa, potrzebny jest interfejs pomiędzy elektroniką i komórkami nerwowymi. Tą rolę pełnią różnego rodzaju matryce mikroelektrod i mikroigieł. W obecnie stosowanym systemie jest to matryca 512 płaskich elektrod. Omówiona zostanie budowa, możliwości oraz ograniczenia w. w. systemu a także specyfikacja, jaką powinien spełniać nowy, obecnie rozwijany układ scalony, który zastąpić ma obecnie stosowane układy. Powinien on posiadać rozszerzoną funkcjonalność, przede wszystkim poprzez poszerzenie pasma częstotliwości, w której możliwa jest rejestracja oraz zwiększenie rozdzielczości przetwornika cyfrowo-analogowego wykorzystywanego do generowania prądów (napięć) stymulacyjnych. Przedstawiona zostanie dyskusja wymagań projektowych dla poszczególnych modułów funkcjonalnych, których wykonane przez autora rozprawy projekty i testy zostały przedstawione w rozdziale 3.. 2.1. Rola matryc mikroelektrod w rejestracji aktywności komórek nerwowych. Rejestracja wewnątrz i zewnątrzkomórkowa Większość podręczników na temat neurobiologii opisuje przebiegi napięć na błonach komórkowych neuronów z perspektywy rejestracji za pomocą elektrod wewnątrzkomórkowych. Technika wkłuwania elektrod do wnętrza komórki (patch clamp) stanowiła przez wiele dziesięcioleci podstawową metodę rejestracji aktywności neuronów. Naukowcy zdawali sobie sprawę z konieczności rejestracji potencjałów z wielu komórek, jednak główne ograniczenie stanowił brak elektroniki umożliwiającej wzmacnianie oraz rejestrację sygnału pochodzącego z wielu źródeł jednocześnie. Jedyną możliwością realizacji tego celu było używanie wielu elektrod szklanych wkłuwanych w połączone ze sobą neurony i rejestracja za pomocą pojedynczych wzmacniaczy. Konieczność zastosowania pomocniczego sprzętu pozycjonującego sprawia, że liczba elektrod wkłuwanych stosowanych w eksperymencie jest bardzo ograniczona i zwykle nie przekracza kilkunastu. Alternatywą jest rejestracja zewnątrzkomórkowa za pomocą tego samego typu elektrod szklanych. Pozwala to jednak tylko na nieznaczny wzrost liczby elektrod, wymuszając rejestrację potencjałów o niższych amplitudach. Matrycy elektrod zewnątrzkomórkowych wytworzonej z niklu i złota na podłożu szklanym po raz pierwszy użyto w 1972 roku [28]. Następnym etapem była matryca 16 elektrod na podłożu szklanym wykorzystująca napylane ścieżki tytanowe pokryte złotem jako materiał przewodzący. Przełomem było wytworzenie metodą fotolitografii, matrycy 28.

(29) na podłożu krzemowym ze ścieżkami z tlenku indu i cyny [29]. Mikrofotografia współcześnie stosowanej matrycy płaskiej 512 mikroelektrod o wysokiej gęstości przedstawiona została na Rysunku 2-1. Matryca ta jest częścią systemu używanego przez autora rozprawy do rejestracji aktywności wycinków mózgu myszy, których analiza zostanie przedstawiona w Rozdziale 4.. Rysunek 2-1: Mikrofotografia matrycy 512 mikroelektrod o wymiarach ~1mm x 2mm, odległości pomiędzy elektrodami wynoszą 60μm.. Elektroda zewnątrzkomórkowa może służyć do rejestracji zmian potencjałów błonowych zarówno przyłożona bezpośrednio do ciała komórki (aksonu, dendrytu), jak również znajdując się w pewnej odległości od niego. Jeżeli elektroda znajduje się w odległości porównywalnej lub większej od rozmiarów komórki, mówimy o rejestracji napięcia w polu dalekim. Źródło sygnału można wówczas utożsamić ze źródłem punktowym znajdującym się wewnątrz komórki (patrz rozdział 1.4). Schemat zastępczy interfejsu błony komórkowej z mikroelektrodą oraz elektroniką odczytu przedstawiony został na Rysunku 2-2.. Rysunek 2-2: Schemat zastępczy dla wyznaczenia parametrów sygnału rejestrowanego przez mikroelektrodę zewnątrzkomórkową: Ub – napięcie błonowe, Cm, Gm, - pojemność i przewodność błony komórkowej, R1 – wartość rezystancji roztworu między komórką a powierzchnią półsfery o promieniu równym odległości komórka-elektroda, R2 – wartość rezystancji roztworu między powierzchnią półsfery a elektrodą referencyjną, Z el -impedancja elektrody, Cwej, Rwej – pojemność i rezystancja wejściowa wzmacniacza.. Sygnał rejestrowany przez mikroelektrodę można przedstawić jako sygnał pochodzący od źródła napięciowego Ub znajdującego się wewnątrz komórki. Elektryczne własności błony komórkowej reprezentują dwa elementy: całkowita pojemność błony komórkowej Cm oraz zmienna w czasie przewodność jonowa Gm. Wartość Cm w przypadku komórek hipokampa myszy oszacować można na 100pF [30]. Przyjmując jednorodność medium, w którym rozpływa się ładunek, można założyć, że ładunek ze źródła Ub rozchodzi się równomiernie we wszystkich kierunkach. Wokół źródła napięcia pole potencjału przyjmuje postać, w której powierzchnie ekwipotencjalne mają kształt sferyczny. Niech r oznacza promień sfery równy odległości między źródłem potencjału Ub i powierzchnią elektrody detekcyjnej - wówczas oporności R1 i R2 oznaczają rezystancje płynu zewnątrzkomórkowego wewnątrz i na zewnątrz sfery o promieniu r. Potencjał rejestrowany na elektrodzie jest równy spadkowi napięcia na rezystorze R2, przy 29.