Praca oryginalna Original paper
Grzyby z rodzaju Malassezia ze wzglêdu na wyra-n¹ dichotomiê w zakresie form wspó³¿ycia z organiz-mem ludzi i zwierz¹t stanowi¹ powa¿ny problem za-równo diagnostyczny, jak i terapeutyczny. Dro¿d¿aki te bytuj¹ na ogó³ jako komensale na b³onach luzo-wych i skórze wiêkszoci organizmów sta³ocieplnych. Gatunki lipidozale¿ne, jak: M. furfur, M. sympodialis, M. slooffiae, M. globosa, M. obtusa, M. restricta izo-lowane s¹ najczêciej od ludzi (13, 14, 22), natomiast M. pachydermatis, jedyny gatunek lipidoniezale¿ny zwi¹zany jest z organizmem zwierz¹t. M. pachyder-matis wystêpuje g³ównie u dzikich i domowych zwie-rz¹t miêso¿ernych, jak: psy, koty, lisy, ³asice (3, 11, 23), a tak¿e u wiñ, koni, byd³a (4, 7, 9) i ptaków (16). Pozytywny odsetek izolacji u zdrowych klinicznie zwierz¹t jest bardzo wysoki i wynosi rednio oko³o 49% (11), przy czym liczba ta zale¿y w du¿ym stop-niu od miejsca pobrania materia³u. W zewnêtrznym kanale s³uchowym M. pachydermatis wykazano u 32,5% badanych zwierz¹t (11), na b³onach luzo-wych pochwy i odbytu u oko³o 40-52% (3, 11), a w przestrzeniach miêdzypalcowych u oko³o 60% bada-nej populacji (11).
Pod wp³ywem zmian zachodz¹cych w mikrorodo-wisku grzyba, os³abienia mechanizmów obronnych gospodarza lub innych, trudnych do okrelenia przy obecnym stanie wiedzy czynników, Malassezia spp.
mo¿e ulec konwersji w formê patogenn¹, odpowie-dzialn¹ za szereg procesów chorobowych. Szczepy lipi-dozale¿ne uczestnicz¹ u ludzi, miêdzy innymi, w etio-logii ³upie¿u pstrego, ³ojotokowego zapalenia skóry i mieszków w³osowych oraz atopowego zapalenia skó-ry (13). U zwierz¹t, a zw³aszcza psów, rzadziej kotów, M. pachydermatis odpowiedzialny jest za 30-80% przypadków zapalenia zewnêtrznego przewodu s³ucho-wego (otitis externa) i za oko³o 30% przypadków ³o-jotokowego zapalenia skóry (dermatitis) (30).
W ostatnich latach obserwuje siê wyran¹ zmianê profilu gatunków Malassezia wystêpuj¹cych u ludzi i zwierz¹t. Zoofilne szczepy M. pachydermatis izolo-wane s¹ obecnie coraz czêciej ze zmian skórnych, a nawet przypadków fungemii u ludzi (10, 20). Rów-noczenie lipidozale¿ne gatunki Malassezia zwi¹za-ne, jak siê wydawa³o, z cz³owiekiem, pojawiaj¹ siê u ró¿nych gatunków zwierz¹t (9). Odnotowano nawet pojedyncze przypadki izolacji lipidozale¿nych szcze-pów Malassezia od psów z objawami otitis externa (8).
Ustalenie czynnika etiologicznego infekcji wyma-ga w tej sytuacji nie tylko izolacji i identyfikacji grzy-ba, ale przede wszystkim wykazania jego patogen-noci. Badania prowadzone w tym kierunku znacznie utrudnia, obok podobieñstwa morfologicznego i fizjo-logicznego wystêpuj¹cego w obrêbie lipidozale¿nych
Fenotypowy profil patogennoci
szczepów Malassezia pachydermatis
ANETA NOWAKIEWICZ, GRA¯YNA ZIÓ£KOWSKA
Zak³ad Mikrobiologii Weterynaryjnej Instytutu Chorób Zakanych i Inwazyjnych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin
Nowakiewicz A., Zió³kowska G.
Phenotypic profile of the pathogenicity of Malassezia pachydermatis strains
Summary
Considering the fact that certain phenotypic properties found in M. pachydermatis strains can indirectly indicate their pathogenicity, we have evaluated the morphological traits of the fungus (cell size and shape as well as colony type), expression of extracellular hydrolases (API-ZYM) and the activity of catalase, urease, casein, beta-glucosidase, phospholipase and the Tween hydrolases: 20, 40, 60 and 80. Considering the source of the analyzed strains origin as a differentiation criterium (animals clinically healthy and with otitis externa symptoms), it was found that the isolates obtained from the pathological material were generally (80%) characterized with a smooth growth type of light cream, large or medium-sized colonies, as well as high a activity of lipolytic enzymes, such as phospholipase and hydrolase Tween 80 and valine arylamidase, cystine arylamidase and basic phosphatase. Determining a profile of M. pachydermatis phenotypic characteristics may substantially facilitate defining the pathogenicity of the strains isolated directly from the clinical material.
gatunków Malassezia, wysoki stopieñ heterogennoci i zmiennoæ fenotypo-wa M. pachydermatis. Uwzglêdnia-j¹c fakt, ¿e zmiennoæ w obrêbie ga-tunku M. pachydermatis mo¿e byæ, miêdzy innymi, odzwierciedleniem stopnia ekspresji cech odpowiedzial-nych za patogennoæ drobnoustrojów, celem badañ by³o ustalenie fenotypo-wych cech grzyba, mog¹cych mieæ zwi¹zek z jego chorobotwórczoci¹. Materia³ i metody
Badaniami objêto 40 szczepów Malassezia pachyder-matis, wytypowanych z kolekcji w³asnej Zak³adu Mikro-biologii Weterynaryjnej Instytutu Chorób Zakanych i In-wazyjnych Akademii Rolniczej w Lublinie oraz szczep referencyjny tego samego gatunku CBS 7925 pochodz¹cy z kolekcji Centraalbureau voor Schimmelcultures Holandia. Szczepy M. pachydermatis izolowane by³y z zewnêtrz-nego kana³u s³uchowego od psów zdrowych klinicznie (n = 20) oraz z klinicznymi objawami stanu zapalnego (oti-tis externa) (n = 20). Szczepy pochodz¹ce od zwierz¹t chorych typowano do badañ jedynie w przypadku, kiedy izolowane by³y z materia³u chorobowego w czystej kultu-rze, bez towarzysz¹cej flory bakteryjnej czy grzybiczej, a zastosowana u psów terapia przeciwgrzybicza przynosi³a pozytywne efekty. Na tej podstawie przyjêto, ¿e M. pachy-dermatis by³a w tych przypadkach czynnikiem etiologicz-nym otitis externa, a wyizolowane szczepy by³y patogenne. Makromorfologiê i mikromorfologiê szczepów M. pa-chydermatis okrelono wed³ug schematu przedstawionego w pierwszej czêci pracy (24). Aktywnoæ enzymatyczn¹ badano w zakresie ekspresji: zewn¹trzkomórkowych hyd-rolaz (API-ZYM), katalazy (12), b-glukozydazy (10), ure-azy, kazeinure-azy, fosfolipazy (11) oraz hydrolaz Tweenów 20, 40, 60, 80 i Cremophoru EL (12, 14). Dok³adna proce-dura badañ oraz zasady interpretacji wyników przedstawio-ne zosta³y we wczeniejszym opracowaniu (24).
Wyniki i omówienie
Wysoki stopieñ zmiennoci fenotypowej w obrêbie szczepów M. pachydermatis wykazany zarówno w badaniach w³asnych (32), jak i w pracach innych autorów (8, 11) by³ przes³ank¹ do podjêcia prób usta-lenia korelacji pomiêdzy morfologicznymi i bioche-micznymi cechami grzyba a jego patogennoci¹. Ba-dania morfologiczne wytypowanych szczepów wyka-za³y, ¿e izolaty pochodz¹ce od psów z objawami otitis externa (szczepy patogenne) wytwarza³y na ogó³ (80%) kolonie bia³e lub jasnokremowe, g³adkie, redniej wiel-koci lub du¿e (tab. 1). Kolonie ciemnokremowe, szorstkie, ma³e lub redniej wielkoci charakteryzo-wa³y w wiêkszoci (60%) szczepy izolowane od zwie-rz¹t zdrowych klinicznie (tab. 1). Typ kolonii zwi¹za-ny by³ prawdopodobnie z budow¹ chemiczn¹ ciazwi¹za-ny komórkowej, a dok³adnie z zawartoci¹ i rodzajem nie-nasyconych kwasów t³uszczowych (30). Ponadto wy-soka zawartoæ wydzieliny o charakterze lipidowym
towarzysz¹ca stanom zapalnym zewnêtrznego przewo-du s³uchowego, zapewniaj¹c dogodne warunki do wzrostu dro¿d¿aków i ich szybkiej proliferacji, umo¿-liwia prawdopodobnie rozwój infekcji u tych zwierz¹t (3). Wykazano, ¿e M. pachydermatis posiadaj¹c mo¿-liwoæ wbudowywania egzogennych kwasów t³uszczo-wych (15), ma zdolnoæ wysokiej adaptacji do warun-ków rodowiska. Nale¿y przypuszczaæ, ¿e sk³ad i za-wartoæ lipidów w skórze mo¿e w sposób istotny wp³y-waæ na metabolizm i wzrost komórek grzyba, a tym samym u³atwiaæ im kolonizacjê. Potwierdzeniem po-wy¿szej sugestii mo¿e byæ obserwacja, ¿e infekcja na tle Malassezia spp. towarzyszy na ogó³ chorobom zwi¹zanym ze zmianami w wydzielaniu i sk³adzie ³oju skóry (cukrzyca, nadczynnoæ tarczycy, niedoczynnoæ kory nadnerczy) (25).
Za heterogennoæ szczepów M. pachydermatis w wysokim stopniu odpowiedzialny jest równie¿ ich garnitur enzymatyczny, zarówno w zakresie sk³adu, jak i ekspresji poszczególnych elementów. Wiadomo, ¿e ró¿nego rodzaju endo- i egzoenzymy umo¿liwiaj¹ grzy-bom kolonizacjê organizmu gospodarza, a tak¿e od-grywaj¹ istotn¹ rolê w jego patogennoci. Hydrolazy rozk³adaj¹c miêdzy innymi wi¹zania peptydowe bia-³ek (proteazy), lipidy (lipazy i fosfolipazy) i polisa-charydy (glukozydazy), dostarczaj¹ grzybom niezbêd-nych sk³adników od¿ywczych, a tym samym warun-kuj¹ ich wzrost i namna¿anie siê, czêsto przy ograni-czonym dostêpie do po¿ywienia. Enzymy o charakte-y p e z c z S e c ¹ z d o h c o p t ¹ z r e i w z d o e i k d a ³ g e i n o l o K Kolonieszorstkie e ³ a M m m 1 < 1-r2edmnmie >D2um¿em <M1am³em 1-r2edmnmie >D2u¿mem h c y w o r d Z 0 2 = n 2775*,,7666, 23A,40,63 8569,,16358,,7134,1 26A,16244,94, 16A9,044, h c y r o h C 0 2 = n , 2 3 , 8 2 , 6 2 , 5 5 , 6 4 , 7 3 3 3 1 , 1 8 , 8 7 , 6 3 , A 4 1 , 3 0 1 , 9 8 , 4 7 7 4 1 , 4 0 1 77 38,43 47A
Tab. 1. Makromorfologia szczepów M. pachydermatis pochodz¹cych od zdrowych i chorych zwierz¹t
Objanienie: * numer szczepu
p y t o i B Szczepypochodz¹ceodzwierz¹t h c y w o r d z chorych I 34*,90 36,78 II 63,66,76,86 II I 16a,26a 14a,74,89,133 V I 59,73,138 55,147,37 V 23a,27,75,124,141 28,32 I V 26,46,81,103,104 II I V 65,94 38,47a,77 e n o z c a n z o e i n 40,64 43
Tab. 2. Biotypy szczepów Malassezia pachydermatis izolowa-nych od zdrowych i chorych zwierz¹t
a 6 1 5 20 10 5 40 5 0 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 150 a 3 2 20 20 10 5 40 5 10 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 160 a 6 2 10 20 10 0 40 5 0 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 150 7 2 20 20 20 10 40 5 10 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 175 0 4 5 20 20 0 40 0 0 0 0 40 10 0 0 0 0 20 0 0 0 155 4 4 30 10 20 10 40 10 5 0 0 40 40 0 0 0 0 5 0 0 0 210 9 5 10 20 5 0 40 5 0 0 0 30 10 0 0 0 0 10 0 0 0 130 3 6 5 10 10 0 40 0 0 0 0 40 10 0 0 0 0 5 0 0 0 120 4 6 5 20 20 0 40 0 0 0 0 40 10 0 0 0 0 20 0 0 0 155 5 6 30 20 10 10 40 0 0 0 0 40 20 0 0 0 0 20 0 0 0 190 6 6 5 30 10 0 40 0 0 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 135 3 7 10 30 20 10 40 10 0 0 0 40 20 0 0 0 0 10 0 0 0 190 5 7 10 20 20 10 40 20 10 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 180 6 7 5 20 10 0 20 0 0 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 105 6 8 5 20 5 0 40 0 0 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 120 0 9 30 20 20 0 40 5 5 0 0 40 40 0 0 0 0 10 0 0 0 210 4 9 30 20 10 5 40 5 5 0 0 30 30 0 0 0 0 5 0 0 0 180 4 2 1 20 20 20 5 40 5 5 0 0 40 10 0 0 0 0 5 0 0 0 170 8 3 1 10 20 10 5 40 5 0 0 0 40 5 0 0 0 0 20 0 0 0 155 1 4 1 10 30 20 0 40 5 0 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 155 * a 4 1 10 20 5 5 40 5 0 0 0 40 5 0 0 0 0 0 0 0 0 130 * 6 2 30 20 20 5 40 10 5 0 0 40 20 0 0 0 0 0 0 0 0 190 * 8 2 30 10 10 10 40 5 10 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 180 * 2 3 5 20 10 5 40 10 10 0 0 40 10 0 0 0 0 5 0 0 0 155 * 6 3 20 10 20 10 40 5 10 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 180 * 7 3 10 30 20 5 40 5 5 0 0 40 20 0 0 0 0 10 0 0 0 185 * 8 3 40 20 20 5 40 5 10 0 0 40 20 0 0 0 0 20 0 0 0 220 * 3 4 20 10 10 10 40 10 10 0 0 20 5 0 0 0 0 5 0 0 0 140 * 6 4 30 10 10 0 40 5 0 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 160 * a 7 4 30 20 20 10 40 5 0 0 0 40 20 0 0 0 0 20 0 0 0 205 * 5 5 10 30 20 10 40 10 0 0 0 40 20 0 0 0 0 10 0 0 0 190 * 4 7 10 20 10 0 40 5 0 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 150 * 7 7 30 20 10 0 40 5 5 0 0 40 20 0 0 0 0 20 0 0 0 190 * 8 7 20 10 10 10 40 10 10 0 0 40 20 0 0 0 0 10 0 0 0 180 * 1 8 40 10 20 5 40 20 5 0 0 40 10 0 0 0 0 5 0 0 0 195 * 9 8 20 10 10 0 30 5 0 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 125 * 3 0 1 20 10 10 0 40 20 10 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 175 * 4 0 1 40 10 10 0 40 20 5 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 190 * 3 3 1 10 10 10 5 40 5 0 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 145 * 7 4 1 30 20 10 0 40 5 0 0 0 40 20 0 0 0 0 10 0 0 0 175 S B C 5 2 9 7 30 20 20 5 40 10 10 0 0 40 10 0 0 0 0 20 0 0 0 205
Nr szczepu/stan kliniczny Fosfataza zasadowa Esteraza c4 Esteraza lipazy c8 Lipaza c14 Arylamidaza leucynowa Arylamidaza walinowa Arylamidaza cystynowa Trypsyna a-chymotrypsyna Fosfataza kwana Naftaleno-AS-BI-fosfohydrolaza a-galaktozydaza b-galaktozydaza b-glukuronidaza a-glukozydaza b-glukozydaza
n-acetylo-b-glukozamidaza
a-mannozydaza a-fukozydaza Aktywnoæ szczepu (nmol) Tab. 3. Profile enzymatyczne szczepów M. pachydermatis (n = 40)
rze lipolitycznym i proteolitycznym mog¹ ponadto wp³ywaæ destrukcyjnie na b³ony komórek gospodarza, umo¿liwiaj¹c rozprzestrzenianie siê grzybów w orga-nizmie (29). Interesuj¹cym wiêc wydawa³o siê okre-lenie wspó³zale¿noci miêdzy ustalonym w badaniach wczeniejszych (24) biotypem szczepu M. pachyder-matis a jego pochodzeniem (w³aciwoci patogenne). Wykazano (tab. 2), ¿e stopieñ korelacji by³ w tym za-kresie zró¿nicowany i jedynie dwa biotypy grupowa³y jednorodne pod wzglêdem pochodzenia szczepy. Bio-typ II, charakteryzuj¹cy siê szorstkim Bio-typem wzrostu i bardzo nisk¹ aktywnoci¹ metaboliczn¹, obejmowa³ szczepy izolowane od zdrowych klinicznie psów, pod-czas gdy biotyp VI, cechuj¹cy siê g³adk¹ form¹ dyso-cjacyjn¹ kolonii i bardzo wysok¹ ekspresj¹ aktywno-ci enzymatycznej, grupowa³ patogenne szczepy M. pa-chydermatis (tab. 2).
Szczegó³owa analiza obu badanych grup grzybów (szczepy komensaliczne i szczepy patogenne) w za-kresie ekspresji egzogennych hydrolaz (API-ZYM) pozwoli³a ustaliæ, ¿e bez wzglêdu na pochodzenie, M. pachydermatis cechuje wysoka aktywnoæ aryla-midazy leucynowej i fosfatazy kwanej oraz brak eks-presji trypsyny, a-chymotrypsyny, a i b-galaktozyda-zy, b-glukuronidab-galaktozyda-zy, n-acetylo-b-glukuronidab-galaktozyda-zy, a-mannozydazy i a-fukozydazy (tab. 3). Uzyskane wy-niki zgodne z wczeniejszymi danymi (17) sugeruj¹, ¿e powy¿szy profil enzymatyczny jest charakterystycz-nym wzorcem metaboliczcharakterystycz-nym dla gatunku M. pachy-dermatis. Ekspresja pozosta³ych enzymów jest zró¿-nicowana (tab. 3) i zale¿na w pewnym stopniu od po-chodzenia badanego szczepu. Szczepy patogenne wy-kazywa³y istotnie wy¿sz¹ (p < 0,005) aktywnoæ w zakresie fosfatazy zasadowej, arylamidazy walino-wej i arylamidazy cystynowalino-wej, natomiast szczepy ko-mensaliczne charakteryzowa³a wysoka ekspresja (p < 0,005) esterazy C4 (tab. 4).
W przypadku rodzaju Malassezia udzia³ enzymów proteolitycznych w kolonizacji organizmu gospodarza oraz patogennoci zarazka jest stosunkowo ma³o po-znany. Prado i wsp. (26) w badaniach in vitro wykaza-li ekspresjê tych enzymów u wiêkszoci szczepów Malassezia i przez analogiê z rodzajem Candida czy Cryptococcus sugerowali ich istotn¹ rolê w patogene-zie infekcji poprzez degradacjê elementów uk³adu od-pornociowego, takich jak immunoglobuliny, sk³ado-we dope³niacza, laktoperoksydaza czy cytokiny (1, 21). W przypadku grzybów z rodzaju Malassezia, poza informacj¹, ¿e proteazy stymuluj¹ proliferacjê keraty-nocytów in vitro (28) i mog¹ byæ czynnikami oddzia-³uj¹cymi dra¿ni¹co na zakoñczenia nerwów czucio-wych w skórze, wywo³uj¹c wi¹d (28), brak bli¿szych danych na ten temat.
Istotnie statystycznie wy¿sza aktywnoæ szczepów Malassezia wyizolowanych z przypadków chorobo-wych, w zakresie fosfatazy zasadowej mo¿e wiad-czyæ o znacz¹cej roli tego enzymu nie tylko w proce-sach metabolicznych, ale tak¿e w patogennoci
dro¿d¿aków (2), miêdzy innymi przez supresyjne od-dzia³ywanie na produkcjê nadtlenku wodoru w trak-cie wybuchu tlenowego w neutrofilach (27).
Poszerzenie charakterystyki fenotypowej szczepów Malassezia pachydermatis o badanie ich aktywnoci w zakresie testów stosowanych jako kryteria ró¿nico-wania miêdzygatunkowego dla rodzaju Malassezia (12) umo¿liwi³o dok³adniejsze ustalenie stopnia i za-kresu ich heterogennoci. Wyniki przedstawione w tab. 5 wskazuj¹ na zró¿nicowany stopieñ aktywnoci grzy-bów w tym zakresie, jednak ze wzglêdu na trudnoci w analizie porównawczej danych, a tak¿e celem u³a-twienia ich interpretacji i obiektywizacji, oznaczenia + lub zast¹piono cyframi przy za³o¿eniu, ¿e + = 1, ++ = 2, +++ = 3, ++++ = 4, = 1, = 2, = 3, = 4, bw (bez wp³ywu) = 0. Wykazano, ¿e szczepy izolowane od psów z objawami otitis externa charakteryzowa³y siê istotnie wy¿sz¹ (p < 0,005) ak-tywnoci¹ sumaryczn¹ w badanym zakresie, w porów-naniu do szczepów komensalicznych (tab. 6). Podwy¿-szona ekspresja dotyczy³a g³ównie enzymów lipoli-tycznych, jak fosfolipaza, enzymów hydrolizuj¹cych Tween 80, a tak¿e, w znacznie mniejszym stopniu Tween 40 i 60. Wra¿liwoæ na inhibicyjne dzia³anie Tweenu 20 i Cremophoru EL by³a nieznacznie pod-wy¿szona w stosunku do szczepów patogennych (tab. 5 i 6).
W przypadku grzybów z rodzaju Malassezia enzy-my lipolityczne zapewniaj¹ mo¿liwoæ prze¿ycia
za-m y z n E Szczepypochodz¹ceodzwierz¹t h c y w o r d z chorych a w o d a s a z a z a t a f s o F 1(39,,775) (2121,,71)5*** 4 C a z a r e t s E 20(5,0,15)* 1(66,,800) 8 C y z a p il a z a r e t s E 1(54,,07)0 1(53,,125) 4 1 C a z a p i L (34,,715) (44,,715) a w o n y c u e l a z a d i m a l y r A 3(28,,02)0 3(49,,450) a w o n il a w a z a d i m a l y r A 4(4,5,80) 8(5,5,04)* a w o n y t s y c a z a d i m a l y r A 2(3,5,80) 4(4,7,54)* a n a w k a z a t a f s o F 3(39,,00)0 3(49,,400) a z a l o r d y h o f s o f-I B -S A -o n e l a tf a N 1(141,,040) 1(56,,79)5 b-glukozydaza 8,75 ) 0 , 6 ( (74,,765) m e ³ ó g O 1(1583,,21)5 1(1732,,800)
Tab. 4. Aktywnoæ enzymatyczna Malassezia pachydermatis w zale¿noci od ród³a pochodzenia szczepu (nmol)
Objanienia: * ró¿nica istotna statystycznie (p < 0,005), ** odchylenie standardowe
równo w rodowisku zewnêtrznym, jak i w organizmie gospodarza (10, 14, 19), jednoczenie mog¹ odgry-waæ istotn¹ rolê w jego patogenno-ci. Degradacja powierzchniowych li-pidów skóry nie tylko dostarcza grzybom sk³adników niezbêdnych do wzrostu, ale równie¿ mo¿e eks-ponowaæ receptory na komórkach gospodarza. Dostêpnoæ receptorów oraz silne w³aciwoci hydrofobowe grzyba (31) znacznie u³atwiaj¹ pro-ces jego adherencji, a nastêpnie ko-lonizacjê makroorganizmu, co mo¿e umo¿liwiæ pierwsze stadium infek-cji (31). Ponadto uwolnione podczas hydrolizy wolne kwasy t³uszczowe wywieraj¹ wielokierunkowy wp³yw na uk³ad immunologiczny gospoda-rza; dzia³aj¹ miêdzy innymi hamu-j¹co na proliferacjê limfocytów T, co w efekcie obni¿a ich cytotoksyczn¹ aktywnoæ (18), hamuj¹ aktywacjê fagocytów oraz stymuluj¹ stan zapal-ny poprzez dra¿ni¹ce oddzia³ywanie na skórê (18). Lipaza obni¿a ponad-to wewn¹trzkomórkowe procesy za-bijania granulocytów oraz hamuje ich chemotaksjê (31).
Fosfolipaza odpowiedzialna za uszkadzanie b³on komórkowych go-spodarza wydaje siê jednym z istot-nych markerów patogennoci grzy-bów z rodzaju Malassezia (6). Jej ekspresja wzrasta wraz ze wzrostem fosfolipidów w rodowisku, co mo¿e byæ nastêpstwem tocz¹cego siê pro-cesu zapalnego (26). Zwiêkszona ak-tywnoæ fosfolipazy, cechuj¹ca szczepy wyizolowane z przypadków otitis externa w obecnych badaniach, potwierdzona równie¿ przez innych autorów (5, 29), wskazuje na bezpo-redni udzia³ tego enzymu w pato-genezie schorzeñ wywo³ywanych przez M. pachydermatis.
Reasumuj¹c nale¿y stwierdziæ, ¿e szczepy M. pachydermatis izolowa-ne od psów z klinicznych przypad-ków otitis externa i spe³niaj¹ce ogól-nie przyjête kryteria patogennoci dla tego gatunku grzyba, charakte-ryzowa³y siê na ogó³ g³adkim typem wzrostu o jasnokremowych, du¿ych lub rednich koloniach oraz wysok¹ ekspresj¹ enzymów lipolitycznych, jak fosfolipaza i hydrolaza Tweenu 80, a tak¿e arylamidazy walinowej u n e e w T a zi l o r d y H 0 2 40 60 80 a 6 1 ++ + ++ + ++ b.w. a 3 2 ++++ + + ++++ ++ ++ +++ a 6 2 +++ ++++ + ++ ++ + +/ 7 2 ++++ +++ ++++ ++ ++++ ++++ +++ 0 4 +++ ++ ++ ++ + +++ + 4 4 ++++ ++ ++++ ++++ ++ ++ +++ + 9 5 +++ +++ + ++ ++ b.w. ++++ +++ + 3 6 ++++ +++ + ++++ +++ ++ + 4 6 ++ ++++ ++++ ++ +++ +++ ++++ 5 6 +++ ++ ++ ++++ ++ ++ ++ ++ 6 6 +++ ++ + ++ ++ +++ +++ + 3 7 ++++ +++ + ++++ +++ ++++ ++ 5 7 ++ +++ ++++ ++++ ++ ++ + 6 7 ++ +++ ++++ ++ +++ ++++ ++ 6 8 ++++ ++++ ++++ ++ +++ ++ 0 9 ++++ +++ ++++ ++++ ++++ ++ + ++ 4 9 ++++ +++ + ++++ ++ ++++ ++++ ++ 4 2 1 ++++ +++ + ++++ b.w. +++ +++ ++ 8 3 1 +++ +++ + ++ ++ +++ ++ 1 4 1 ++++ +++ ++++ ++ +++ +++ +++ * a 4 1 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + +++ * 6 2 ++++ ++ ++ ++++ ++ +++ ++++ * 8 2 ++ ++ + ++++ +++ ++++ +++ * 2 3 ++++ +++ ++++ ++++ b.w. +++ + b.w. * 6 3 ++++ +++ ++++ ++++ ++ +++ +++ ++ * 7 3 ++ +++ + ++++ ++ +++ +++ +++ * 8 3 ++++ + + ++++ ++++ ++++ ++++ * 3 4 +++ +++ + ++ b.w. ++++ +++ +++ * 6 4 +++ ++ ++++ ++ ++ +++ ++++ ++ * a 7 4 ++++ ++++ + ++ ++ ++ ++++ +++ * 5 5 ++++ ++ ++++ ++++ ++ +++ +++ ++ * 4 7 ++++ +++ + ++ ++++ +++ +++ +++ * 7 7 ++ +++ ++++ ++++ ++ b.w. ++ +++ +++ * 8 7 ++ +++ ++++ ++++ +++ +++ ++++ * 1 8 ++++ +++ ++++ ++ ++++ +++ +++ +++ * 9 8 +++ ++++ ++++ ++ ++ ++ ++ ++ * 3 0 1 ++++ +++ ++++ ++ ++ b.w. ++ ++ +++ * 4 0 1 +++ ++++ ++++ ++ ++ b.w. +++ +++ +++ * 3 3 1 ++++ +++ ++ ++++ ++++ ++++ * 7 4 1 ++++ ++ ++++ ++++ ++ +++ +++ ++ S B C 5 2 9 7 ++++ +++ ++++ ++++ ++ ++ +++ +++
Tab. 5. Aktywnoæ enzymatyczna szczepów Malassezia testy dodatkowe (n = 40)
Objanienie:* szczepy pochodz¹ce od chorych zwierz¹t Nr szczepu Katalaza Ureaza Kazeinaza b- glukozydaza Fosfolipaza Cremophor EL
i cystynowej (aminopeptydazy) i fosfatazy zasadowej. Powy¿szy profil fenotypowych cech M. pachyderma-tis mo¿e stanowiæ znaczne u³atwienie w oznaczaniu patogennoci szczepów izolowanych z materia³u kli-nicznego.
Pimiennictwo
1.Antul Z., Rasheed M., Choudhary M. J., Rosanne S., Khan K. M., Rahman A.: Kinetics of novel competitive inhibitors of urease enzymes by a focused library of oxadiazoles, thiadiazoles and triazoles. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 319, 1053-1063.
2.Baca O. G., Roman M. J., Glew R. H.: Acid phosphatase activity in Coxiella burnetii: a possible virulence factor. Infect. Immun. 1993, 61, 4232-4239. 3.Bond R., Lamport A. J., Lloyd D. H.: Colonization status of Malassezia
pachydermatis on the hair and in the hair follicle of healthy beagle dogs. Res. Vet. Sci. 2000, 68, 291-293.
4.Breuer-Strosberg R., Hocheithner M., Kuttin E. S.: Malassezia pachyder-matis isolation from a scarlet mascaw. Mycoses 1990, 33, 247-250. 5.Cafarchia C., Otranto D.: Association between phospholipase production
by Malassezia pachydermatis and skin lesions. J. Clin. Microbiol. 2004, 42, 4868-4869.
6.Coutinho S. D., Paula C. R.: Proteinase, phospholipase, hyaluronidase and chondroitin-sulphatase production by Malassezia pachydermatis. Med. Myco-logy 2000, 38, 73-76.
7.Crespo M. J., Abarca M. J., Cabanes F. J.: Occurence of Malassezia spp. in horses and domestic ruminants. Mycoses 2002, 45, 333-337.
8.Crespo M. J., Abarca M. L., Cabanes F. J.: Atypical lipid-dependent Malas-sezia species isolated from dogs with otitis externa. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 2383-2385.
9.Duarte E. R., Melo M. M., Hahn R. C., Hamdan J. S.: Prevalence of Malas-sezia species in the ears of asymptomatic cattle with otitis in Brasil. Med. Mycology 1999, 37, 159-162.
10.Gueho E., Boeghout T., Ashbee H. R., Guillot J., Van Belkum A., Faerge-mann J.: The role of Malassezia species in the ecology of human skin and as pathogens. Med. Mycology 1998, 36, 220-229.
11.Guillot J., Bond R.: Malassezia pachydermatis: a review. Med. Mycology 1999, 37, 295-306.
12.Guillot J., Gueho E., Lesourd M., Midgley G., Chevrier G., Dupont B.: Iden-tyfication of Malassezia species: A practical approach. J. Mycol. Med. 1996, 6, 133-110.
13.Gupta A. K., Batra R., Bluhm R., Boekhout T., Dawson T. I.: Skin diseases associated with Malassezia species. Gupta A. K., Batra R., Bluhm J. Am. Acad. Dermatol. 2004, 51, 785-798.
14.Gupta A. K., Kohli Y., Faergemann J., Summerbell R. C.: Epidemiology of Malassezia yeasts associated with pityriasis versicolor in Ontario, Canada. Med. Mycology 2001, 39, 199-206.
15.Huang H. P., Little C. J. L.: Effects of fatty acids on the growth and compo-sition of Malassezia pachydermatis and their relevance to canine otitis exter-na. Res. Vet. Sci. 1993, 55, 119-123.
16.Inamader A. C., Palit A.: The genus Malassezia and human disease. Indian J. Dermatol. 2003, 69, 265-270.
17.Mancianti F., Rum A., Nardoni S., Carazza M.: Extracellular enzymatic acti-vity of Malassezia species. Mycopathologia 2000, 149, 131-135.
18.Masuda A., Sukegawa T., Mizumoto N., Tani H., Miyamoto T., Sasai K., Baba E.: Study of lipid in the ear canal in canine otitis externa with
Malasse-19. Mayser P., Haze P., Papavassilis C., Mickel M., Gruender K., Gueho E.: Differentiation of Malassezia species: selectivity of Cremophor EL, castor oil and ricinoleic acid for Malassezia furfur. Br. J. Dermatol. 1997, 137, 208-213.
20. Mickelsen P. A., Viano-Paulson M. C., Stevens D. A., Diaz P. S.: Clinical and microbiological features of infection with Malassezia pachydermatis in high-risk infant. J. Infect. Dis. 1988, 6, 1163-1168.
21. Miyoshi S., Shinoda S.: Microbial metalloproteases and pathogenesis. Microbes Infect. 2000, 2, 91-98. 22. Nakabayashi A., Sei Y., Guillot J.:
Identification of Malassezia species isolated from patients with seborrhoeic dermatitis, atopic dermatitis, pity-riasis versicolor and normal subjects. Med. Mycology 2000, 38, 337-341. 23.Nakagaki K., Hata K., Iwata E., Takeo K.: Malassezia pachydermatis
isola-ted from a South American Sea Lion with dermatitis. J. Vet. Med. Sci. 2002, 62, 901-903.
24.Nowakiewicz A., Zió³kowska G.: Fenotypowa charakterystyka szczepów Malassezia pachydermatis. Medycyna Wet. (Praca przyjêta do druku L. Dz. 110/2005).
25. Patterson A. D., Frank L. A.: How to diagnose and treat Malassezia derma-titis in dogs. Vet. Medicine 2002, 8, 612-622.
26. Prado M. R., Brito E. H. S., Girao M. O., Monteiro A. J., Sidrim J. J. C., Rocha M. F. G.: Higher incidence of Malassezia pachydermatis in the eyes of dogs with corneal ulcer than in healthy dogs. Vet. Microbiol. 2004, 100, 115--120.
27. Reilly J. J., Baron G. S., Nano F. E.: Characterization and sequence of a respiratory burst inhibiting acid phosphatase from Francisella tularensis. J. Biol. Chem. 1996, 271, 10973-10983.
28. Richard Ch. T., Halliwell E. W., Hill P. B.: Failure to extracts from Malasse-zia pachydermatis to stimulate canine keratinocyte proliferation in vitro. Vet. Dermatol. 2002, 13, 323-329.
29. Serda Kantarciogolu A., Yiickel A.: Phospholipase and protease activities in clinical Candida isolates with reference to the sources of strains. Mycoses 2002, 45, 160-165.
30. Staroniewicz Z., Król J., Cierpisz J.: Flora bakteryjna i grzybicza w otitis externa u psów. Medycyna Wet. 1995, 51, 667-670.
31. Stehr F., Kretschmar M., Kroger C., Hube B., Schafer W.: Microbial lipases as virulence factor. J. Mol. Catal. B: Enzymatic 2003, 22, 347-355. 32. Zió³kowska G., Nowakiewicz A.: Wystêpowanie grzybów z rodzaju
Malasse-zia w zewnêtrznym kanale s³uchowym u psów. Medycyna Wet. 2004, 60, 310-313.
Adres autora: dr hab. Gra¿yna Zió³kowska prof. AR, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin; e-mail: g.ziolkowska@ar.lublin.pl
Objanienia: * ró¿nica istotna statystycznie (p < 0,005), ** odchylenie standardowe
y p e z c z S e n a w o l o zi :t ¹ z r e i w z d o Suma h c y w o r d Z 3,3 2,75 2,0 3,0 0,6* 3,25 2,6 2,6 2,8 1,8* (123,3,0)*0* h c y r o h C 3,4 2,85 2,8 2,7 1,8* 2,80 2,1 3,0 3,0 2,8* 1(27,,42)5
Katalaza Ureaza Kazeinaza b- glukozydaza Fosfolipaza Cremophor EL Tween 20 Tween 40 Tween 60 Tween 80
Tab. 6. Aktywnoæ enzymów Malassezia pachydermatis w testach dodatkowych w zale¿noci od ród³a pochodzenia szczepów wartoci rednie
