Specyficzność (selektywność) metody
Zgodnie z wytycznymi przewodników walidacji metod analitycznych stosowanych w analizie far
maceutycznej, specyficzność (selektywność) jest ważnym parametrem świadczącym o tym, że dana procedura analityczna pozwala oznaczyć składniki główne (tj. substancje czynne) występujące w ba
danym preparacie farmaceutycznym w obecności substancji pokrewnych mogących stanowić ich za
nieczyszczenie. W celu wykazania specyficzności proponowanej metody TLC w połączeniu z densy
tometrią dokonywano wyboru odpowiednich wa
runków chromatograficznych, tj. fazy ruchomej i płytek chromatograficznych umożliwiających roz
dział badanego paracetamolu od kofeiny oraz sub
stancji, które mogłyby występować w ich prepa
racie złożonym jako ewentualne zanieczyszczenia paracetamolu, czyli 4chloroacetanilidu oraz p
aminofenolu. Opierając się na wcześniejszych wynikach badań, wybrano cztery fazy ruchome o różnym składzie: octan etylumetanolamoniak (25%) w stosunku objętościowym 85:15:5, v/v/v (faza I), metanoloctan etylu (15:85, v/v) (faza II), nheksanoctan etyluetanol (2,5:1,5:0,4, v/v/v) (faza III) i chloroformacetonamoniak (25%) (39,6:9,9:0,5, v/v/v) (faza IV) [25, 26]. Przetesto
wano także różne płytki chromatograficzne, tzn. po
kryte żelem krzemionkowym 60F254 bez fazy kon
centracji (E. Merck, Art. 1.05554), płytki z fazą koncentracji (E. Merck, Art. 1.05583) oraz płytki po
kryte mieszaniną żelu krzemionkowego 60F254 i zie
mi okrzemkowej F254 (Art. 1.05567). Badania te wy
kazały, że spośród przeanalizowanych różnych płytek chromatograficznych oraz czterech faz rucho
mych jedynie faza IV, której skład był zaproponowa
ny przez Pykę i współpracowników do ilościowego oznaczania paracetamolu w jego preparacie prostym, okazała się najbardziej optymalna [25, 26]. Skład fazy ruchomej I, II i III był nieodpowiedni z uwagi na słaby rozdział przy jej użyciu paracetamolu i 4ami
nofenolu. Natomiast wybrana jako najlepsza spo
śród przebadanych faza ruchoma IV oraz płytki chro
matograficznych Art. 1.05583 (żel krzemionkowy 60F254 z fazą koncentracji) pozwoliły na całkowity rozdział wszystkich czterech badanych substancji.
Celem oceny specyficzności proponowa
nej procedury TLC w połączeniu z densyto
metrią, opartej na zastosowaniu mieszaniny
chloroformacetonamoniak (25%) 39,6:9,9:0,5 (v/v/v) jako fazy ruchomej oraz płytek chromato
graficznych Art. 1.05583, zostały obliczone na pod
stawie uzyskanego dla tych warunków densytogra
mu (rycina 1) wartości parametrów rozdziału, takie jak: Rs i ∆Rf:
Rs (P/PA) =2,00 i ∆Rf(P/PA)= 0,18 dla rozdziału para
cetamolu od paminofenolu;
Rs (PA/C) =1,70 i ∆Rf(PA/PC)= 0,13 dla rozdziału paminofenolu od kofeiny;
Rycina 1. Densytogram mieszaniny wzorców badanych substancji leczniczych oraz substancji pokrewnych paracetamolu na płytkach (Art. 1.05583) przy użyciu fazy ruchomej: chloroformacetonamoniak (25%): 39,6:9,9:0,5 (v/v/v); P – paracetamolu, PA – paminofenolu, C – kofeiny oraz CA – 4chloroacetanilidu
Rycina 2. Densytogram ekstraktu uzyskanego z badanego preparatu o zawartości 5 µg paracetamolu (P) i 0,65 µg kofeiny (C) na płytkach Art. 1.05583 i przy użyciu fazy ruchomej: chloroformacetonamoniak (25%): 39,6:9,9:0,5 (v/v/v)
Rs (C/CA) =2,53 i ∆Rf(C/CA)= 0,26 dla rozdziału kofe
iny od 4chloroacetanilidu.
Powyżej przedstawione wartości Rs dla każdej z par badanych związków większe od 1,00 oraz
∆Rf>0,05 świadczą o tym, że nastąpiło całkowi
te ich rozdzielenie oraz że opracowana metoda TLC jest specyficzna, bo pozwala oznaczyć analizowane związki: paracetamol (P) i kofeinę (C) w obecności substancji pokrewnych, czyli paminofenolu (PA) i 4chloroacetanilidu (CA).
Densytogram uzyskany z ekstraktu badanego preparatu dla wybranych jako optymalne warun
ków chromatograficznych zamieszczony na ryci-nie 2 wskazuje na brak jakichkolwiek dodatkowych pasm chromatograficznych. Na densytogramie ob
serwuje się tylko dwa pasma chromatograficzne, tj. odpowiadające paracetamolowi i kofeinie. Zatem
badany produkt nie zawiera zanieczyszczeń sub
stancjami pokrewnymi paracetamolu. Zgodność spektrodensytogramów zaprezentowanych na ry-cinach 3 i 4 dla paracetamolu pochodzącego z eks
traktu preparatu P(p) i jego wzorca P(s) oraz kofeiny wyekstrahowanej z preparatu – C(p) i jej wzor
ca – C(s) potwierdzają również czystość badanego preparatu. W związku z tym opracowane warunki chromatograficzne mogą być z powodzeniem stoso
wane także do potwierdzania tożsamości paraceta
molu i kofeiny w ich złożonym preparacie.
Liniowość i zakres
Na podstawie pomiarów powierzchni pasm chromatograficznych A [AU] paracetamolu i od
powiednio kofeiny dla próbek w zakresie stężeń (C) paracetamolu: 0,75÷9,00 µg/plamkę i kofeiny:
0,15÷1,05 µg/plamkę uzyskano krzywe opisane równaniami liniowymi:
dla paracetamolu AU=1831,0(±56,7) × C + + 4698,9(±307,1); r=0,998; s=427; F=1042,3;
p<0,0001;
dla kofeiny AU=8924,8(±209,9) × C + + 948,4(±140,8); r=0,999; s=166,6; F=1807,6;
p<0,0001.
Charakterystyka obu tych krzywych, w tym wy
sokie wartości współczynników korelacji (r>0,99) oraz duże wartości parametru F, wskazują na linio
wość otrzymanych zależności w całym badanym za
kresie stężeń paracetamolu i kofeiny.
Dokładność
Uzyskane wysokie wartości odzysku paraceta
molu zamieszczone w tabeli 1, mieszczące się w za
kresie: od 95,5% do 98,3%, oraz w przypadku ko
feiny od 98,1% do 99,3%, potwierdzają dokładność proponowanej metody TLC w połączeniu z densy
tometrią do oznaczania obu badanych substancji w ich złożonym preparacie. Rezultaty współczyn
nika zmienności (CV) wyznaczone dla tych samych warunków świadczą także o tym fakcie. W obu przypadkach CV jest mniejsze od 2%. Powtarzal
ność opracowanej metody, której miarą jest odzysk jest porównywalna z wynikami uzyskanymi tech
niką TLC z densytometrią przez Pykę i wsp. dla pro
stego preparatu paracetamolu [25, 26].
Precyzja
Miarą precyzji opracowanej metody jest współ
czynnik zmienności (CV) obliczony w oparciu o po
miary powierzchni pasm chromatograficznych A [AU] dla trzech różnych stężeń badanego parace
tamolu i kofeiny. Dane zestawione w tabeli 1 wska
zują na to, że współczynnik zmienności dla precyzji wewnątrzdniowej w przypadku paracetamolu mie
ści się w zakresie: 1,01÷1,68%, a międzydniowej:
1,04÷1,15%. Dla kofeiny uzyskano CV mieszczące Rycina 3. Spektrodensytogramy paracetamolu pochodzącego z ekstraktu
badanego preparatu P(p) oraz wzorca P(s)
Rycina 4. Spektrodensytogramy kofeiny pochodzącej z ekstraktu badanego preparatu C(p) oraz wzorca C(s)
się w przedziale: 1,66÷2,26 dla precyzji wewnątrz
dniowej oraz 1,41÷2,76 dla precyzji międzydnio
wej (tabela 1).
Uzyskane wartości współczynnika zmienności mniejsze od 3% potwierdzają precyzję opracowa
nej metody.
Granica wykrywalności (LOD) i oznaczalności (LOQ)
Zgodnie z procedurą przedstawioną w części po
święconej metodyce badań, w oparciu o uzyska
ne parametry specjalnej krzywej kalibracyjnej od
powiednio dla paracetamolu i kofeiny, oszacowano granicę wykrywalności (LOD) i granicę oznaczalno
ści (LOQ) obu substancji opracowaną techniką TLC z densytometrią. Średnie wartości tych parametrów uzyskane dla paracetamolu (LOD=0,070 µg/plam
kę, LOQ=0,213 µg/plamkę) są zbliżone do wartości uzyskanych dla kofeiny (LOD=0,064 µg/plamkę, LOQ=0,192 µg/plamkę). Oznacza to, że opracowa
na metoda pozwala oznaczyć obie badane substan
cje na tym samym poziomie. Porównując natomiast otrzymane wartości LOD i LOQ z danymi literatu
rowymi, w tym m.in. z wynikami uzyskanymi we wcześniejszych badaniach paracetamolu przez Pykę i współpracowników, można stwierdzić, że warunki chromatograficzne, które zostały użyte w obecnych badaniach pozwalają oznaczyć badane związki na tym samym poziomie, czyli czułość zaproponowa
nej w niniejszej pracy metody TLC w zakresie ozna
czania paracetamolu jest taka sama [25, 26].
Odporność
Względne odchylenie standardowe (RSD,%) wy
ników pomiarów densytometrycznych powierzch
ni pasm chromatograficznych analizowanego pa
racetamolu i kofeiny w zastosowanych zmiennych warunkach chromatograficznych, tj. przy zmianie czasu wysycania komory fazą ruchomą (±10 minut), drogi rozwijania chromatogramów (±10 mm) oraz
objętości fazy ruchomej (±10 ml), mieszczą się w za
kresie 0,9÷1,2%, czyli są mniejsze od 2%, co dowo
dzi, że proponowana w niniejszej pracy metoda TLC w połączeniu z densytometrią jest odporna.
Oznaczanie zawartości paracetamolu i kofeiny w badanym preparacie farmaceutycznym
W tabeli 2 przedstawiono wyniki rzeczywistej zawartości paracetamolu i kofeiny w badanym pre
paracie, uzyskane w powyższej pracy opracowa
ną metodą TLC z densytometrią. Zestawione w ta
belach parametry statystyczne pozwoliły ocenić uzyskane wyniki. Zgodnie z tabelą 2 rzeczywista zawartość paracetamolu w badanym preparacie handlowym wynosi 491,5 mg/tabletkę, co stano
wi 98,30% w odniesieniu do wartości deklarowanej przez producenta preparatu. Wartość ta jest zgod
na z wytycznymi farmakopealnymi, tzn. mieści się w przedziale: 95–105% [30]. Ponadto wyniki za
mieszczone w tabeli 2 wskazują na fakt, że ozna
czona w badanym produkcie ilość kofeiny wynosi 63,13 mg/tabletkę, czyli stanowi 97,12% w po
równaniu z wartością deklarowaną przez producen
ta. Podobnie jak w przypadku paracetamolu wynik ten jest satysfakcjonujący, bo spełnia zalecenia Far
makopei Polskiej [30].
Wnioski
Podsumowując uzyskane wyniki, można sfor
mułować następujące wnioski:
Mieszanina chloroformacetonamoniak (25%):
39,6:9,9:0,5 (v/v/v) jako faza ruchoma oraz płytki chromatograficzne Art. 1.05583 (żel krze
mionkowy 60F254 z fazą koncentracji) są opty
malnymi warunkami chromatograficznymi do badania tożsamości oraz ilościowego oznaczania paracetamolu i kofeiny w ich złożonym prepara
cie farmaceutycznym.
Parametr Wartość wyznaczona
z ekstraktu preparatu dla paracetamolu
Wartość wyznaczona z ekstraktu preparatu
dla kofeiny
Liczba prób 6 6
Ilość oznaczanej substancji w preparacie deklarowana przez producenta [mg/tabletkę] 500,0 65,0
Ilość oznaczanej substancji w preparacie wyznaczona w eksperymencie [mg/tabletkę] 491,5 63,1
Zawartość minimalna oznaczanej substancji [mg/tabletkę] 490,1 62,6
Zawartość maksymalna oznaczanej substancji [mg/tabletkę] 492,9 63,6
Odchylenie standardowe 0,55 0,20
Współczynnik zmienności (CV) 0,11 0,31
Przedział ufności średniej arytmetycznej paracetamolu/kofeiny wyznaczony na poziomie istotności równym 95% µ=491,5±1,4 µ=63,1±0,5 Zawartość oznaczanej substancji w [%] w odniesieniu do zawartości deklarowanej przez producenta leku 98,30 97,12 Tabela 2. Wyniki ilościowego oznaczania paracetamolu i kofeiny w badanym preparacie
Uzyskane parametry walidacji opracowanej me
tody potwierdzają, że proponowana metoda TLC w połączeniu z densytometrią jest precyzyjna, dokładna, odporna i czuła. Pozwala oznaczyć paracetamol i kofeinę na tym samym poziomie.
Potwierdzono czystość badanego produktu, czy
li brak w nim substancji pokrewnych paraceta
molu.
Opracowana metoda TLC w połączeniu z den
sytometrią jest ekonomiczna, łatwa w użyciu i może być zastosowana w rutynowej kontro
li złożonych preparatów farmaceutycznych za
wierających paracetamol i kofeinę.
Podziękowania
Badania zostały sfinansowane przez Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach w 2016/17.
Projekt nr KNW1019/K/6/0.
Otrzymano: 2017.01.11 · Zaakceptowano: 2017.01.20
Piśmiennictwo
1. Drug Bank, Caffeine. [online] https://www.drugbank.ca/drugs/
DB00201 (stan z 02.12.2016).
2. Drug Bank, Acetaminophen [online] https://www.drugbank.ca/
drugs/DB00316 (stan z 02.12.2016).
3. Graham G.G., Davies M.J., Day R.O., Mohamudally A., Scott K.F.: The modern pharmacology of paracetamol: therapeutic actions, mecha
nism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological fin
dings. Inflammopharmacology 2013, 21(3): 201–32.
4. Białas M., Łuczak H., Jeżewska M.: Ocena zawartości kofeiny w wy
branych napojach bezalkoholowych. Bromat. Chem. Toksykol. 2011, 44 (3): 630–634.
5. Jarosz M., Wierzejska R., Mojska H., Świderska K., Siuba M.: Zawar
tość kofeiny w produktach spożywczych. Bromat. Chem. Toksykol.
2009, 42 (3): 776–781.
6. Atomssa T., Gholap A.V.: Characterization of caffeine and determi
nation of caffeine in tea leaves using UVvisible spectrometer. Afr. J.
Pure Appl. Chem. 2011, 5 (1): 1–8.
7. Pyka A., Dołowy M., Bober K.: Zastosowanie metody spektrofoto
metrii do oznaczania paracetamolu w tabletkach. Farm. Pol. 2012, 68(1): 13–17.
8. Vilchez J.L., Blanc R., Avidad R., Navalon A.: Spectrofluorimetric de
termination of paracetamol in pharmaceuticals and biological fluids.
J. Pharm. Biomed. Anal. 1995, 13: 1119–1125.
9. Moreira A., Oliveira H., Atvars T., Dias I., Neto G., Zagatto E., Kubo
ta L.: Direct determination of paracetamol in powdered pharmaceu
tical samples by fluorescence spectroscopy. Anal. Chim. Acta. 2005, 539: 257–261.
10. Paradkar M.M., Irudayaraj J.: Rapid determination of caffeine con
tent in soft drinks using FTIRATR spectroscopy. Food Chem. 2002, 78: 261–266.
11. Said M.M., Gibbons S., Moffat A.C., Zloh M.: Nearinfrared spectro
scopy (NIRS) and chemometric analysis of Malaysian and UK para
cetamol tablets: A spectral database study. Int. J. Pharm. 2011, 415:
102–109.
12. Tadesse Y., Tadese A., Saini R.C., Pal R.: Cyclic voltammetric investi
gation of caffeine at anthraquinone modified carbon paste electrode.
Int. J. Electrochem. 2013, 849327: 1–7.
13. Zhang Y., Luo L., Ding Y., Liu X., Qian Z.: A highly sensitive method for determination of paracetamol by absorptive stripping voltamme
try using a carbon paste electrode modified with nanogold and glu
tamic acid. Microchim. Acta 2010, 171: 133–138.
14. Muszalska I., Zając M., Wróbel G., Nogowska M.: Redox methods va
lidation of paracetamol and ascorbic acid in pharmaceutical prepara
tions. Acta Pol. Pharm. 2000, 57 (1): 27–32.
15. Fenske M.: Caffeine determination in human saliva and urine by TLC and ultraviolet absorption densitometry. Chromatographia 2007, 65(3/4): 233–238.
16. Pufal E., Sykutera M., Rochholz G., Schutz H.W., Sliwka K., Ka
atsch H.J.: Determination of paracetamol (acetaminophen) in diffe
rent body fluids and organ samples after solidphase extraction using HPLC and an immunological method. Fresenius J. Anal. Chem. 2000, 367: 596–599.
17. Speed D.J., Dickson S.J., Cairns E.R., Kim N.D.: Analysis of paraceta
mol using solidphase extraction, deuterated internal standards, and gas chromatographymass spectrometry. J. Anal. Toxicol. 2001, 25 (4): 198–202.
18. Carregaro A.B., Woods W.E., Tobin T., QueirozNeto A.: Comparison of the quantification of caffeine in human plasma by gas chromato
graphy and ELISA. Braz. J. Med. Biol. Res. 2001, 34: 821–824.
19. Dechtiaruk W.A., Johnson G.F., Solomon H.M.: Gaschromatographic method for acetaminophen (Nacetylpaminophenol) based on se
quential alkylation. Clin. Chem. 1976, 22 (6): 879–883.
20. Zou J.K., Li N.: Simple and environmental friendly procedure for the gas chromatographicmass spectrometric determination of caffeine in beverages. J. Chromatogr. A. 2006, 1136: 106–110.
21. Tsuda T., Noda S., Kitagawa S., Morishita T.: Proposal of sampling process for collecting human sweat and determination of caffeine concentration in it by using GC/MS. Biomed. Chromatogr. 2000, 14:
505–510.
22. Bizzotto C.S., Meinhart A.D., Ballus C.A., Ghiselli G., Godoy H.T.:
Comparison of capillary electrophoresis and high performance liqu
id chromatography methods for caffeine determination in decaffe
inated coffee. Food Sci. Technol. 2013, 33(1): 186–191.
23. Zhao S., Bai W., Yuan H., Xiao D.: Detection of paracetamol by capil
lary electrophoresis with chemiluminescence detection. Anal. Chim.
Acta. 2006, 559: 195–199.
24. Chu Q., Jiang L., Tian X., Ye J.: Rapid determination of acetamino
phen and paminophenol in pharmaceutical formulations using mi
niaturized capillary electrophoresis with amperometric detection.
Anal. Chim. Acta. 2008, 606: 246–251.
25. Pyka A., Budzisz M., Dołowy M.: Validation thin layer chromatogra
phy for the determination of acetaminophen in tablets and compari
son with pharmacopeial method. BioMed. Res. Int. 2013, vol. 2013:
10 pages.
26. Pyka A., Budzisz M., Dołowy M.: Zastosowanie TLC i densytometrii do ilościowego oznaczania paracetamolu w wybranych preparatach far
maceutycznych. [W]: Chromatografia w praktyce. Voelkel A., Wasiak W. [red], Poznań: Wydaw. Politechniki Poznańskiej 2011: 137–147.
27. Tavallali H., Zareiyan S.F., Naghian M.: An efficient and simultane
ous analysis of caffeine and paracetamol in pharmaceutical formula
tions using TLC with fluorescence plate reader. JAOAC Int. 2011, 94 (4): 1094–1099.
28. ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005): Validation of Analyti
cal Procedures: Text and Methodology, Q2(R1), ICH, Geneva, Swit
zerland. http://www.ich.org (stan z dnia 10.12.2016).
29. Konieczka P., Namieśnik J.: Walidacja procedur analitycznych. [W:]
Konieczka P, Namieśnik J. Ocena i kontrola jakości wyników pomia
rów analitycznych. Warszawa: Wydawnictwo NaukowoTechniczne 2007: 225–300.
30. Farmakopea Polska, Wyd. X, Warszawa: Wydaw. PTFarm, 2014.
glukozy wprowadzono termin cukrzycy induko
wanej lekami. Głównymi mechanizmami odpo
wiedzialnymi za wahania stężeń glukozy w oso
czu podczas stosowania leków jest spadek syntezy
Wstęp
Wraz z rozwojem cywilizacji następują nieko
rzystne zmiany stylu życia, których efektem, obok zwiększającej się częstości występowania nadciśnie
nia tętniczego i otyłości, jest również coraz częstsze rozpoznawanie cukrzycy. Cukrzyca stanowi ogól
noświatowy problem zdrowotny i ekonomiczny.
Obserwuje się stały wzrost chorobowości spowo
dowanej tym schorzeniem. Według prognoz Świa
towej Organizacji Zdrowia (WHO) do 2025 r. choro
bowość spowodowana cukrzycą zwiększy się ponad dwukrotnie w krajach rozwijających się, a w kra
jach rozwiniętych wzrośnie aż do 7,6% ogółu po
pulacji [1, 2].
Podwyższone stężenie glukozy we krwi może być wynikiem wielu czynników, jak: nieprawidłowy styl życia (posiłki obfitujące w zbyt duże ilości cu
krów prostych), zmniejszona aktywność fizyczna czy nadmierny stres. W przebiegu cukrzycy hiper
glikemia jest najczęściej spowodowana pominięciem lub przyjęciem zbyt małej dawki insuliny czy też le
ków przeciwcukrzycowych. Okazuje się, że spośród wielu czynników ryzyka prowadzących do hipergli
kemii niebagatelną rolę odgrywają leki przyjmowane na co dzień. Wykazano związek między stosowaniem niektórych leków (z różnych grup terapeutycznych) a ich potencjalnym działaniem hiperglikemizującym.
Jest to istotny problem, gdyż liczba i rodzaj leków przepisywanych przez lekarzy, a także samodziel
nie stosowanych przez pacjentów wciąż wzrasta.