Materiały i metody

Badany preparat farmaceutyczny

Przedmiotem badań był preparat farmaceutycz­

ny w postaci tabletek zawierający odpowiednio w jednej tabletce 500 mg paracetamolu oraz 65 mg kofeiny. Substancjami obecnymi w badanym prepa­

racie obok tych dwóch składników biologicznie ak­

tywnych były m.in.: skrobia żelowana, skrobia ku­

kurydziana, powidon, talk oraz kwas stearynowy.

W celu uzyskania do badań ekstraktu analizo­

wanego preparatu farmaceutycznego 10 tabletek preparatu umieszczano w pojemniku stanowiącym część zestawu dyspergującego/homogenizującego IKA Ultra­Turrax^® Tube. Pojemnik ten zaopatrzo­

ny był w siedem kulek metalowych, dzięki któ­

rym tabletki poddano rozdrobnieniu przez 15 mi­

nut, przy obrotach 8000/min. Ze sproszkowanej masy odważono ilość odpowiadającą masie 1 ta­

bletki. Następnie do pojemnika zawierającego tę sproszkowaną masę dodawano 10 ml bezwodnego etanolu (99,8%) i dalej homogenizowano roztwór przez 15 minut, przy obrotach urządzenia równych 5000/min. Tak otrzymany roztwór przesączano da­

lej do kolby miarowej o pojemności 50 ml i uzupeł­

niano etanolem bezwodnym do żądanej objętości.

Z otrzymanego ekstraktu na drodze rozcieńczenia przygotowano roztwór do analizy, zawierający od­

powiednio: 1 mg/ml paracetamolu i 0,13 mg/ml kofeiny, który nanoszono na płytki chromatogra­

ficzne w ilości 5 µl.

Roztwory wzorcowe badanego paracetamolu oraz kofeiny

Wyjściowe roztwory wzorcowe o stężeniu 5 mg/

ml paracetamolu i kofeiny sporządzono odpowied­

nio przez rozpuszczenie tych substancji w bezwod­

nym etanolu (99,8%, cz.d.a.). Z tak przygotowa­

nych roztworów wzorcowych wykonano szereg rozcieńczeń dla obu badanych substancji leczni­

czych, w zakresach: od 5,0 do 0,2 mg/ml, tj. 5,0;

4,0; 3,0; 2,0; 1,0; 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4;

0,3 oraz 0,2 mg/ml. Przygotowane w ten sposób roztwory wzorcowe nanoszono podczas badań na płytki chromatograficzne przy użyciu mikropipet w ilości 5 µl.

Warunki analizy chromatograficznej TLC z densytometrią

W badaniach wykorzystano płytki chromato­

graficzne pokryte żelem krzemionkowym 60F₂₅₄ ze strefą koncentracji wyprodukowane przez firmę Merck (Niemcy, Art. 1.05583). Płytki te były ak­

tywowane przed analizą chromatograficzną przez 30 minut w temperaturze 110

°

C w suszarce. Roz­

twory wzorca paracetamolu oraz kofeiny nanoszo­

no na płytki za pomocą mikropipet o pojemności 5 µl. Płytki rozwijano na wysokość 7 cm przy użyciu 50 mililitrów fazy ruchomej, w skład której wcho­

dziły: chloroform­aceton­amoniak (25%) w sto­

sunku objętościowym 39,6:9,9:0,5. Przed analizą komora chromatograficzna wysycana była fazą ru­

chomą przez 20 minut. Po rozwinięciu płytki były suszone przez 24 godziny w temperaturze pokojowej pod wyciągiem i poddawane następnie analizie den­

sytometrycznej oraz spektrodensytometrycznej przy użyciu densytometru TLC 3 firmy Camag z oprogra­

mowaniem winCATS 1.4.2. Źródłem promieniowa­

nia była lampa deuterowa. Analizę spektrodensyto­

metryczną przeprowadzono w zakresie długości fali 200–400 nm. Natomiast skanowanie densytome­

tryczne paracetamolu i kofeiny odbywało się przy optymalnych dla tych związków długościach fali, tj.

λ=250 nm (paracetamol) i λ=275 nm (kofeina). Szyb­

kość skanowania wynosiła 20 mm/s, a rozdzielczość 100 µm/krok. Rozmiar szczeliny to 10,00×0,40 mm.

Walidacja opracowanej metody TLC w połączeniu z densytometrią

W celu zweryfikowania, czy proponowana w ni­

niejszej pracy metoda TLC w połączeniu z densy­

tometrią jest wiarygodna i może być stosowana do oznaczania paracetamolu obok kofeiny w pre­

paracie farmaceutycznym w postaci tabletek, do­

konano walidacji powyższej metody analitycznej zgodnie z wytycznymi ICH (Międzynarodowej Kon­

ferencji Harmonizacji Wymagań dla Leków) oraz innych przewodników poświęconych procedurom walidacji metod analitycznych [28, 29]. Na drodze

przeprowadzonej walidacji scharakteryzowano pro­

ponowaną metodę TLC za pomocą takich parame­

trów, jak: specyficzność (selektywność), dokład­

ność, precyzja (wewnątrzdniowa i międzydniowa), liniowość, granica wykrywalności (LOD), granica oznaczalności (LOQ) oraz odporność.

Specyficzność (selektywność) metody

Ocena specyficzności (selektywności) metody została przeprowadzona na drodze doboru odpo­

wiedniego nośnika (płytek chromatograficznych) oraz fazy ruchomej umożliwiających rozdziele­

nie paracetamolu od jego substancji pokrewnych (4­chloroacetanilidu, p­aminofenolu) oraz od ko­

feiny. Do oceny efektu rozdziału mieszaniny o skła­

dzie: paracetamol, 4­chloroacetanilid, p­aminofe­

nol i kofeina posłużyły niżej wymienione parametry R_S i ∆R_f wyznaczone w oparciu o uzyskany densyto­

gram dla badanej mieszaniny związków.

Współczynnik rozdzielczości (R_S) obliczono ze wzoru:

gdzie: d – dystans pomiędzy środkami dwóch pasm chromatograficznych, w₁,w₂ – szerokość pasm chromatograficznych wyznaczona przy podstawie.

W celu obliczenia współczynnika rozdziału ∆R_f zastosowano wzór:

∆R_f=R_f2­R_f1 (2)

gdzie: R_f1 i R_f2 – współczynniki opóźnienia analizo­

wanych związków, R_f2 >R_f1.

Liniowość metody i jej zakres

Do oceny liniowości zastosowano roztwory wzorców badanych substancji, tj. paracetamolu i kofeiny w bezwodnym etanolu, które sporządzo­

no w siedmiu różnych stężeniach:

­ paracetamol: 0,15; 0,30; 0,60; 0,90; 1,20;

1,50 oraz 1,80 mg/ml;

­ kofeina: 0,03; 0,06; 0,09; 0,12; 0,15; 0,18 oraz 0,21 mg/ml.

Pięć mikrolitrów każdego z tych roztworów na­

noszono mikropipetami na płytki chromatogra­

ficzne i rozwijano w komorze chromatograficznej wysyconej fazą ruchomą o składzie: chloroform­

­aceton­amoniak (25%): 39,6:9,9:0,5, v/v/v.

W każdym przypadku dokonywano pomiaru po­

wierzchni pasm chromatograficznych A [AU]. Ana­

lizę wykonano dla każdego roztworu sześciokrotnie.

Dokładność metody

Pomiar odzysku odpowiednio paraceta­

molu i kofeiny posłużył do oceny dokładności

opracowanej metody TLC z densytometrią. Do­

konano tego, stosując metodę dodatku wzorca, tj.

paracetamolu oraz odpowiednio kofeiny do pod­

dawanego badaniom preparatu (sproszkowanych tabletek). Do sproszkowanej masy tabletek ekwi­

walent 50 mg paracetamolu dodawano wzorca w ilości 50%, 100% oraz 150%, czyli 25 mg, 50 mg oraz 100 mg. Następnie odważoną masę ze wzorcem przenoszono do pojemnika stanowiącego wyposa­

żenie stosowanego urządzenia IKA Ultra­Turrax^® Tube i wytrząsano przy użyciu 10 ml bezwodne­

go etanolu (99,8%) przez 15 minut przy obrotach urządzenia równych 5000/min. Uzyskany ekstrakt przesączano i dalej rozcieńczano etanolem bez­

wodnym, uzyskując do dalszych badań roztwory o stężeniu paracetamolu: 0,75; 1,00 i 1,50 mg/ml.

Podobnie jak w procedurze dotyczącej omówio­

nego powyżej paracetamolu, w przypadku bada­

nia odzysku kofeiny masę sproszkowanych table­

tek odpowiadającą 5 mg tego związku umieszczano w pojemniku urządzenia IKA Ultra­Turrax^® Tube i dodawano do niej wzorca w ilości 2,5 mg kofe­

iny, 5 mg oraz 10 mg, co stanowiło 50%, 100%

i 150% w stosunku do jej ilości początkowej. Na­

stępnie próbki preparatu ze wzorcami kofeiny pod­

dawano procesowi wytrząsania przy użyciu 10 ml bezwodnego etanolu (99,8%) przez 15 minut, przy obrotach urządzenia równych 5000/min. Uzy­

skane ekstrakty przesączano i dalej rozcieńcza­

no etanolem bezwodnym, uzyskując do dalszych badań roztwory o stężeniu paracetamolu: 0,075;

0,100 i 0,150 mg/ml. Otrzymane ekstrakty na­

noszono na płytki chromatograficzne w ilości 5 µl.

Analizę densytometryczną tych ekstraktów wyko­

nano w sześciu powtórzeniach.

Precyzja metody

Precyzję wewnątrzdniową (intra-day precision) oraz międzydniową (inter-day precision) wyzna­

czono na drodze analizy trzech ekstraktów badane­

go preparatu o różnej zawartości paracetamolu i ko­

feiny. Dla paracetamolu wynosiły one odpowiednio:

0,20; 0;30 i 0,40 mg/ml. Z kolei dla kofeiny były to ekstrakty o stężeniu: 0,20; 0,25 i 0,30 mg/ml tej substancji.

W przypadku badania precyzji wewnątrzdnio­

wej analizę chromatograficzną i densytometryczną trzech badanych roztworów, zarówno paracetamo­

lu, jak i kofeiny, wykonywano w ciągu jednego dnia.

Natomiast precyzję międzydniową oszacowano na podstawie pomiarów powierzchni pasm chroma­

tograficznych paracetamolu i kofeiny wykonanych w ciągu 14 dni, czyli dwóch tygodni. W badaniach stosowano 5 µl roztworów obu substancji. Każ­

dy pomiar powtórzono trzykrotnie. Miarą precyzji opracowanej metody był obliczony w każdym przy­

padku współczynnik zmienności (CV,%).

Granica wykrywalności i oznaczalności (LOD i LOQ)

Granicę wykrywalności oraz oznaczalności okre­

ślono na podstawie specjalnej krzywej wzorcowej wykonanej w oparciu o pomiary densytometrycz­

ne (powierzchnię pasm chromatograficznych ba­

danego paracetamolu i kofeiny) dla odpowiednio trzech najniższych stężeń: 0,20; 0;30 i 0,40 mg/ml.

Roztwory tych substancji nanoszono na stosowa­

ne płytki chromatograficzne w ilości 5 µl. Anali­

zę powtórzono dla każdego roztworu trzykrotnie.

Parametry uzyskanej specjalnej krzywej wzorco­

wej (AU=b+ax), takie jak: szczątkowe odchyle­

nie (S), odchylenie standardowe wyrazu wolnego (S_b) oraz nachylenie krzywej wzorcowej (a) wyko­

rzystano do oszacowania LOD i LOQ obliczonych zgodnie ze wzorami 3 i 4. Zastosowane we wzo-rach 3 i 4 odchylenie standardowe (S_xy) zostało ob­

liczone w dwojaki sposób, tj. przy użyciu odchylenia standardowego wyrazu wolnego (S_b) oraz wyko­

rzystując odchylenia szczątkowego krzywej wzor­

cowej (S) [29]:

Ostatecznie, wartości LOD i LOQ zamieszczone w tabeli 1 stanowią średnią z wyników uzyskanych tymi dwiema metodami obliczeniowymi.

Odporność metody

Odporność proponowanej metody oceniono na podstawie pomiaru powierzchni pasm chromato­

graficznych badanego paracetamolu i kofeiny po do­

konaniu niewielkich zmian stosowanych warunków chromatograficznych, takich jak: czasu wysycania komory fazą ruchomą (±10 minut), drogi rozwija­

nia chromatogramów (±10 mm) oraz objętości fazy ruchomej (±10 ml).

Wyniki

Na rycinie 1 przedstawiono densytogram mie­

szaniny wzorców badanych substancji leczniczych, tj. paracetamolu (P) oraz kofeiny (C) i substan­

cji pokrywanych paracetamolu (PA) – p­amino­

fenolu oraz (CA) – 4­chloroacetanilidu, uzyskany na płytkach chromatograficznych (Art. 1.05583) rozwijanych przy użyciu fazy ruchomej: chloro­

form­aceton­amoniak (25%) w stosunku obję­

tościowym 39,6:9,9:0,5. Z kolei na rycinie 2 za­

prezentowano densytogram ekstraktu badanego preparatu otrzymany w tych optymalnych warun­

kach chromatograficznych. Ryciny 3 i 4 przedsta­

wiają spektrodensytogramy paracetamolu i kofe­

iny, tj. odpowiednio wzorca i próbki (ekstraktu badanego preparatu).

Badany parametr Wyniki

dla paracetamolu dla kofeiny

Specyficzność specyficzna specyficzna

Liniowość i zakres

Zakres liniowości [mg/plamkę] 0,75÷9,00 0,15÷1,05

Równanie liniowe AU=1831,0(±56,7) × C + 4698,9(±307,1)

n=7, r=0,998;

p<0,0001; s=427,2, F=1042,3

AU=8924,8(±209,9) × C + 948,4(±140,8) n=7; r=0,999, p<0,0001; s=166,6; F=1807,6 Granica wykrywalności (LOD) [mg/plamkę]

Granica oznaczalności (LOQ) [mg/plamkę] 0,070

0,213 0,064

0,192 Dokładność i precyzja

Dokładność (n=6) dla 50% dodanego wzorca dla 100% dodanego wzorca dla 150% dodanego wzorca

R = 98,3%; CV = 1,29%

Precyzja CV, [%] (n=3) Precyzja wewnątrzdniowa

Tabela 1. Wyniki walidacji opracowanej metody TLC w połączeniu z densytometrią w normalnym układzie faz

W tabeli 1 zestawiono wyniki walidacji opra­

cowanej metody TLC w połączeniu z densytome­

trią w normalnym układzie faz. Wyniki ilościowego oznaczania paracetamolu i kofeiny w badanym pre­

paracie prezentuje natomiast tabela 2.

W dokumencie [2017/Nr 2] Nr 2/2017 (pełna wersja) (Stron 28-31)