Ultrasprawna chromatografia cieczowa (UPLC)

Rozdział, a także identyfikację związków przeprowadzono na ultrasprawnym chromato-grafie cieczowym Aquity firmy Waters wyposażonym w zestaw dwustopniowej pompy gra-dientowej, automatyczny podajnik próbek oraz detektor matrycy fotodiodowej (PDA) usta-wiony na długość fali 260 nm oraz detektor mas w postaci potrójnego kwadrupola (TQD).

Rozdział przeprowadzono na kolumnie Aquity BEH C-18, o długości 100 mm i granulacji ziarna 1,7 μm. Czas analizy wyniósł 8 min, przy przepływie 0,3 ml/min. Objętość nastrzyków wynosiła 2 μl. Do obliczeń ilościowych zastosowano metodę wzorca zewnętrznego. Przy analizie ilościowej wykorzystano następujące stężenia aglikonów: daidzeina od 0,095 do 95 μg/ml, genisteina od 0,095 do 95 μg/ml, glicyteina od 0,085 do 85 μg/ml. Współczynnik determinacji dla sporządzonych krzywych kalibracyjnych wynosił nie mniej niż 0,996.

2.4. Analiza statystyczna

Wyniki przedstawiono jako średnie i odchylenie standardowe z trzech niezależnych ozna-czeń. Analizę danych przeprowadzono z wykorzystaniem programu Statistica 10.0 (StatSoft, Tulsa, OK).

3. Wyniki i dyskusja

W czasie rozdziału chromatograficznego zidentyfikowano 8 izoflawonów w następującej kolejności czasu retencji: daidzynę (7-O-glikozyd daidzeiny), glicytynę (7-O-glikozyd glicyte-iny), genistynę (7-O-glikozyd genisteglicyte-iny), 6''-O-malonylo-daidzynę, 6''-O-malonylo-glicytynę, 6''-O-malonylo-genistynę, daidzeinę, genisteinę. W przeważającej większości wykrytymi związkami były formy β-glikozydowe, aglikony występowały w znacznie mniejszych ilo-ściach. Szczegółowe wyniki analizy chromatograficznej zostały przedstawione w tabeli 1 i 2.

Wszystkie wartości przedstawiane w publikacji wyrażone są w przeliczeniu na suchą masę.

Zidentyfikowane związki pod względem budowy można przyporządkować do trzech grup izoflawonów: aglikony, β-glikozydy oraz malonylo- β-glikozydy. Ich udział w przebadanych próbkach suchych nasion soi był następujący: aglikony – 0,98% „Aldana”, 2,02% „Sante”

oraz 3,78% „Florpak”; β-glikozydy – 39,8% „Aldana”, 50,32% „Sante”, 60,45 „Florpak”;

malonylo- β-glikozydy – 60,03% „Aldana”, 47,65% „Sante”, 35,76% („Florpak”).

Tabela 1. Zawartość izoflawonów w suchych oraz moczonych nasionach soi [mg/100 g suchej masy]

Table 1. The content of isoflavones in dry and soaked soybeans [mg/100 g dry weight]

Nazwa związku Suche nasiona Moczone nasiona

Aldana Sante Florpak Aldana Sante Florpak

(n = 3) ±SD

Tabela 2. Zawartość izoflawonów w gotowanych nasionach soi poddanych wcześniejszemu procesowi moczenia, a także bezpośrednio poddanych obróbce cieplnej [mg/100 g suchej masy]

Table 2. The content of isoflavones in cooked soybeans subjected to prior process of soaking, and immediately heat-treated [mg / 100 g dry weight]

Nazwa związków Gotowane moczone nasiona soi Gotowane nasiona soi bez moczenia

Aldana Sante Florpak Aldana Sante Florpak

(n = 3) ±SD

Daidzeina 9,04±0,05 32,48±0,19 17,70±0,12 5,39±0,03 6,91±0,04 2,89±0,04 Genisteina 7,01±0,04 41,57±0,25 18,02±0,13 3,83±0,02 3,49±0,02 1,24±0,02 Daidzina 103,75±0,62 63,47±0,38 37,97±0,23 82,86±0,50 76,53±0,46 43,64±0,26 Genistina 2,40±0,02 108,13±0,65 50,06±0,30 106,11±0,64 81,36±0,49 45,89±0,28 Glicytyna 12,62±0,08 14,58±0,09 14,75±0,09 7,56±0,05 7,51±0,05 6,56±0,04 6''-O-malony-lo

daidzina 183,77±1,01 12,22±0,07 15,02±0,1 3,98±0,02 1,10±0,01 0,89±0,01 6''-O-malony-lo

genistina 37,43±0,22 14,42±0,1 15,90±0,11 10,01±0,06 1,19±0,01 0,58±0,02 6''-O-malo-nylo

glicytyna 15,41±0,09 9,91±0,06 11,69±0,8 1,06±0,01 1,64±0,03 0,90±0,01

Aglikony 16,04 74,04 35,73 9,22 10,40 4,13

β-glikozydy 118,77 36,04 102,79 196,53 165,4 96,09

Malonylo- β–

glikozydy 236,61 186,20 42,61 15,05 3,93 2,37

Suma 371,43 296,80 181,13 220,8 179,73 102,59

Zawartość izoflawonów w dojrzałych suchych nasionach soi zgodnie z bazą danych USDA [3] waha się od 161,22 (dla soi z Europy) do 388,08 mg/100 g (dla soi z USA).

W przebadanej przez Kao i wsp. [10] soi zawartość ogólna izoflawonów w suchych nasionach wynosiła 678,61 mg/100 g i była zbliżona do wartości uzyskanej dla soi „Aldana”

– 644,23 mg/100 g s.m.

Udział procentowy poszczególnych grup izoflawonów w przebadanym przez nich materia-le kształtował się na następującym poziomie: aglikony – 4,04%, β-glikozydy – 17,28% oraz malonylo-β-glikozydy – 78,67%. Wartości te różniły się od wyników przedstawionych w niniejszej publikacji. Najbardziej zbliżona pod względem udziału wyszczególnionych grup izoflawonów była soja „Aldana”. Porównując wyniki uzyskane przez Kao i wsp. [10] dla moczonych nasion soim zaobserwowano wzrost zawartości aglikonów: daidzeiny 2,5 razy, zaś genisteiny około 3,6 razy.

Rys. 1. Graficzne zestawienie wyników ogólnej zawartości izoflawonów w przebadanych próbkach soi [mg/100 g suchej masy]

Fig. 1. Graphical comparison of results of the total content of isoflavones in soy samples tested [mg / 100 g dry weight]

Dla przeanalizowanych próbek soi wzrost zawartości poszczególnych aglikonów mieścił się w granicy od 1,7 do 7,3 razy – genisteina oraz 2,3 do 11,8 razy – daidzeina. W swoich badaniach Kao i wsp. [10] wykazali, że poza wzrostem form aktywnych doszło do dużego spadku ilości pozostałych grup izoflawonów. Największe straty zanotowano dla malonylo-β- -glikozydów – około 60%, natomiast dla β-glikozydów około 54%. Podobne wartości uzyska-no dla β-glikozydów, średnie straty tych związków wyuzyska-nosiły około 52%. W przypadku malo-nylo-β-glikozydów wartości te wynosiły odpowiednio: „Aldana” – 2,4%, „Florpak” – 2% oraz

„Sante” – około 43% w porównaniu z suchymi nasionami.

W soi moczonej poddanej gotowaniu zaobserwowano spadek ogólnej zawartości izofla-wonów w stosunku do próbek kontrolnych o 28,8% („Sante”), 42,3% („Aldana”) oraz 48,8%

(„Florpak”). We wszystkich próbkach największe straty odnotowano dla malonylo-β- -glikozydów w ilościach: 38,8% („Aldana”), 66,3% („Florpak”) oraz 81,6% („Sante”). Naj-większe straty izoflawonów zaobserwowano w próbkach poddanym gotowaniu z pominięciem moczenia. Spadek zawartości izoflawonów w porównaniu do próbki kontrolnej oscylował od 56,9% („Sante”) do 71% („Florpak”). Dla wszystkich próbek największy spadek zawartości odnotowano dla malonylo-β-glikozydów (średnio o 97,4%).

W wyniku moczenia soi dochodzi do powiększenia objętości komórek poprzez wchłonię-cie dużej ilości wody przez ściany komórkowe. Dochodzi także do rozluźnienia całej struktury komórkowej, dzięki czemu następuje równomierne uwodnienie składników nasion w szcze-gólności substancji polisacharydowych (w tym pęcznienie ziaren skrobi) oraz białkowych.

Stosując moczenie, skrócono czas obróbki termicznej o 1 godzinę w porównaniu z gotowa-niem suchych nasion. Moczenie nasion, z punktu widzenia technologicznego, nie tylko po-zwala skrócić czas obróbki termicznej, ale także przyczynia się do częściowego zredukowania ilości substancji wzdymających (galaktocukrów – stachiozy, rafinozy i werbaskozy) poprzez ich wymywanie [9, 17].

4. Podsumowanie

1. Całkowita zawartość izoflawonów w przebadanych próbkach suchych nasionach soi była zróżnicowana i wahała się od 353,7 do 644,2 mg/100 g s.m. Związkami dominującymi w suchych nasionach były: malonylo- β-glikozydy, następnie β-glikozydy, w mniejszych ilościach występowały aglikony.

2. Istotny wpływ na ogólną zawartość izoflawonów w przebadanych próbkach soi odegrały przeprowadzone operacje technologiczne: moczenie oraz gotowanie nasion.

3. Moczenie nasion w wodzie powodowało obniżenie ogólnej zawartości izoflawonów śred-nio o 27,6 %. W próbkach podanych gotowaniu po wcześniejszym moczeniu występował spadek zawartości izoflawonów średnio o 39,7 %. Natomiast największe straty izoflawo-nów zaobserwowano w soi gotowanej bez wcześniejszego moczenia, średnio o 65,3 %.

4. W próbkach soi „Aldana” i „Florpak” poddanych moczeniu oraz późniejszemu gotowaniu zaobserwowano wzrost zawartości aglikonów.

5. Bibliografia

[1] Andersen M. 2006. Flavonoids: Chemistry, biochemistry & application, Taylor & Francis Group, Boca Raton.

[2] Banaszkiewicz T. 2011. Nutritional Value of Soybean Meal, Soybean and nutrition, 9, 1–20.

[3] Bhagwat S., Haytowitz D.W., Holden J.M.. 2008. USDA Database for the Isoflavone Content of Selected Foods, Release 2.0, 1–8.

[4] Cieślik E. 2005. Cechy prozdrowotne żywności pochodzenia roślinnego. Referat. 2–3 czerwca, Ogólnopolska sesja popularnonaukowa – VII edycja „Środowisko a zdrowie”

Częstochowa.

[5] Czerpak R., Pietryczuk A. 2009. Aktywność biologiczna izoflawonoidów i ich znaczenie terapeutyczne i kosmetyczne, Postępy Fitoterapii, 2 : 113–121.

[6] Dalluege J.J., Eliason E. 2003. Simultaneous Identification of Soyasaponins and Isofla-vones and Quantification of Soyasaponin B in Soy Products, Using Liquid Chromatog-raphy/Electrospray Ionization-Mass Spectromery, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 51 : 3520–3524.

[7] Fen-Jin O., Jin-Qiang Ch. 2013. Consumption of soybean, soy foods, soy isoflavones and breast cancer incidence: Differences between Chinese women and women in Western countries and possible mechanisms, Food Science and Human Wellness. 2 (3–4):

146–161.

[8] Jaganath I.B., Crozier A. 2009. Dietary Flavonoids and Compounds. W Plant Phenolics and Human Heath: Biochemistry, Nutrition and Pharamcology, Uniwersity of Glasgow, United Kingdom.

[9] Jasińska Z., Kotecki A.. 1993. Rośliny strączkowe, Wyd. Naukowe PWN, Warszawa.

[10] Kao T.H., Y Lu.F., Hsieh H.C., Chen B.H. 2004. Stability of isoflavone glucosides during processing of soymilk and tofu, Food Research International, 37: 891–900.

[11] Kohlműnzer S. 1998. Farmakognozja, podręcznik dla studentów farmacji, Wyd. Lekar-skie PZWL, Warszawa.

[12] Kwiatkowska E. 2007. Fitoestrogeny sojowe w profilaktyce chorób cywilizacyjnych, Postępy Fitoterapii, 4: 207–211.

[13] Nowak A. 2011. Nasiona soi zwyczajnej – cenny surowiec dietetyczny i leczniczy, Ko-smos: problemy nauk biologicznych, Polskie Towarzystwo Przyrodników im. Kopernika, 1–2: 179–187.

[14] Otake T., Mori H., Morimoto M., Miyano K., Ueba N., Oishi I., Kunita N., Kurimura T.

1999. Anti-HIV-1 activity of myo-inositol hexaphosphoric acid (IP6) and myo-inositol hexasulfate(IS6), Anticancer Research, 19: 3723–3726.

[15] Sikorski Z. 2007. Chemia żywności T.1 Składniki żywności, Wyd. Naukowo-Techniczne, Warszawa.

[16] Šošić-Jurjević B., Filipović B., Sekulić M. 2011. Soybean Phytoestrogens – Friends or Foes?, Recent Trends for Enhancing the Diversity and Quality of Soybean Products, 10, 131-175.

[17] Zalewski S. 2003. Podstawy technologii gastronomicznej, WN-T, Warszawa.

[18] http://www.labdiet.com/PDF/Real%20deal%20on%20IFs.pdf. Accessed 5 April 2015.

[19] http://www.postepyfitoterapii.pl/spfn.php?ktory=3832,http://www.spirulina.pl/ciekawost

ki/literatura/artykuly/fitosterole-charakterystyka-wystepowanie-przyjmowanie-przemiana-materii-dzialanie.html. Accessed 5 April 2015.

Streszczenie

Soja zwyczajna (Glycine max (L.) Merr.) jest bardzo dobrym źródłem związków fitoche-micznych, z których można wyszczególnić przede wszystkim izoflawony (fitoestrogeny).

Związki te zaliczane są do metabolitów wtórnych roślin, wykazują powinowactwo do estroge-nów, dzięki czemu oddziałują na organizm, pełniąc w nim ważne funkcje. Mogą być stosowa-ne w profilaktyce wielu chorób, przyczyniając się do poprawy stanu zdrowia oraz zwiększając odporność organizmu, m.in. regulując układ hormonalny, zmieszają ryzyko występowania chorób układu krążenia, zwiększają gęstość tkanki kostnej.

Celem badań było oznaczenie zawartości izoflawonów w wybranych nasionach soi zwy-czajnej różnych producentów („Sante” i „Florpak”) oraz polskiej odmiany „Aldana” podda-nych operacjom technologicznym: moczeniu i gotowaniu. Analizę izoflawonów przeprowa-dzono z wykorzystaniem chromatografu cieczowego sprzężonego z matrycą fotodiodową i detektorem mas w postaci potrójnego kwadrupola (UPLC-PDA-MS). Ogólna zawartość izoflawonów dla przebadanych próbek nasion soi wynosiła (wyniki w przeliczeniu na s. m.):

„Aldana” – 644,23 mg/100 g, „Sante” – 416,83 mg/100 g, „ Florpak” – 353,74 mg/100 g.

W przypadku próbek poddanych moczeniu w wodzie (24 godziny) zawartości badanych związków wynosiły: „Aldana” – 514,7 mg/100 g, „Sante” – 307,79 mg/100 g, „Florpak” – 224,32 mg/100 g. Dla przebadanych próbek soi (suche nasiona i moczone) poddanych proce-sowi gotowania wartości te wahały się od 102,58 („Sante”) do 371,43 mg/100 g („Aldana”).

Rafał WIŚNIEWSKI, Ireneusz KAPUSTA University of Rzeszów

Faculty of Biology and Agriculture

Department of Plant Food Technology and Crop Quality Sabina LACHOWICZ

Wrocław University of Environmental and Life Sciences Faculty of Food Science

Department of Fruit, Vegetable and Cereals Technology

IMPACT OF TECHNOLOGICAL OPERATIONS ON ISOFLAVONES CONTENT