Medycyna Wet. 2007, 63 (3) 318
Praca oryginalna Original paper
W zwi¹zku z narastaj¹cym ci¹gle zagro¿eniem zmniej-szania siê populacji dzikich kotowatych konieczne jest systematyczne uzupe³nianie wiedzy o ich rozrodzie oraz udoskonalanie procedur biotechnologicznych. Poniewa¿ pozyskiwanie gamet od gatunków dzikich kotowatych jest trudne, a czêsto niemo¿liwe, podstawowym mode-lem badañ pozostaje kot domowy. Dotychczas opraco-wano ró¿ne metody pozyskiwania gamet, dojrzewania in vitro (IVM in vitro maturation) i zap³odnienia in vitro (IVF in vitro fertilization). Wyniki IVF uwieñczone urodzeniem koci¹t opublikowali po raz pierwszy Good-rowe i wsp. w 1988 r. (4). Jednak ci¹gle jeszcze efektyw-noæ tych metod u kotów jest ni¿sza w porównaniu ze zwierzêtami laboratoryjnymi lub gospodarskimi. Wa¿nym elementem jest dobór dawczyñ oocytów, które póniej przeznacza siê do IVM. Porównywano, miêdzy innymi, zale¿noæ dojrzewania oocytów od pory roku, w której pobierano jajniki, wieku kotek oraz fazy cyklu (17). Ba-dania te wymagaj¹ jednak uzupe³nienia, miêdzy innymi w zakresie mo¿liwoci dojrzewania in vitro oocytów po-chodz¹cych od ró¿nych dawczyñ w odniesieniu do aktu-alnego stanu ich macic.
Pomimo intensywnych poszukiwañ wyniki IVM ko-towatych ci¹gle znacznie ró¿ni¹ siê od uzyskiwanych u zwierz¹t gospodarskich i laboratoryjnych. Do stadium metafazy II (M II) oocyty wiñ dojrzewaj¹ w 76-86%
(11), myszy 70-85% (13), a byd³a 97% (19). U kota do-mowego najwy¿ej 50-65% oocytów osi¹ga stadium M II (10, 18). Luvoni i Oliva (9) uzyskali oko³o 10-11% oocy-tów dojrza³ych. Wykazali, ¿e zakoñczenie dojrzewania j¹drowego nastêpuje zwykle w czasie pierwszych 24 godzin inkubacji, co nie jest zgodne z wynikami innych autorów, którzy najlepsze rezultaty osi¹gnêli po 40-48 godzinach (3), czyli w czasie, kiedy dochodzi do owula-cji po kryciu naturalnym. Wyniki innych badañ (8) upo-wa¿ni³y do wyciagniêcia wniosku, ¿e podzia³ j¹dra do stadium metafazy II odbywa siê w dwóch falach: dojrze-wanie oocytów pierwszej fali zachodzi w czasie 26 go-dzin (przy czym wiêkszoæ oocytów dojrzewa w czasie od 17-18 godzin), drugiej za po 28-30 godzinach IVM. Ten dwufalowy model dojrzewania znajduje odzwiercied-lenie w obecnoci dwóch populacji oocytów o ró¿nych stopniach dojrza³oci. W wyniku badañ nad IVM u kota uzyskano podobne proporcje oocytów w M II po 24 go-dzinach, jak i po 48 godzinach dojrzewania (2, 8).
Dotychczas brak jest badañ przedstawiaj¹cych zale¿-noci miêdzy stanem patomorfologicznym macicy a wy-nikami IVM u kotów. Ma to szczególne znaczenie w od-niesieniu do samic niezdolnych do naturalnego rozrodu, np. z powodu chorób narz¹dów rozrodczych.
Celem badañ by³o okrelenie wp³ywu stanu macicy kotek na dojrzewanie oocytów in vitro oraz mo¿liwoci
Dojrzewanie in vitro oocytów kota domowego
AGNIESZKA GRABIEC, RICARDO FAUNDEZ, ANDRZEJ MAX, MARIAN TISCHNER* Katedra Nauk Klinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Nowoursynowska 159C, 02-776 Warszawa
*Katedra Rozrodu Zwierz¹t Wydzia³u Hodowli i Biologii Zwierz¹t AR, Al. Mickiewicza 24/28, 30-059 Kraków
Grabiec A., Faundez R., Max A., Tischner M. In vitro maturation of domestic cat oocytes
Summary
The aim of this study was to compare the efficiency of in vitro maturation in relationship to pathomorphology of uterus and oocytes quality. Morphological evaluation of the uterus helped to classify the queens into one of three groups: those with normal uteri, those with transformed uteri and pregnant queens. Cumulus-oocyte complexes were separated at recovery into three types according to pigmetation, uniformity and smoothness of ooplasm, compactness and number of layers of cumulus cells, as well as integrity of zona pellucida. Oocytes were maturated for 36 hours at 38°C in M199 medium containing cysteine and 17b oestradiol. After IVM, the meiotic status of oocytes was determined and the percentage of matured oocytes was calculated in relationship to COCs quality and uterus condition. In the group with normal uterus, oocytes of class A maturated (63.93%) better than oocytes class B and C, although the differences in maturation of oocytes class A and B were not statistically significant. The worst results of IVM were for oocytes class C. In the group of transformed uterus, 55.17% of oocytes class A maturated, while in only 7.84% of oocytes class C metaphase II had been observed. Significant differences were established in availability to IVM between oocytes class A and C as well as class B and C. In the group with pregnant uteri, the highest percentage of matured oocytes was in class A (46.27%), though there are no statistically significant differences in IVM between oocytes class A and B (28.8%), and the oocytes class C maturated in only 1.82%. Only oocytes of class A and B should be qualified for IVM procedure. Pregnant queens as well as queens with transformed uteri can also serve as oocyte donors for in vitro maturation.
Medycyna Wet. 2007, 63 (3) 319 poszerzenia grupy dawczyñ oocytów o samice chore
i ciê¿arne.
Materia³ i metody
Materia³ do badañ stanowi³y jajniki i macice pochodz¹ce od 43 kotek w wieku od 6 miesiêcy do 15 lat, w wiêkszoci o fenotypie kota europejskiego. Kotki poddawano zabiegowi owariohisterektomii w celu antykoncepcji, aborcji na ¿yczenie w³aciciela lub chirurgicznego leczenia zapalenia macicy o ró¿-nym stopniu zaawansowania. Oceniano morfologicznie maci-cê, okrelaj¹c rednicê rogów, gruboæ ciany, obecnoæ p³ynu lub p³odów w jamie macicy. Na tej podstawie wyodrêbniono trzy grupy: kotki z macic¹ normaln¹ (gr. 1), zmienion¹ (gr. 2) i ciê¿arn¹ (gr. 3). W macicy normalnej nie obserwowano zmian morfologii, rogi nie by³y wype³nione patologiczn¹ zawartoci¹, ich rednica wynosi³a oko³o 5 mm przy gruboci ciany oko³o 2 mm. W grupie kotek z macic¹ zmienion¹ zmiany patologicz-ne wskazywa³y na ró¿patologicz-ne nasilenie procesu zapalpatologicz-nego, od tor-bielowatego przerostu b³ony luzowej macicy do zapalenia macicy ze zgrubieniem jej ciany i obecnoci¹ wydzieliny za-palnej. Macice ciê¿arne zawiera³y zarodki lub p³ody, b³ony p³o-dowe i wody p³op³o-dowe.
Oocyty izolowano z jajników bezporednio po zabiegu lub w czasie do 8 godzin po przechowywaniu gonad w 0,9% NaCl z dodatkiem 50 µg/ml gentamycyny (Sigma Aldrich), w tem-peraturze oko³o 4°C. Na 30-60 minut przed izolacj¹ oocytów jajniki umieszczane by³y w 2 ml zbuforowanej po¿ywki M199 + HEPES (Sigma Aldrich) z dodatkiem 3% BSA (Sigma Aldrich) w temperaturze 38°C. Oocyty pozyskiwano przez nacinanie tkanki jajnika. Wyizolowane oocyty, a w³aciwie oocyty wraz z otaczaj¹cymi je komórkami wzgórka jajonone-go (COC cumulus-oocyte complex) p³ukano dwukrotnie w wie¿ej po¿ywce M199 + HEPES o temperaturze 38°C i oceniano pod mikroskopem stereoskopowym w powiêksze-niu 40-krotnym. Stosowano schemat oceny przedstawiony wczeniej (5). Brano pod uwagê trzy elementy: jakoæ wzgór-ka jajononego, ooplazmy i os³onki przejrzystej. Wród pozys-kanych oocytów wyró¿niono trzy klasy jakoci: A (dobra ja-koæ: nienaruszona os³onka przejrzysta, zwarte komórki wzgór-ka w licznych warstwach, ooplazma o jednolitej strukturze, B (rednia jakoæ: nienaruszona os³onka przejrzysta, doæ zwarte komórki wzgórka w kilku warstwach okrywaj¹ce co najmniej po³owê powierzchni os³onki, struktura ooplazmy prawie jed-nolita lub w niewielkim stopniu zró¿nicowana) i C (z³a jakoæ: uszkodzona os³onka przejrzysta lub jej brak; nieliczne komór-ki wzgórka lub ich brak; struktura ooplazmy wyranie niejed-nolita; zniekszta³cenia oocytu).
Oocyty przeznaczone do IVM pochodzi³y od 33 kotek. Wstêpnie p³ukano je trzykrotnie, przenosz¹c za pomoc¹ pipety automatycznej za ka¿dym razem do wie¿ej po¿ywki M199 + HEPES z dodatkiem 3% BSA. Po p³ukaniu oocyty przeno-szono do czterodo³kowych p³ytek. Ka¿dy do³ek wype³niony by³ 700 µl p³ynu do dojrzewania o nastêpuj¹cym sk³adzie: p³yn M199 (Sigma) + 0,3% BSA, 1 j.m./ml hCG, 0,5 j.m./ml eCG (Intervet), 2,2 mM mleczanu wapnia, 0,36 mM pirogronianu sodu, 2 mM glutaminy, 50 µg/ml gentamycyny, 22 mg/ml NaHCO3, 0,13 mM cysteiny, 1 µl/ml 17b-estradiolu (Sigma). Wy¿ej opisan¹ po¿ywkê sporz¹dzono wed³ug sk³adu podane-go przez Pope (15) z modyfikacj¹ w³asn¹ (dodatek estradiolu). Do jednego do³ka przenoszono 10-15 oocytów i inkubowano przez 36 godzin w temperaturze 38°C z dodatkiem 5% CO2 w atmosferze. Po zakoñczeniu procedury dojrzewania oocyty oczyszczano z komórek wzgórka jajononego w roztworze hialuronidazy (1 mg/ml) przez 5 minut, a nastêpnie mecha-nicznie przez pipetowanie. Oczyszczone oocyty utrwalano
przez 24-72 godz. i barwiono acetoorcein¹ lub barwnikiem Hoechst 33258, oceniaj¹c fazê mejozy odpowiednio pod mikroskopem wietlnym i fluorescencyjnym. Utrwalacz do barwienia acetoorcein¹ sk³ada³ siê z 99% alkoholu etylowego i 76% kwasu octowego w stosunku 3 : 1. Utrwalacz do barwie-nia Hoechst sporz¹dzono z 6,19 g Na2HPO4 × 2 H2O, 2,54 g KH2PO4, 5,41 g NaCl i 125 ml 38-procentowego formaldehy-du w 1000 ml wody destylowanej.
W preparatach barwionych oceniano odsetek oocytów z pê-cherzykiem zarodkowym, rozpadem pêcherzyka zarodkowe-go, w stadium metafazy pierwszego podzia³u, telofazy pierw-szego podzia³u, metafazy drugiego podzia³u oraz oocytów zde-generowanych i podzielonych partenogenetycznie. Za oocyty dojrza³e uznawano te, które osi¹gnê³y stadium telofazy pierw-szego podzia³u lub metafazy drugiego podzia³u mejotycznego. Przeprowadzono równie¿ ocenê stadium mejozy oocytów bez-porednio po izolacji (bez IVM) z jajników od 10 kotek, które nie by³y w ci¹¿y oraz u których nie stwierdzono patologicz-nych zmian w macicy. W tym celu zastosowano barwienie acetoorcein¹. W opisie wyników dojrzewania pos³u¿ono siê nastêpuj¹cymi skrótami: GV stadium pêcherzyka zarodko-wego, GVBD stadium rozpadu pêcherzyka zarodkozarodko-wego, M I stadium metafazy pierwszego podzia³u mejotycznego, T I stadium telofazy pierwszego podzia³u mejotycznego, M II stadium metafazy drugiego podzia³u mejotycznego, D oocyty zdegenerowane, ZPS zarodki partenogenetyczne po dojrzewaniu (spontaniczny podzia³).
Otrzymane wyniki porównano w grupach testem Manna--Whitneya-Wilcoxona.
Wyniki i omówienie
Wyselekcjonowano 10 kotek z nieciê¿arn¹ prawid³o-w¹ macic¹, których oocyty poddano ocenie stadium me-jozy bezporednio po wyizolowaniu z jajników (tab. 1). Te oocyty stanowi³y grupê odniesienia wobec gamet pod-danych dojrzewaniu. Z tab. 1 wynika, ¿e wiêkszoæ (57,67%) komórek pozyskanych z jajników by³a w sta-dium GV, a zauwa¿alny odsetek (17,99%) stanowi³y oocyty w stadium GVBD. Bardzo nieznaczn¹ czêæ, wynosz¹c¹ zaledwie 1,59%, stanowi³y oocyty dojrza³e (w stadium M II). Na uwagê zas³uguje doæ wysoki od-setek gamet wykazuj¹cych zmiany degeneracyjne (17,46%). Karja i wsp. (7) prowadzili obserwacje zale¿-noci miêdzy faz¹ cyklu jajnikowego a stadium mejozy bezporednio po wyizolowaniu oocytów z jajników. Za-uwa¿yli, ¿e w fazie pêcherzykowej 9,1% oocytów znaj-dowa³o siê w stadium M II, a poza t¹ faz¹ (pêcherzyki jajnikowe < 2 mm rednicy) prawie 100% oocytów by³o w stadium GV. Wynik uzyskany w badaniach w³asnych nie nawi¹zuje bezporednio do faz cyklu jajnikowego, jednak mo¿na przyj¹æ, ¿e zdecydowana wiêkszoæ zwie-rz¹t znajdowa³a siê poza faz¹ pêcherzykow¹. Jest to oczy-wiste w przypadku zwierz¹t ciê¿arnych i bardzo praw-dopodobne w grupie kotek z macic¹ zmienion¹.
Pozo-a b z c i L w ó t y c o o m e ³ ó g o y z o j e m a i d a t S V G GVBD MI M II D 9 8 1 109(57,7) 34(17,99) 10(5,29) 3(1,59) 33(17,46)
Tab. 1. Stadia mejozy oocytów nie poddawanych dojrzewa-niu in vitro liczba (%)
Medycyna Wet. 2007, 63 (3) 320
sta³e kotki by³y poddawane rutynowemu zabiegowi ste-rylizacji, który z regu³y jest wykonywany poza ruj¹.
Procedurê IVM przeprowadzono na 779 oocytach. Wyniki dojrzewania w zale¿noci od stanu macicy przed-stawia tab. 2. W grupie kotek z macic¹ normaln¹ do do-wiadczenia wykorzystano 297 komórek pobranych z jajników 14 zwierz¹t. Najlepiej dojrzewa³y oocyty kla-sy A (63,93%), chocia¿ nie zaobserwowano statystycz-nie istotnej ró¿nicy w porównaniu do grupy B (45,76%). Zdecydowanie najgorzej dojrzewa³y oocyty klasy C. Od 9 kotek z macic¹ zmienion¹ poddano dojrzewaniu 235 oocytów. Dojrza³o odpowiednio 55,17% i 30,95% oocy-tów klas A i B, podczas gdy tylko 7,84% oocyoocy-tów klasy C osi¹gnê³o stadium metafazy II. Istotne ró¿nice zaob-serwowano w efektywnoci IVM miêdzy oocytami klas A i B w porównaniu do oocytów klasy C. W grupie z macic¹ ciê¿arn¹ by³o 10 kotek, od których poddano dojrzewaniu 247 oocytów. Równie¿ w tej grupie najwiêk-szy odsetek oocytów dojrza³ych stwierdzono w klasie A. Nie wykazano ró¿nic istotnych statystycznie pomiêdzy efektywnoci¹ dojrzewania oocytów klasy A i klasy B. Dojrzewanie oocytów klasy C w tej grupie ogó³em wy-nios³o 1,82%, a tylko w przypadku jednej kotki osi¹gnê-³o 11,11%.
Wyjciowa jakoæ oocytów jest cile skorelowana z wynikami dojrzewania, zap³odnienia i podzia³ów za-rodkowych w warunkach in vitro. Z³a jakoæ oocytów (klasa C) skutkuje zredukowanym zdolnociami do za-koñczenia mejozy. Jest to t³umaczone tym, ¿e niektóre z takich oocytów pochodz¹ z pêcherzyków znajduj¹cych siê w koñcowej fazie wzrostu lub wczesnym etapie atrezji, a wówczas organella komórkowe s¹ niekomplet-ne i niew³aciwie rozmieszczoniekomplet-ne, wystêpuje tak¿e nie-dostatek kropli lipidowych, które w czasie wzrostu oocytu rozmieszczone s¹ w centrum ooplazmy, daj¹c jej ciemne zabarwienie. Niedawne badania wykaza³y, ¿e u kotów oko³o 65% pêcherzyków ma cechy atrezji; poza sezo-nem rozrodczym wp³ywa na to obni¿one stê¿enie FSH. Powstaje zatem pytanie, czy wiêkszoæ oocytów jest zdol-na do pe³nego dojrzewania cytoplazmatycznego in vitro, które jest istotnym warunkiem w procesie aktywacji oocy-tu, zap³odnienia i rozwoju zarodkowego. Niska efektyw-noæ IVM/IVF mo¿e tak¿e wynikaæ z niedojrza³oci os³onki przejrzystej i ma³ej podatnoci na zwi¹zanie plem-nika i penetracjê przez plemnik. Pope i wsp. (14) wyka-zali, ¿e w dojrzewaniu in vitro metafazê II osi¹gnê³o 52% oocytów klasy A, 41% oocytów klasy B i 17% klasy C.
Obserwacje te prze³o¿y³y siê na wyniki zap³odnienia in vitro. Sporód dojrza³ych oocytów klasy C zosta³o zap³odnionych 26%, 41% oocytów klasy B i 54% oocytów klasy A. K¹tska--Ksi¹¿kiewicz i wsp. (8) po-twierdzili tak¿e zale¿noæ jako-ci oocytów i zdolnojako-ci do rzewania. Po 45 godzinach doj-rzewania in vitro uzyskano 67,3% oocytów w stadium M II w przypadku oocytów ocenio-nych wstêpnie jako bardzo dob-re i dobdob-re (typ I i II) oraz 18,5% w przypadku oocytów redniej i z³ej jakoci (typ III i IV). Wyniki te s¹ nieco wy¿sze od uzyskanych w badaniach w³asnych w odnie-sieniu do grupy z macic¹ normaln¹ oraz wyranie wy¿-sze w odniesieniu do grup z macic¹ zmienion¹ i ciê¿ar-n¹. Szczególnie wyniki dojrzewania otrzymane w grupie z macic¹ ciê¿arn¹ ró¿ni¹ siê od przytaczanych danych pimiennictwa i od wyników w³asnych w pozosta³ych grupach. Byæ mo¿e jest to zwi¹zane ze statusem endo-krynowym charakteryzuj¹cym ten stan fizjologiczny. W tym czasie zaznacza siê wp³yw wysokiego stê¿enia progesteronu, który hamuje dojrzewanie oocytów. Do-wiedziono tego u myszy (1) oraz u wiñ (12). Ci¹¿a i fa-za lutealna zwi¹i fa-zana z wysok¹ koncentracj¹ progestero-nu wp³ywa tak¿e na ograniczenie dojrzewania oocytów kocich (6). Uzyskany w badaniach w³asnych najni¿szy wynik IVM oocytów pozyskanych od kotek z macic¹ ciê-¿arn¹ skorelowany by³ z najmniejszym udzia³em oocy-tów klas A i B w tej grupie.
W tab. 3 ujêto wyniki IVM z uwzglêdnieniem ró¿nych stadiów mejozy (ryc. 1-5). Najwiêcej oocytów w M II (43,5%) uzyskano od kotek z macic¹ normaln¹, znacz-nie mznacz-niej z grup z macic¹ zmienion¹ (29,4%) i ciê¿arn¹ (24,5%). Nie obserwowano ró¿nic statystycznie istotnych pomiêdzy wynikami w grupach z macic¹ zmienion¹ i ciê-¿arn¹. Wynik redni ze wszystkich grup wyniós³ 33,0% oocytów w M II i jest on gorszy ni¿ przeciêtnie uzyski-wane wyniki, które zawieraj¹ siê miêdzy 40 a 60%, co z kolei odpowiada wynikom badañ w³asnych w odnie-sieniu do oocytów klasy A i czêciowo klasy B. Wród oocytów w ró¿nych fazach mejozy po dojrzewaniu stwier-dzono ponad 1% zarodków partenogenetycznych, które powsta³y na drodze samoistnej aktywacji w czasie doj-rzewania. Takie zjawisko samoczynnej aktywacji
zaob-Tab. 2. Dojrzewanie oocytów pozyskane od kotek z macic¹ normaln¹ (gr. 1), zmienion¹ (gr. 2) i ciê¿arn¹ (gr. 3) Objanienia: w wierszach a, b (p < 0,001); A, B (p < 0,01) a p u r G a b z c il a n l ó g O w ó t y c o o h c y n a d d o p u i n a w e z rj o d w ó t y c o o a s a l K A B C a b z c i L m e ³ ó g o e ³ a z rj o d y t y c o O Liczba m e ³ ó g o e ³ a z rj o d y t y c o O Liczba m e ³ ó g o e ³ a z rj o d y t y c o O a b z c il % ilczba % ilczba % 1 297 61 39 63,93a 177 81 45,76a 59 8 13,56b 2 235 58 32 55,17A 126 39 30,95A 51 4 17,84B 3 247 67 31 46,27A 125 36 28,80A 55 1 11,82B
Tab. 3. Fazy mejozy po dojrzewaniu oocytów pozyskanych od kotek z macic¹ normaln¹ gr. 1, zmienion¹ gr. 2 i ciê¿ar-n¹ gr. 3 (%) Objanienia: a, b (p < 0,05) a p u r G Stadiummejozy V G GVBD MI TI M II D ZPS 1 24,1 9,7 14,5 3,1 43,5a 4,1 1,0 2 28,5 8,1 20,4 3,8 29,4b 7,7 2,1 3 35,6 14,61 15,4 2,0 24,5b 6,7 1,2 m e ³ ó g O 29,2 7,2 16,6 3,0 33,0b 6,0 1,4
Medycyna Wet. 2007, 63 (3) 321 serwowano u kotów od razu
po izolacji z jajnika (16), jed-nak nie odnotowano u kotów samoistnej aktywacji w cza-sie dojrzewania in vitro. W ba-daniach w³asnych po IVM najwiêcej zarodków parteno-genetycznych uzyskano w gru-pie z macic¹ zmienion¹, za w grupach z macic¹ ciê¿arn¹ i normaln¹ wyniki by³y po-dobne. Samoistnej aktywacji w czasie dojrzewania mog¹ prawdopodobnie ulegaæ oocy-ty w stadium M II, zatem od-setek partenoidów w grupie z macic¹ normaln¹ (1,0%) od-powiada³by procentowemu udzia³owi oocytów dojrza³ych pozyskanych bezporednio po izolacji. Zdolnoæ do dojrze-wania oocytów rozpatrywana jest zwykle w kontekcie ja-koci oocytów, nie odnotowa-no natomiast dotychczas za-le¿noci wyników dojrzewa-nia od stanu macicy. Z prezen-towanych wyników badañ w³asnych wynika, ¿e stan fiz-jologiczny macicy nie ma de-cyduj¹cego wp³ywu na wynik IVM oocytów klas A i B.
Komórki pozyskiwane za-równo od dawczyñ ze stanami
patologicznymi macicy, jak i od samic ciê¿arnych mog¹ osi¹gn¹æ stadium dojrza³oci na zadowalaj¹cym poziomie. Stwierdzono, ¿e najwiêkszy wp³yw na wyniki dojrze-wania oocytów in vitro mia³a jakoæ oocytów po ich izo-lacji z jajników, niemniej jednak stan patofizjologiczny macicy pozwala równie¿ rokowaæ o efektywnoci pro-cedury dojrzewania. Z³a jakoæ oocytów (klasa C) skut-kowa³a s³abymi wynikami dojrzewania, a efektywnoæ IVM by³a na tyle niska, ¿e niezale¿nie od stanu macicy pobieranie oocytów klasy C okaza³o siê ma³o celowe. Natomiast wyniki dojrzewania w grupie z macic¹ zmie-nion¹ i ciê¿arn¹, choæ ni¿sze w porównaniu do grupy z macic¹ normaln¹, pozwalaj¹ stwierdziæ, ¿e kotki ze sta-nem zapalnym macicy lub ciê¿arne mog¹ tak¿e zostaæ dawczyniami oocytów.
Pimiennictwo
1.Eppig J., Koide S.: Effects of progesterone and oestradiol-17b on the spontha-neous meiotic maturation of mouse oocytes. J. Reprod. Fertil. 1978, 53, 99-101. 2.Goodrowe K. L., Hay M., King A.: Nuclear maturation of domestic cat ovarian
oocytes in vitro. Biol. Reprod. 1991, 45, 466-470.
3.Goodrowe K. L., Howard J. G., Schmidt P. M., Wildt D. E.: Reproductive biolo-gy of the domestic cat with special reference to endocrinolobiolo-gy, sperm function and in vitro fertilization. J. Reprod. Fertil. Suppl. 1989, 39, 73-90.
4.Goodrowe K. L., Wall R. J., OBrien S. J., Schmidt P. M., Wildt D. E.: Develop-mental competence of domestic cat follicular oocytes after fertilization in vitro. Biol. Reprod. 1988, 39, 355-372.
5.Grabiec A., Modliñski J. A.: Pozyskiwanie i klasyfikacja oocytów kocich. Me-dycyna Wet. 2003, 59, 146-149.
6.Johnston L. A., OBrien S. J., Wildt D.E.: In vitro maturation and fertilization of domestic cat follicular oocytes. Gamet Res. 1989, 24, 343-356.
7.Karja N. W. K., Otoi T., Murakami M., Fahrudin M., Suzuki T.: In vitro matura-tion, fertilization and development of domestic cat oocytes recovered from ovaries collected at three stages of reproductive cycle. Theriogenology 2002, 57, 2289-2298.
8.K¹tska-Ksi¹¿kiewicz L., Ryñska B., Kania G., Smor¹g Z., Gajda B., Pieñkow-ski M.: Timing of nuclear maturation of nonstored and stored domestic cat oocy-tes. Theriogenology 2003, 59, 1567-1574.
9.Luvoni G. C., Oliva O.: Effect of Medium-199 and fetal calf serum on in vitro maturation of domestic cat oocytes. J. Reprod. Fertil. Suppl. 1993, 47, 203-207. 10.Luvoni G. C., Pellizzari P., Battocchio M.: Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. J. Reprod. Fertil. Suppl. 1997, 51, 93-98.
11.Mattioli M., Bacci M. L., Galeati G., Seren E.: Effects of LH and FSH on the maturation of pig oocytes in vitro. Theriogenology 1991, 36, 95-105. 12.McGaughey R. W.: The culture of pig oocytes in minimal medium, and the
in-fluence of progesterone and estradiol-17b on meiotic maturation. Endocrinol. 1977, 100, 39-45.
13.Polañski Z.: In vivo and in vitro maturation rate of oocytes from two strains of mice. J. Reprod. Fertil. 1986, 78, 103-109.
14.Pope C. E., McRae M. A., Plair B. L., Keller G. L., Dresser B. L.: In vitro and in vivo development of embryos produced by in vitro maturation and in vitro fertilization of cat oocytes. J. Reprod. Fertil. Suppl. 1997, 51, 69-82. 15.Pope C. E., Schmidt R., Dresser B. L.: In vitro development of cat embryos
produced by in vitro fertilization is enhanced by addition of cysteine to the matu-ration medium and reduced O2 atmosphere. Theriogenology 1999, 51, 291-291.
16.Pushett D. A., Gunn I. M., Trounson A. O.: Retrieval of parthenotes embryos from the ovaries of domestic cats. Theriogenology 1997, 47, 404-404. 17.Spindler R. E., Wildt D. E.: Circannual variations in intraovarian oocyte but not
epidydymal sperm quality in the domestic cat. Biol. Reprod. 1999, 61, 188-194. 18.Wood T. C., Wildt D. E.: Effect of the quality if the cumulus oocyte complex in the domestic cat the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. J. Reprod. Fertil. 1997, 110, 355-360.
19.Younis A. I., Brackett B. G., Fayrer-Hosken R. A.: Influence of serum and hormones on bovine oocyte maturation and fertilization in vitro. Gamete Res. 1989, 23, 189-201.
Adres autora: dr Agnieszka Grabiec, Siedliska 35d, 05-500 Piaseczno; e-mail: agnieszka.grabiec@neostrada.pl
Ryc. 1. Stadium GV, barwienie Hoechst
33258 Ryc. 2. Stadium MI, barwienie hematoksylin¹
Ryc. 3. Stadium MII,
barwie-nie Hoechst 33258 Ryc. 4. Stadium MII, bar-wienie Hoechst 33258, kon-trast fazowy
Ryc. 5. Nieprawid³owy prze-bieg mejozy rozproszone chromosomy, Hoechst 33258
