Ocena wybranych cech fizykochemicznych próbek oliw z oliwek i olejów

7.2.1. Oznaczanie kwasowości

Norma PN-ISO 660:1998/A1:2004 Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce –

Oznaczanie liczby kwasowej i kwasowości przedstawia zasadę oznaczenia liczby kwasowej

i kwasowości metodą zimnego rozpuszczalnika z użyciem wskaźnika dla olejów roślinnych i tłuszczów, które nie są intensywnie zabarwione. Kwasowość definiuje się jako: „zawartość wolnych kwasów tłuszczowych oznaczoną zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w tejże normie. Kwasowość wyrażona jest w procentach w odniesieniu do masy. Założeniem metody jest rozpuszczenie próby analitycznej w mieszaninie rozpuszczalników i miareczkowanie etanolowym roztworem wodorotlenku potasu. Stosowano wyłącznie odczynniki czyste do analizy a stosowana woda była destylowana o podobnym stopniu czystości. Jako rozpuszczalnika użyto alkoholu etylowego o stężeniu 96%, a także wodorotleneku potasu roztworu mianowanego w alkoholu etylowym o mianie 0,01 N. Jako wskaźnik wykorzystano fenoloftaleinę, roztwór o stężeniu 10g/l w alkoholu etylowym [95% (V/V)]. Wielkością mierzoną była kwasowość wyrażona jako procentowa zawartość wolnych kwasów tłuszczowych w przeliczeniu na kwas oleinowy. Kwasowość obliczono na podstawie wzoru: m M V WKT KOH * *100*0,282  ; gdzie:

VKOH – jest objętością użytego mianowanego roztworu wodorotlenku potasu, cm³

M – jest dokładnym stężeniem użytego mianowanego roztworu wodorotlenku potasu, w molach na litr,

m – jest masą próbki analitycznej, g.

Wykonanie oznaczenia:

Próbkę analityczną odważono z dokładnością do 0,001 g, do szklanego naczynka. Następnie naczyńko z próbą umieszczono w kolbie stożkowej. Rozpuszczoną próbkę w 5 cm³ alkoholu etylowego, miareczkowano 0,01 N roztworem KOH wobec wskaźnika fenoloftaleiny. Miareczkowanie trwało dopóki nie nastąpiła wskaźnikowa zmiana – różowa barwa fenoloftaleiny utrzymywała się przez 10 s. Jako wynik przyjęto średnią arytmetyczną dwóch równoległych oznaczeń [PN-ISO 660:1998/A1:2004].

7.2.2. Oznaczanie liczby nadtlenkowej

Metoda oznaczania liczby nadtlenkowej olejów i tłuszczów roślinnych oraz zwierzęcych a także definicje podstawowych pojęć z nią związanych opisane są w Normie PN-ISO 3960:1996 Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce – Oznaczanie liczby nadtlenkowej opisuje. Liczba nadtlenkowa według powyższej normy zdefiniowana jest jako „ilość substancji w próbce, które utleniają jodek potasu w opisanych warunkach oznaczenia, wyrażona jako milirównoważniki aktywnego tlenu w kilogramie”. Zasada oznaczenia liczby nadtlenkowej polega na poddaniu próbki analitycznej, znajdującej się w roztworze kwasu octowego i chloroformu, działaniu roztworu jodku potasu, a następnie zmiareczkowaniu wydzielonego jodu, mianowanym roztworem tiosiarczanu sodu. Do badania zastosowano odczynniki o bezwzględnej czystości analitycznej.

Nasycony roztwór wodny jodku potasu przyrządzano natomiast bezpośrednio przed badaniem. Przechowywany był on przez cały czas badania w ciemności. Roztwór tiosiarczanu sodu 0,002 N przygotowany był i mianowany bezpośrednio przez użyciem. Roztwór skrobi, o stężeniu 2 g/100 ml wody wykonany był również tuż przed wykonaniem oznaczenia. Wartość liczby nadtlenkowej [meqO2/kg] dla badanych prób obliczono ze wzoru:

m T V V LN ⁽ 1  0^{)* *1000}  ; w którym:

V0 – objętość tiosiarczanu sodu zużyta do miareczkowania próby ślepej, cm³, V1 – objętość tiosiarczanu sodu zużyta do miareczkowania próby właściwej, cm³, T – normalność użytego roztworu,

m – masa próbki, g.

Wykonanie oznaczenia:

Próbkę analityczną odważono z dokładnością do 0,001 g, do szklanego naczynka. Następnie naczyńko z próbą umieszczono w kolbie. Dodano 10 ml chloroformu, w celu rozpuszczenia tłuszczu, a następnie wprowadzono 15 ml kwasu octowego lodowatego i 1 ml roztworu jodku. Dwa pierwsze odczynniki dodano przy pomocy automatycznie ustawionych dozowników natomiast roztwór jodku potasu przy pomocy automatycznej pipety. Tak przyrządzoną mieszaninę natychmiast zakorkowano w kolbie stożkowej, po czym wytrząsano przez 1 min i na dokładnie 5 min pozostawiono w nieoświetlonym miejscu.

Po tym czasie dodano 75 ml wody destylowanej, a następnie rozpoczęto miareczkowanie uwolnionego jodu roztworem tiosiarczanu sodu (0,002 mol/l), intensywnie wstrząsając, stosując roztwór skrobi jako wskaźnik. Przeprowadzono dwa oznaczenia tej samej próbki. Jednocześnie oznaczono pomiar próby ślepej w celu sprawdzenia czystości odczynników [ PN-ISO 3960:1996].

7.2.3. Oznaczenie absorbancji w zakresie promieniowania UV

Absorbancję w zakresie promieniowania UV wykonano dla zakresu długości fal 190-320 nm, co umożliwiło obliczenie ujętych w Rozporządzeniu Komisji (EWG) Nr 2568/91 parametrów K₂₃₂, K₂₇₀ i ΔK oraz wyznaczenie widm absorbcji promieniowania. Metoda oznaczania absorbancji wyrażonej jako ekstynkcja właściwa w świetle UV opisana jest w normie PN-EN ISO 3656:2002 „Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce. Oznaczanie absorbancji w nadfiolecie wyrażonej jako ekstynkcja właściwa w świetle UV”. Zasada metody polega na przeprowadzeniu spektrofotometrycznego pomiaru absorbancji roztworu próbki w określonym zakresie długości fali w nadfiolecie. Oblicza się absorbancję dla stężenia 1g w 100 ml heksanu, w kuwecie 10 mm.

Przyrząd pomiarowy:

Spektrofotometr Genesis 6, Thermo Spectronic

Warunki pomiaru:

Do pomiaru wykorzystane zostały kuwety kwarcowe o długości drogi optycznej 10mm. Absorbancję zmierzono w zakresie 190 – 320 nm w przedziałach, co 0,5 nm.; jako rozpuszczalnik zastosowano n – heksan o czystości spektralnej.

Obliczenie wyników:

Absorbancję roztworu tłuszczu lub oleju o stężeniu 1 g w 100 ml roztworu (1%) obliczono ze wzoru: w A K₁¹_cm^%_{( )} ⁽⁾   ; w którym:

A(λ) – absorbancja przy długości fali λ,

Parametr ΔK (zmienność absorbancji w obszarze 270 nm) obliczono na podstawie wzoru: Δ 2 274 266 270 K K K  ^    ; gdzie:

K266, K270, K270 – wartość absorbancji, 1% roztworów olejów w heksanie, przy długościach fal odpowiednio równych 260, 270 i 274 nm [Rozporządzenie Komisji (EWG) Nr 2568/91].

Wykonanie oznaczenia:

Próbkę analityczną odważono z dokładnością do 0,001 g, do szklanej kolbki miarowej o pojemności 10 cm³. Kolbkę dopełniono do objętości 10 cm³ heksanem i dokładnie wymieszano. Przygotowany w ten sposób roztwór przeniesiono do kuwety i wykonano pomiar absorbancji w całym zakresie. Przed każdorazowym pomiarem kuwety kwarcowe były suche, a następnie płukane roztworami badanymi. Załącznik 7.2.3/1 zawiera dane walidacyjne metody zamieszczone w PN-EN ISO 3656:2002 [PN-EN ISO 3656:2002].

7.2.4. Oznaczanie składu kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej

Oznaczenie składa się z trzech części. Pierwsza dotyczy przygotowania estrów metylowych wg normy PN – ISO 5509:1996 „Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce. Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych”, druga oznaczenia składu kwasów tłuszczowych metoda chromatografii gazowej, natomiast trzecia wyznaczenia zawartości procentowej poszczególnych kwasów tłuszczowych na podstawie chromatogramów.

A. Przygotowanie estrów:

Otrzymanie estrów metodą wg normy PN – ISO 5509:1996 polega na zmydlaniu glicerydów i estryfikacji uwolnionych kwasów tłuszczowych w obecności BF₃. Próbkę analityczną umieszczono w ampułce (2-3 krople). Do ampułki wprowadzono 1cm³ 0,5 N metanolowego roztworu NaOH i wrzucono odtłuszczoną porcelankę. Ampułkę umieszczono w naczyniu w łaźni o temperaturze 75 ºC i prowadzono hydrolizę, przez co najmniej 10 min od momentu zaniku kropelek tłuszczu, nie dopuszczając do całkowitego odparowania rozpuszczalnika. Do wrzącego roztworu dodano 1 ml odczynnika BF₃ w metanolu i utrzymywano wrzenie przez 2 min. Następnie dodano 1cm³ heptanu i utrzymywano wrzenie przez 1 min. Po wyciagnięciu ampułki z łaźni schłodzono ją do temperatury pokojowej,

po czym dodano bezwodnego Na2SO4 oraz niewielką ilość nasyconego roztworu NaCl. Następnie kilkakrotnie odwrócono ampułkę. Kolejno dodano tyle nasyconego roztworu NaCl, aby warstwa rozpuszczalnika zawierającego estry znalazła się w szyjce ampułki. Ze względu na toksyczny charakter BF₃ czynności wykonywano pod wyciągiem. Estry kwasów tłuszczowych sporządzono bezpośrednio przed badaniem, ale ze względu na długi czas jednej analizy musiały one przez krótki czas być przechowywane w lodówce w temperaturze 4ºC.

B. Oznaczanie profilu kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej (GC):

Rozdział uzyskanych wcześniej estrów metylowych kwasów tłuszczowych uzyskano wprowadzająć je na kolumnę chromatograficzną sprzężoną z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym FID. Postawowe wytyczne dotyczące metody analizy estrów metylowych metodą chromatografii gazowej zamieszczone są w normie PN-EN ISO 5508:1996 „Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce – Analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej”.

Przyrząd pomiarowy:

Chromatograf Gazowy VARIAN 3800 z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID) oraz kolumną BPX-70 o wymiarach: 60m×0,25 mm i grubości filmu 0,25 μm.

Warunki pomiaru:

Temperatura dozownika ustawiona była na 250 ºC, natomiast temperatura detektora FID wynosiła 270 ºC. Jako gaz nośny zastosowano hel. Ciśnienie początkowe wynosiło 22,0 psi i rosło wraz ze wzrostem temperatury. Na kolumnę nanoszono 0,3 µl roztworu estrów metylowych kwasów tłuszczowych w heptanie stosując tryb podziałowy 1:100. Temperatura początkowa kolumny wynosiła 120 ºC, po czym wzrastała w tempie 8 ºC/min do 160 ºC i następnie z szybkością 1,5 ºC/min do temperatury 228 ºC.

Obliczenie udziału procentowego poszczególnych kwasów tłuszczowych

Poszczególne piki na uzyskanych chromatogramach identyfikowane były na podstawie czasów retencji substancji wzorcowych. Zastosowano wzorzec FAME MIX „37” firmy Restek, który umożliwił identyfikację wszystkich kwasów występujących w oliwie. Zawartość poszczególnych kwasów tłuszczowych wyznaczana była na podstawie uzyskanych powierzchni pod pikami, skorygowanych o współczynniki korekcyjne FID zamieszczone

w załączniku 7.2.4/1, a następnie przeliczona na zawartość procentową. Powierzchnię pod wszystkimi pikami przyjęto za 100%. Powtarzalność stosowanej metody zweryfikowano na podstawie analizy zawartości kwasów tłuszczowych uzyskanych dla próbek oliw z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia. Według normy PN-EN ISO 5508:1996 różnica między wynikami oznaczeń tej samej próbki, w tych samych warunkach, dla składników obecnych w ilości powyżej 5% (m/m) nie powinna przekraczać 3% (względnych) oznaczanej wartości.

7.2.5. Pomiar widm synchronicznych fluorescencji

Wykonano widma synchroniczne fluorescencji roztworów olejów i mieszanek olejów o stężeniu 1 g w 100 ml roztworu (1% w/o). Próbkę analityczną odważono z dokładnością do 0,001 g, do szklanej kolbki miarowej o pojemności 10 cm³. Kolbkę dopełniono do objętości 10 cm³ heksanem i dokładnie wymieszano. Przygotowany w ten sposób roztwór przeniesiono do kuwety i wykonano pomiar synchronicznych widm fluorescencji w geometrii kąta prostego w zakresie długości fali wzbudzenia 240-700 nm, przy stałej różnicy między długością fali emisji i wzbudzenia wynoszącymi odpowiednio ∆λ = 10, 30, 60 i 80 nm. Przed każdorazowym pomiarem kuwety kwarcowe były suche, a następnie dwukrotnie płukane roztworami badanymi. Próbki analizowano w trzykrotnym powtórzeniu. Pomiary przeprowadzono przy użyciu spektrofluorymetru Fluorolog 3-11 lampą ksenonową, Spex-Jobin Yvon S.A.

Warunki pomiaru:

Zastosowano parametry pomiaru synchronicznych widm fluorescencji zgodnie z zaleceniami jak w pracy Sikorskiej i in. [2005]. W czasie pomiaru utrzymywano stałe różnic między długością fali emisji i wzbudzenia równe kolejno 10, 30, 60 i 80 nm. Do pomiarów zastosowano geometrię kąta prostego. Szerokości szczelin emisji i wzbudzenia ustawione były na 2 nm. Pomiary synchronicznych widm fluorescencji wykonano w zakresie 240–700 nm w odstępach co 1 nm, z czasem integrowania 0,1 s. Jako rozpuszczalnik zastosowano n–heksan o czystości spektralnej. Do pomiaru wykorzystane zostały kuwety kwarcowe o długości drogi optycznej 10 mm.

Wykonanie oznaczenia:

Próbkę analityczną odważono z dokładnością do 0,001 g, do szklanej kolbki miarowej o pojemności 10 cm³. Kolbkę dopełniono do objętości 10 cm³ heksanem i dokładnie

wymieszano. Przygotowany w ten sposób roztwór przeniesiono do kuwety i wykonano pomiar synchronicznych widm fluorescencji w całym zakresie (240 -700 nm), przy stałej różnicy między długością fali emisji i wzbudzenia wynoszącymi odpowiednio ∆λ = 10, 30, 60 i 80 nm. Przed każdorazowym pomiarem kuwety kwarcowe były suche, a następnie płukane roztworami badanymi.