Pomimo że diagnostyka przewlekłej choroby ne
rek i progresji tej choroby opiera się na obserwacjach klinicznych, w kilku ostatnich dekadach rozwinię
to bardziej swoiste strategie diagnostycznotera
peutyczne. Duże zastosowanie na tym polu ma ge
notypowanie, które dowiodło korzyści z predykcji ryzyka przewlekłej choroby nerek, prowadzenia te
rapii oraz zindywidualizowanej strategii leczniczej.
Obecna diagnostyka i poszukiwanie czynników ryzyka na podstawie genotypowania występuje w przypadku raka piersi (testowanie na obecność genów BRCA 1 i 2). W przypadku przewlekłej cho
roby nerek predykcja ryzyka oparta na diagnostyce DNA nie została jeszcze dobrze oszacowana. Ostat
nie badania populacji afroamerykańskiej chorującej
na PChN niezwiązanej z cukrzycą wykazały, że cho
roba ma związek z polimorfizmami genów apolipo
proteiny LI i niemięśniowej izoformy A ciężkiego łańcucha miozyny typu II [31, 32].
Korzyści wynikające z farmakogenetyki są ukie
runkowane na terapię zindywidualizowaną, zmniej
szenie działań niepożądanych i na zwiększenie sku
teczności leków. Na przykład wyniki wstępnych rutynowych badań polimorfizmu kompleksu en
zymatycznego cytochromu P450 przed wprowa
dzeniem leczenia decydują o dostosowanej farma
koterapii. Pacjenci hemodializowani ze schyłkową niewydolnością nerek mogą posiadać warianty al
leli w cytochromie P450 2D6, które mogą determi
nować metabolizm kodeiny do morfiny, zmieniając działanie analgetyczne morfiny [33]. Innym tera
peutycznym zastosowaniem farmakogenetyki jest leczenie atenololem i enalaprylem w kontekście po
limorfizmu enzymu konwertującego angiotensynę, w którym pacjenci homozygotyczni z delecją allelu mogą odnieść korzyść z leku na nadciśnienie [34].
Powyższe zastosowania obejmują również pacjen
tów z PChN.
Niektóre osiągnięcia terapii spersonalizowanej mogą obniżyć koszty nowych strategii leczniczych PChN. Delecja w genie CCR5∆32 dla receptora che
mokinowego 5, powodująca powstawanie dysfunk
cyjnego receptora, ma związek z wygaszeniem sta
nu zapalnego, ze zmniejszeniem nasilenia procesu włóknienia kłębuszków i z lepszą przeżywalnością.
Dlatego pacjenci dializowani ze schyłkową niewy
dolnością nerek mogliby zyskać na terapii opartej na blokadzie receptora CCR5 [35]. Delecja w genie GST M1 powodująca utratę ochrony antyoksydacyj
nej wpływa na progresję PChN. Pacjenci hemodia
lizowani są bardziej podatni na stres oksydacyjny, bowiem wykazano u homozygot z allelem zerowym GST M1, że występuje wśród nich większa śmiertel
ność w porównaniu z chorymi posiadającymi pełną aktywność GST M1 [36].
U pacjentów posiadających niektóre warianty genów zauważa się większą podatność na PChN po
przez silniejszy wpływ czynników ryzyka u chorych na mocznicę (stres oksydacyjny, zespół wyczer
pania, stan zapalny, niedokrwistość, zwapnienie naczyń). U takich pacjentów można zalecić zmia
nę zwyczajów żywieniowych i trybu życia. W rze
czywistości niewydolność nerek już sama w sobie jest środowiskowym czynnikiem ryzyka ze zróż
nicowanym wpływem dwóch polimorfizmów genu RAS (AGTR1 A1166C oraz ACE I/D) na przerost le
wej komory serca [37]. Innym czynnikiem środo
wiskowym jest podatność na leczenie inhibitorami konwertazy angiotensyny w zależności od podaży sodu i genotypu del/del genu ACE, który może skła
niać do stosowania diety niskosodowej u pacjentów z wariantem genetycznym [38].
Istotnymi czynnikami ryzyka progresji ESRD (schyłkowej niewydolności nerek) są modyfikacje epigenetyczne. Stany zapalne, procesy miażdżyco
we i starzenie są związane z metylacją DNA, która działa jako katalizator procesów sprawczych cho
roby niedokrwiennej serca u pacjentów dializowa
nych [39]. U tych pacjentów podkreśla się ważność stosowania leków celujących w modyfikacje epige
netyczne. W zastosowaniu leczniczym bierze się pod uwagę interferencję RNA, która jest ważna dla ner
kowej homeostazy związanej z białkomoczem zwią
zanym z różnicowaniem podocytów. Hiperhomo
cysteinemia została zauważona u pacjentów z PChN i ESRD, u których opisano wysoki poziom Sadeno
zylohomocysteiny powodującej hipometylację DNA [40]. Zatem kłębuszkowe i śródmiąższowe włóknie
nie nerek może być związane z modyfikacjami epi
genetycznymi przez regulację transkrypcji.
Podsumowanie
Farmakogenetyka jest nowoczesnym podejściem do medycyny szytej na miarę. Obecnie u pacjentów z grupy wysokiego ryzyka progresji PChN można wykorzystywać genotypowanie, chociaż ta nowo
czesna zdobycz techniki wymaga dużych nakładów finansowych i obecnie mogłaby stanowić co najwy
żej uzupełnienie dla klasycznych badań klinicznych.
Markery genetyczne mogłyby służyć predykcji pro
gresji PChN, ale ocena kliniczna czynników ryzyka zapewne wciąż pozostanie wiodącym narzędziem diagnostycznym. Postępy technologiczne związa
ne z sekwencjonowaniem genów i z badaniem epi
genomu, jak również dobrze zbadane interakcje międzygenowe, genowośrodowiskowe i epigene
tyczne, mogą w przyszłości poszerzyć naszą wiedzę o genach skojarzonych z PChN i ostatecznie otwo
rzyć furtkę dla nowych algorytmów postępowania diagnostycznoterapeutycznego, a postęp techno
logiczny i dalsze badania epidemiologiczne mogły
by pozwolić na wypracowanie najefektywniejsze
go, optymalnego i taniego postępowania. Biorąc pod uwagę, że PChN jest złożonym zaburzeniem, a pacjenci mogą skorzystać na badaniach genetycz
nych, skłania to ku dalszym wyzwaniom związanym z badaniem białek, transkryptów i metabolitów, co w zamiarze ma powiązać je z danymi genetyczny
mi, zwiększyć rezultaty kliniczne i doprowadzić do rutynowego oznaczania genów w opiece klinicznej.
Otrzymano: 2016.08.11 · Zaakceptowano: 2016.12.18
Piśmiennictwo
1. Levey A.S., Atkins R., Coresh J., Cohen E.P., Collins A.J., Eckardt K.U., Nahas M.E., Jaber B.L., Jadoul M., Levin A., Powe N.R., Rossert J., Wheeler D.C., Lameire N., Eknoyan G.: Chronic kidney disease as a global public health problem: approaches and initiatives – a position
statement from Kidney Disease Improving Global Outcomes. Kidney Int. 2007, 72(3): 247–259.
2. Jha V., GarciaGarcia G., Iseki K., Li Z., Naicker S., Plattner B., Saran R., Wang A.Y., Yang C.W.: Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet 2013, 382(9888): 260–272.
3. Kronenberg F.: Emerging risk factors and markers of chronic kidney disease progression. Nat Rev Nephrol. 2009, 5(12): 677–689.
4. Ruggenenti P, Cravedi P, Remuzzi G.: The RAAS in the pathogenesis and treatment of diabetic nephropathy. Nat Rev Nephrol. 2010, 6(6):
319–330.
5. Sowers J.R., WhaleyConnell A., Epstein M.: Narrative review: the emerging clinical implications of the role of aldosterone in the me
tabolic syndrome and resistant hypertension. Ann Intern Med. 2009, 150(11): 776–783.
6. Bonizzi G., Karin M.: The two NFkappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 2004, 25(6): 280–288.
7. Lambers Heerspink H.J., Holtkamp F.A., Parving H.H., Navis G.J., Le
wis J.B., Ritz E., de Graeff P.A., de Zeeuw D.: Moderation of dietary sodium potentiates the renal and cardiovascular protective effects of angiotensin receptor blockers. Kidney Int. 2012, 82(3): 330–337.
8. Pergola P.E., Krauth M., Huff J.W., Ferguson D.A., Ruiz S., Meyer C.J., Warnock D.G.: Effect of bardoxolone methyl on kidney function in patients with T2D and Stage 3b4 CKD. Am J Nephrol. 2011, 33(5):
469–476.
9. Yoshihara D., Kugita M., Yamaguchi T., Aukema H.M., Kurahashi H., Morita M., Hiki Y., Calvet J.P., Wallace D.P., Toyohara T., Abe T., Na
gao S.: Global Gene Expression Profiling in PPARγ AgonistTreated Kidneys in an Orthologous Rat Model of Human Autosomal Recessi
ve Polycystic Kidney Disease. PPAR Res. 2012, 695898.
10. Cornelis M.C., Monda K.L., Yu K., Paynter N., Azzato E.M., Bennett S.N., Berndt S.I. i wsp.: Genomewide metaanalysis identifies re
gions on 7p21 (AHR) and 15q24 (CYP1A2) as determinants of habi
tual caffeine consumption. PLoS Genet. 2011, 7(4): e1002033.
11. Bochud M., Bovet P., Burnier M., Eap C.B.: CYP3A5 and ABCB1 genes and hypertension. Pharmacogenomics 2009, 10(3): 477–487.
12. Siest G., Jeannesson E., VisvikisSiest S.: Enzymes and pharmacoge
netics of cardiovascular drugs. Clin Chim Acta 2007, 381(1): 26–31.
13. Jin Y., Wang Y.H., Miao J., Li L., Kovacs R.J., Marunde R., Hamman M.A., Philips S., Hilligoss J., Hall S.D.: Cytochrome P450 3A5 geno
type is associated with verapamil response in healthy subjects. Clin Pharmacol Ther. 2007, 82(5): 579–585.
14. Kim K.A., Park P.W., Lee O.J., Choi S.H., Min B.H., Shin K.H., Chun B.G., Shin J.G., Park J.Y.: Effect of CYP3A5*3 genotype on the phar
macokinetics and pharmacodynamics of amlodipine in healthy Ko
rean subjects. Clin Pharmacol Ther. 2006, 80(6): 646–656.
15. Kim R.B.: Drugs as Pglycoprotein substrates, inhibitors, and indu
cers. Drug Metab Rev. 2002, 34(1–2): 47–54.
16. Liu M., Li Y., Citterio L., Huang Q.F., Zeng W.F., Sheng C.S., Wei F.F., Dong Q., Li G.L., Kang Y.Y., Zhang L., Xu T.Y., Li J.J., Song J., Manunta P., Wang J.G.: A functional common polymorphism of the ABCB1 gene is associated with chronic kidney disease and hypertension in Chine
se. Am J Hypertens. 2013, 26(12): 1428–1436.
17. Burk O., Arnold K.A., Geick A., Tegude H., Eichelbaum M.: A role for constitutive androstane receptor in the regulation of human intesti
nal MDR1 expression. Biol Chem. 2005, 386(6): 503–513.
18. Saeki M., Kurose K., Tohkin M., Hasegawa R.: Identification of the functional vitamin D response elements in the human MDR1 gene.
Biochem Pharmacol. 2008, 76(4): 531–542.
19. Kumar R., Schaefer J., Grande J.P., Roche P.C.: Immunolocalization of calcitriol receptor, 24hydroxylase cytochrome P450, and calbindin D28k in human kidney. Am J Physiol. 1994, 266(3 Pt 2): F477–F485.
20. Wang T.T., TaveraMendoza L.E., Laperriere D., Libby E., MacLe
od N.B., Nagai Y., Bourdeau V., Konstorum A., Lallemant B., Zhang R., Mader S., White J.H.: Largescale in silico and microarraybased identification of direct 1,25dihydroxyvitamin D3 target genes. Mol Endocrinol. 2005,19(11): 2685–2695.
21. Grzegorzewska A.E., Ostromecki G.: Gene polymorphism of the vita
min D receptor, vitamin Dbinding protein and calciumsensing re
ceptor in respect of calciumphosphate disturbances in chronic dia
lysis patients. Przegl Lek. 2013, 70(9): 735–738.
22. de Souza C.M., Braosi A.P., Luczyszyn S.M., Avila A.R., de Brito R.B.
Jr, Ignácio S.A., Probst C.M., Riella M.C., Sotomaior V.S., Mira M.T., PecoitsFilho R., Trevilatto P.C.: Association between vitamin D re
ceptor gene polymorphisms and susceptibility to chronic kidney di
sease and periodontitis. Blood Purif. 2007, 25(5–6): 411–419.
23. VélayoudomCéphise F.L., Larifla L., Donnet J.P., Maimaitiming S., Deloumeaux J., Blanchet A., Massart C., MunozBellili N., Merle S., Chout R., Bonnet F., Foucan L.: Vitamin D deficiency, vitamin D re
ceptor gene polymorphisms and cardiovascular risk factors in Ca
ribbean patients with type 2 diabetes. Diabetes Metab. 2011, 37(6):
540–545.
24. de Zeeuw D., Agarwal R., Amdahl M., Audhya P., Coyne D., Garimel
la T., Parving H.H., Pritchett Y., Remuzzi G., Ritz E., Andress D.: Se
lective vitamin D receptor activation with paricalcitol for reduction of albuminuria in patients with type 2 diabetes (VITAL study): a ran
domised controlled trial. Lancet. 2010, 376(9752): 1543–1551.
25. Ruggenenti P., Bettinaglio P., Pinares F., Remuzzi G.: Angiotensin co
nverting enzyme insertion/deletion polymorphism and renoprotec
tion in diabetic and nondiabetic nephropathies. Clin J Am Soc Neph
rol. 2008, 3(5): 1511–1525.
26. Santos P.C., Krieger J.E., Pereira A.C.: Reninangiotensin system, hy
pertension, and chronic kidney disease: pharmacogenetic implica
tions. J Pharmacol Sci. 2012, 120(2): 77–88.
27. Penno G., Chaturvedi N., Talmud P.J., Cotroneo P., Manto A., Nanni
pieri M., Luong L.A., Fuller J.H.: Effect of angiotensinconverting en
zyme (ACE) gene polymorphism on progression of renal disease and the influence of ACE inhibition in IDDM patients: findings from the EUCLID Randomized Controlled Trial. EURODIAB Controlled Trial of Lisinopril in IDDM. Diabetes. 1998, 47(9):1507–1511.
28. Jacobsen P., Tarnow L., Carstensen B., Hovind P., Poirier O., Parving H.H.: Genetic variation in the ReninAngiotensin system and pro
gression of diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2003, 14(11):
2843–2850.
29. So W.Y., Ma R.C., Ozaki R., Tong P.C., Ng M.C., Ho C.S., Lam C.W., Chow C.C., Chan W.B., Kong A.P., Chan J.C.: Angiotensinconver
ting enzyme (ACE) inhibition in type 2, diabetic patients – interac
tion with ACE insertion/deletion polymorphism. Kidney Int. 2006, 69(8):1438–1443.
30. Yu H., Zhang Y., Liu G.: Relationship between polymorphism of the angiotensinconverting enzyme gene and the response to angioten
sinconverting enzyme inhibition in hypertensive patients. Hyper
tens Res. 2003, 26(11): 881–886.
31. Tzur S., Rosset S., Shemer R., Yudkovsky G., Selig S., Tarekegn A., Be
kele E., Bradman N., Wasser W.G., Behar D.M., Skorecki K.: Missen
se mutations in the APOL1 gene are highly associated with end sta
ge kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 2010, 128(3): 345–350.
32. Kao W.H., Klag M.J., Meoni L.A., Reich D., BerthierSchaad Y., Li M., Coresh J. i wsp.: MYH9 is associated with nondiabetic endstage renal disease in African Americans. Nat Genet. 2008, 40(10): 1185–1192.
33. Molanaei H., Carrero J.J., Heimbürger O., Nordfors L., Lindholm B., Stenvinkel P., OdarCederlöf I., Bertilsson L.: Influence of the CYP2D6 polymorphism and hemodialysis on codeine disposition in patients with endstage renal disease. Eur J Clin Pharmacol. 2010, 66(3):269–273.
34. van Essen G.G., Rensma P.L., de Zeeuw D., Sluiter W.J., Scheffer H., Apperloo A.J., de Jong P.E.: Association between angiotensinconver
tingenzyme gene polymorphism and failure of renoprotective the
rapy. Lancet 1996, 347(8994): 94–95.
35. Muntinghe F.L., Vegter S., Verduijn M., Boeschoten E.W., Dekker F.W., Navis G., Postma M.: Using a genetic, observational study as a stra
tegy to estimate the potential costeffectiveness of pharmacological CCR5 blockade in dialysis patients. Pharmacogenet Genomics. 2011, 21(7): 417–425.
36. Lin Y.S., Hung S.C., Wei Y.H., Tarng D.C.: GST M1 polymorphism as
sociates with DNA oxidative damage and mortality among hemodia
lysis patients. J Am Soc Nephrol. 2009, 20(2): 405–415.
37. Ohishi M., Rakugi H., Ogihara T.: Association between a deletion po
lymorphism of the angiotensinconvertingenzyme gene and left ventricular hypertrophy. N Engl J Med. 1994, 331(16): 1097–1098.
38. van der Kleij F.G., Schmidt A., Navis G.J., Haas M., Yilmaz N., de Jong P.E., Mayer G., de Zeeuw D.: Angiotensin converting enzyme insertion/deletion polymorphism and shortterm renal response to ACE inhibition: role of sodium status. Kidney Int Suppl. 1997, 63:
S23–S26.
39. Dwivedi R.S., Herman J.G., McCaffrey T.A., Raj D.S.: Beyond genetics:
epigenetic code in chronic kidney disease. Kidney Int. 2011, 79(1):
23–32.
40. Perna A.F., Ingrosso D., Satta E., Lombardi C., Acanfora F., De Santo N.G.: Homocysteine metabolism in renal failure. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2004, 7(1): 53–57.
narządów do celów toksykologicznych, na przy
kład w nagłych przypadkach zatruć paracetamo
lem. Z kolei kofeinę oznaczano zaprezentowanymi metodami przeważnie w produktach spożywczych, takich jak: napary kaw, herbat oraz w innych napo
jach kofeinowych, w celu oceny zawartości w nich tej substancji aktywnej. Niektóre tylko z tych prac prezentują wyniki badań paracetamolu lub kofe
iny w preparatach farmaceutycznych [7–9, 11, 14, 24–27]. Analiza zawartości paracetamolu i kofe
iny daną metodą analityczną może mieć na celu
Wstęp
Paracetamol (acetaminofen, N(4hydroksyfe
nyloacetamid)), czyli związek organiczny z grupy anilidów, oraz kofeina (1,3,7trimetyloksantyna), będąca alkaloidem purynowym pochodzenia roślin
nego (ziarna kawy, liście herbaty, ziarna kakao), to substancje, które z uwagi na swoje działanie na or
ganizm ludzki występują równocześnie w złożo
nych preparatach farmaceutycznych stosowanych m.in. w przeziębieniu [1, 2]. Paracetamol wykazuje działanie przeciwbólowe i przeciwgorączkowe, na
tomiast kofeina nasila przeciwbólowe działanie pa
racetamolu [3].
Zawartość paracetamolu i kofeiny w próbkach różnego pochodzenia bada się z zastosowaniem wie
lu technik analitycznych. Należą do nich: spektro
fotometria w zakresie nadfioletu i światła widzial
nego (UVVIS), spektrofotometria w podczerwieni (IR), spektrofluorymetria, miareczkowanie redok
symetryczne, metody elektroanalityczne, do któ
rych należy m.in. woltamperometria, a także tech
niki separacyjne, czyli chromatografia cieczowa;
wysokosprawna (HPLC), cienkowarstwowa (TLC), gazowa (GC) oraz elektroforeza kapilarna (CE) [4–
27]. Dobór odpowiedniej metody analitycznej za
leży od różnych czynników, w tym przede wszyst
kim od rodzaju badanego materiału, dostępności danej metody, szybkości i kosztów analizy, dokład
ności oraz wielu innych parametrów charaktery
zujących określoną metodę analityczną. Wyżej wy
mienionymi metodami analitycznymi oznaczano paracetamol głównie w materiale biologicznym, tzn. w różnych płynach ustrojowych i próbkach
Application of TLC and densitometry for the determination of paracetamol and caffeine in combined pharmaceutical formulation · The optimal chromatographic conditions allowing identification and also quantification of paracetamol and caffeine using TLC with densitometry in combined tablet dosage form has been developed in this work. The studied sample was ethanolic extract coming from tablets consisted of 500 mg paracetamol and 65 mg of caffeine per tablet. Off all chromatographic conditions tested, the mixture composed of chloroform-acetone-ammonia (25%) in volume composition 39.6:9.9:0.5 and silica gel 60F254 plates with concentrating zone were the most effective in the separation of both examined substances and compounds related to paracetamol.
Densitometric detection was carried out at wavelength λ=250 nm for paracetamol and λ=275 nm for caffeine. Validation of proposed TLC method combined with densitometry confirms its specificity, precision, accuracy, robust and sensitivity. The results obtained in this work show that the developed method can be applied in routine control of preparations containing both paracetamol and caffeine.
Keywords: caffeine, paracetamol, TLC, validation, pharmaceutical analysis
© Farm Pol, 2017, 73(2): 97-104