Biotechnologia rozrodu zwierząt gospodarskich

RAPORTY CZŁONKÓW REDAKCJI

Adres do korespondencji Zdzisław Smorąg, Instytut Zootechniki, 32-083 Balice k. Krakowa.

biotechnologia

4 (59) 30-40 2002

Biotechnologia rozrodu zwierząt gospodarskich

Zdzisław Smorąg

Instytut Zootechniki, Zakład Fizjologii Rozrodu Zwierząt, Balice k. Krakowa

Reproductive biotechnology of farm animals Summary

This paper presents the most important research and application of bio­

technology of farm animals reproduction: semen sexing, embryo in vitro produc­

tion, embryonic and somatic cloning and transgenesis.

Key words:

farm animals, biotechnology, reproduction, sperm sexing, embryo IVP, clon­

ing, transgenesis.

Biotechnologiczne metody rozrodu zwierząt stanowią istot­

ny element hodowli i produkcji zwierzęcej. Ich zaawansowanie wynika z rozwoju nauk biologicznych, a w szczególności takich specjalności jak: fizjologia, endokrynologia, embriologia, biolo­

gia molekularna czy eniobiologia. Możliwości, jakie stwarzają dla hodowli biotechnologiczne metody rozrodu odnoszą się do kilku ważnych problemów z punktu widzenia produkcyjnego oraz dobrostanu zwierząt, takich jak lepsze wykorzystanie potencjału rozrodczego samców i samic, regulacja płci, wprowadzanie ge­

netycznych zmian oraz zachowanie zdrowotności zwierząt.

Skala zainteresowań badawczych oraz praktycznego wyko­

rzystania omawianych metod u poszczególnych gatunków zwierząt jest uzależniona zarówno od ich gospodarczego zna-

czenia, jak też specyfiki gatunkowej rozrodu, a zwłaszcza od wydajności rozrodczej gatunku.

W opracowaniu przedstawiono najbardziej istotne badania i praktyczne zastoso­

wania metod biotechnologii rozrodu zwierząt gospodarskich w kilkunastu ostatnich latach. Zaprezentowano możliwości i ograniczenia metod oraz perspektywy ich roz­

woju. Omówiono także stan badań na świecie oraz ich zaawansowanie w kraju od­

noszące się do biotechnologii rozrodu ssaków gospodarskich.

1. Regulacja płci na poziomie gamet i zarodków

Płeć rodzącego się potomstwa ma istotne znaczenie, zarówno z punktu widze­

nia hodowli i selekcji zwierząt, jak też chowu zwierząt dla celów towarowych. Roz­

wijane i stosowane są zatem metody seksowania zarodków oraz nasienia. Biorąc pod uwagę dysproporcję możliwości rozrodczych samic i samców jest oczywiste, że w praktyce bardziej atrakcyjna jest regulacja płci poprzez użycie do zapłodnienia plemników pożądanej płci.

1.1. Seksowanie nasienia

Zainteresowanie tym problemem datuje się od kilkudziesięciu lat, czyli od mo­

mentu wprowadzenia sztucznego unasieniania do praktyki. Próby opracowania me­

tody seksowania nasienia do momentu pojawienia się cytometrii przepływowej były nieskuteczne. Przełom nastąpił wraz z wprowadzeniem tej metody. Wiele badań z tego zakresu przeprowadzonych w ostatnim dziesięcioleciu stworzyło możliwości seksowania nasienia samców zwierząt gospodarskich z ok. 90% dokładnością. Do niedawna dużym ograniczeniem metody była stosunkowo niewielka szybkość anali­

zy i sortowania plemników wynosząca praktycznie około kilkuset komórek na se­

kundę. Dla potrzeb standardowej inseminacji była to szybkość niewystarczająca.

W ostatnich latach nastąpił istotny postęp w rozwoju cytometrycznego seksowa­

nia nasienia umożliwiający już, pod pewnymi warunkami, praktyczne zastosowanie metody dla potrzeb hodowli. Postęp osiągnięto dzięki zastosowaniu cytometru o wie­

lokrotnie większej w stosunku do przyrządów standardowych szybkości analizy oraz modyfikacji dyszy (1). Tak wyspecjalizowany cytometr przepływowy jest zdolny do osiągnięcia przepływu ok. 70 milionów plemników na godzinę o czystości sorto­

wania wynoszącej powyżej 90%. Przy założeniu mniejszej, bo wynoszącej ok. 75%

czystości sortowania, szybkość sortowania można znacząco zwiększyć. Zakładając, że liczba plemników w standardowej dawce inseminacyjnej dla bydła wynosi 16 min plemników, można w ciągu godziny uzyskać przeszło 4 dawki. Istnieje jednak moż­

liwość znacznego zredukowania liczby plemników w dawce inseminacyjnej, jeśli za­

stosowana zostanie inseminacja domaciczna. Dotyczy to również takich gatunków

Zdzisław Smorąg

jak Świnie czy owce. Na uwagę zasługują tu doświadczenia przeprowadzone przez Seidla i wsp. (2). Autorzy we współpracy z firmą XY (Ft. Collins Co) inseminowali do- macicznie tysiąc jałówek, uzyskując wyniki płodności jedynie o 10% niższe od obser­

wowanych w grupie kontrolnej. Proporcja płci urodzonego potomstwa potwier­

dzająca dokładność sortowania wynosiła ok. 90%.

Z praktycznego punktu widzenia bardzo istotna, zwłaszcza w przypadku bydła, jest możliwość zamrażania sortowanego nasienia. Możliwość taką potwierdziły ba­

dania prowadzone przez Schenka i wsp. (3), Johnsona (4), a także Seidla i wsp. (2), którzy uzyskali wycielenia po inseminacji nasieniem sortowanym (przy dokładności sortowania wynoszącej ok. 90%) i mrożonym oraz dawce inseminacyjnej zawie­

rającej 1,5 min plemników.

Na podstawie przedstawionych możliwości specjalizowanych na seksowanie nasie­

nia cytometrów przepływowych w kilku krajach świata rozpoczęto stosowanie meto­

dy do celów praktycznych. Uzyskiwane wyniki seksowania nasienia są na tyle zachę­

cające, że uzasadniają próby praktycznego zastosowania tej metody w Polsce. Szcze­

gólnie ważne zwłaszcza w hodowli bydła, gdzie z powodów BSE doszło do ogranicze­

nia popytu na mięso wołowe, są oczekiwania hodowców na zwierzęta płci żeńskiej.

W Instytucie Zootechniki prowadzone są od szeregu lat badania nad zastosowa­

niem cytomerii przepływowej w biotechnologii rozrodu zwierząt m.in. dla potrzeb oceny zdolności zapładniającej nasienia (5) oraz jego seksowaniem (6,7). Obecnie prowadzi się te prace z użyciem cytometru specjalizowanego na seksowanie nasie­

nia. Zakładamy, że w 2002 r. przeprowadzimy pierwsze inseminacje seksowanym nasieniem buhaja.

1.2. Seksowanie zarodków

jest to pewna alternatywa dla sortowania nasienia na frakcję męską i żeńską.

W latach dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku podstawową metodą określania płci zarodków przeżuwaczy stała się identyfikacja sekwencji DNA specyficznych dla chro­

mosomu Y przy użyciu PGR. Metoda pozwala na seksowanie zarodków przed ich przeniesieniem do zsynchronizowanych biorczyń. Osiągana dokładność seksowania wynosi ok. 95%, a uzyskiwane wyniki przenoszenia takich zarodków wynoszą od 50 do 70% (8). Metoda nie jest stosowana rutynowo. Wynika to z przesłanek ekono­

micznych, gdyż uzyskiwanie potomstwa o pożądanej jednej płci na tej drodze związane jest z niewykorzystaniem połowy będących do dyspozycji zarodków, któ­

rych produkcja mimo stosowania superowulacji czy metod pozaustrojowej produk­

cji jest wciąż ograniczona.

W kraju seksowanie zarodków bydlęcych na skalę laboratoryjną było stosowane przez Waydę i wsp. (9). Z powodzeniem zostały przeprowadzone również przez Płucienniczaka i wsp. badania, których celem było znałezienie nie opatentowanych sekwencji DNA, charakterystycznych dla chromosomu Y (10).

2. Pozaustrojowa produkcja zarodków

Rozwój metod pozaustrojowej produkcji zarodków przypada na lata dziewięć­

dziesiąte ubiegłego wieku. Najwięcej badań z tego zakresu wykonano na bydle.

W przypadku tego gatunku pozaustrojowa produkcja zarodków stosowana jest już na skalę praktyczną. Ocenia się, że w Europie około \0% zarodków wykorzystywa­

nych w programach przenoszenia zarodków jest uzyskiwanych w warunkach in vitro.

Pozaustrojowa produkcja zarodków jest metodą kompleksową i obejmuje trzy główne ogniwa: dojrzewanie oocytów, zapłodnienie in vitro oraz kilkudniową ho­

dowlę in vitro uzyskanych zygot. U bydła odsetek dojrzałych oocytów jest wysoki, sięga bowiem 80-90%, a około 70% z nich podejmuje podziały, jednak do stadium blastocysty, w którym zarodki są przenoszone biorczyniom, rozwija się tylko około 30%. Istnieje zatem potrzeba poprawy efektywności technologii pozaustrojowego uzyskiwania zarodków (11,12).

Ważną metodą towarzyszącą pozaustrojowej produkcji zarodków jest przyży­

ciowe uzyskiwanie oocytów od krów-biorczyń pod kontrolą USG (13,14). Metoda umożliwia wielokrotne uzyskiwanie niedojrzałych oocytów z antralnych pęcherzy­

ków jajnikowych od niestymulowanych samic.

Problemem wymagającym wciąż lepszego rozwiązania jest poszukiwanie optymal­

nych metod hodowli in vitro umożliwiających zarówno zwiększenie odsetka rozwi­

jających się do stadium blastocysty zarodków, jak też poprawę jakości tych zarodków.

Uzyskiwane in vitro zarodki posiadają bowiem w stosunku do zarodków uzyskiwanych in vivo obniżoną zdolność implantacyjną oraz niższą podatność na kriokonserwację.

Innym niekorzystnym zjawiskiem związanym z wykorzystywaniem wyproduko­

wanych in vitro zarodków jest syndrom dużego cielęcia oraz różnych anomalii roz­

wojowych potomstwa (cyt. za 15). Wyjaśnienie przyczyn tych zjawisk jest przedmio­

tem badań.

Technologia pozaustrojowego uzyskiwania zarodków u innych gatunków zwie­

rząt gospodarskich nie jest tak rozwinięta jak u bydła. Obserwuje się znaczne różni­

ce gatunkowe i tak stosunkowo dobre efekty osiąga się w produkcji zarodków owczych (16) i kozich (17). U koni udało się uzyskać tą metodą jedynie kilka źrebiąt (18). Duże problemy stwarza zapłodnienie in vitro oocytów świńskich (19).

Metodą ułatwiającą wykorzystanie zarodków w programach hodowlanych jest ich kriokonserwacja. Opracowane zostały efektywne metody kriokonserwacji zarod­

ków bydlęcych, owczych, czy kozich (20). Wciąż nie rozwiązanym problemem jest kriokonserwacja zarodków świńskich (21). Przyczyną tego jest duża zawartość lipi­

dów w komórkach zarodków tego gatunku.

Nieco odmiennym zagadnieniem jest kriokonserwacja oocytów. Mimo znaczne­

go postępu, jaki osiągnięto w tym zakresie w ostatnich latach (22) problem nie jest jeszcze rozwiązany.

Badania nad pozaustrojową produkcją zarodków zwierząt gospodarskich są z powodzeniem rozwijane w naszym kraju. Dotyczą one w głównej mierze bydła

F

Zdzisław Smorąg

(23-25,30), ale były też prowadzone na owcach (26), kozach (27) i koniach (28).

W badaniach dotyczących produkcji in vitro zarodków bydlęcych prowadzonych przez Kątską i wsp. (29) uzyskiwana efektywność metody jest porównywalna z wy­

nikami uzyskiwanymi na świecie. Prace te koncentrują się na określeniu warunków kapacytacji nasienia (25), badaniu roli osłonki przejrzystej w procesie zapłodnie­

nia (31) oraz poszukiwaniu optymalnych metod kilkudniowej hodowli in vitro (29,30).

Podejmowane były też próby u bydła uzyskiwania zapłodnienia pozaustrojowe- go metodą niechirurgicznego wprowadzania pojedynczych plemników do cytopla- zmy oocytu - ICSl (32). W przeciwieństwie do oocytów ludzkich, gdzie metoda ta jest rutynowo stosowana, w przypadku bydła jej efektywność jest bardzo niska - odsetek uzyskiwanych na tej drodze zarodków nie przekracza kilku procent (33).

Rozwijana jest też metoda przyżyciowego uzyskiwania oocytów bydlęcych do za­

płodnienia in vitro (34,35). Innym kierunkiem badań związanym z pozaustrojową produkcją zarodków są badania prawidłowości kariotypów oocytów (36).

Technologia pozaustrojowej produkcji zarodków w Polsce nie wyszła poza skalę laboratoryjną. Jest to związane z ograniczonym zakresem stosowania przenoszenia zarodków bydlęcych z przyczyn ekonomicznych polskiej hodowli.

3. Klonowanie zarodkowe i somatyczne

3.1. Klonowanie zarodkowe

Najprostszą metodą klonowania zarodkowego jest bisekcja zarodków. Zabieg ten przeprowadzany jest w większości na zarodkach znajdujących się w stadium blasto- cysty (37,38). Bisekcja umożliwia otrzymanie monogenetycznych par bliźniąt; efek­

tywność transplantacji uzyskanych w wyniku bisekcji „połówek” w granicach 50%

można osiągnąć w przypadku użycia do zabiegu zarodków najwyższej jakości. Ob­

niżona zdolność transplantacyjna poddanych bisekcji zarodków wynika ze zreduko­

wanej o połowę w stosunku do całego zarodka liczby komórek uszczuplonej dodat­

kowo w wyniku inwazyjności metody (39). Kriokonserwacja „połówek” zarodków uzyskanych w wyniku bisekcji jest mało efektywna z powodu dalszych strat komór­

kowych jakie powstają w wyniku ich zamrażania i rozmrażania. Mimo tych ograni­

czeń metoda bisekcji zarodków znalazła praktyczne zastosowanie w programach przenoszenia zarodków bydlęcych (40).

W kraju wykorzystanie metody nie wykracza poza próby na poziomie laborato­

rium. Pierwsze monozygotyczne jagnięta (41) oraz cielęta (42) uzyskano przed pięt­

nastu laty. Interesującym, oryginalnym wkładem krajowym w tej dziedzinie było opracowanie zmodyfikowanej metody bisekcji zarodków opartej na prowokowa­

nym i zarazem kontrolowanym wylęganiu blastocyst (43). W rezultacie takiego za­

biegu redukuje się do minimum straty komórkowe, jakie mają miejsce w trakcie sto­

sowania konwencjonalnej metody bisekcji.

Następną odmianą klonowania zarodkowego jest metoda transplantacji jąder komórkowych. W odróżnieniu do metody bisekcji umożliwia ona otrzymanie klo­

nów składających się z więcej niż dwu osobników. Zainteresowanie tą metodą klo­

nowania zmalało, gdy uzyskano klony w wyniku klonowania somatycznego (44,45), a następnym tego powodem była bardzo niska efektywność tej metody (46). Naj­

bardziej łiczny klon, jaki uzyskano stosując tę metodę składał się z siedmiu cieląt (47).

Badania krajowe z zakresu klonowania metodą transplantacji jąder komórko­

wych były prowadzone na króliku (48,49). W badaniach tych możliwości rozwojowe rekonstruowanych zarodków oceniano in vitro i uzyskiwano ich rozwój do stadium blastocysty. W innych badaniach zastosowano metodę tzw. seryjnego klonowania, która zaowocowała urodzeniem się żywych króliczych klonów (50).

Odmianą klonowania zarodkowego jest klonowanie, w którym jako materiał ge­

netyczny wykorzystywane są pierwotne komórki zarodkowe. Pierwotne komórki za­

rodkowe (PKZ) uzyskuje się hodując zarodek lub jego część in vitro w warunkach, w których następuje proliferacja niektórych jego komórek w kontakcie z podłożem hodowlanym (51). Hodowla takich komórek może być pasażowana wielokrotnie stając się źródłem wprost nieograniczonej liczby komórek - dawców. Ogranicze­

niem tej metody stwierdzonym w przypadku PKZ myszy był fakt, że przeżywają po urodzeniu tylko osobniki pochodzące z zarodków, do których wykorzystywano PKZ niskich pasaży (52). Fakt ten wskazuje, jak się wydaje, że mysie PKZ w trakcie ho­

dowli in vitro tracą swoją totipotencję.

Mimo publikacji, w których autorzy sugerują otrzymanie PKZ zwierząt gospodar­

skich (53) nie ma w pełni przekonujących dowodów, że mają one właściwości PKZ.

W kraju badania nad PKZ myszy (54), a także owcy prowadzone są przez Modlińskie­

go i jego zespół (55).

3.2. Klonowanie somatyczne

Badania z zakresu klonowania somatycznego ssaków, mające już sześcioletnią historię, cieszą się nie słabnącym zainteresowaniem. Wynika to nie tylko z możli­

wości uzyskania klonów o dużej liczebności, lecz także z możliwości uzyskiwania na tej drodze zwierząt transgenicznych. Praktyczna wartość klonowania somatycznego będzie jednak uwarunkowana efektywnością metody, która na razie jest bardzo ni­

ska, bowiem liczba urodzonych zwierząt w stosunku do liczby zrekonstruowanych zarodków waha się od 1 do 2%. Pierwszym sklonowanym zwierzęciem była, jak wia­

domo, owca (56). Następne badania, jakie prowadzono nad klonowaniem zwierząt gospodarskich, dotyczyły takich gatunków jak: bydło (57), kozy (58) i świnie (59).

U wszystkich wymienionych gatunków uzyskano już sklonowane zwierzęta.

Zdzisław Smorąg

Szczególnym zainteresowaniem w ostatnich latach cieszą się badania nad klono­

waniem świni, wiąże się to bowiem z możliwością wykorzystania organów transge- nicznych świń w transplantologii u ludzi.

Badania z zakresu klonowania somatycznego zwierząt gospodarskich koncen­

trują się na wyjaśnieniu uwarunkowań i przyczyn niskiej efektywności metody. Z prac poświęconych przemodelowaniu i przeprogramowaniu jąder komórek somatycz­

nych wynika, że moment rozpoczęcia aktywności transkrypcyjnej przez zarodek nie może być czynnikiem limitującym rozwój rekonstruowanych zarodków, a przyczyny niskiej efektywności klonowania leżą gdzie indziej.

Sporo uwagi poświęcono testowaniu przydatności różnych rodzajów komó­

rek somatycznych zwierzęcia do klonowania. Były to komórki o zdefiniowanym fenotypie, jak np. komórki pęcherzykowe (60), komórki nabłonkowe jajowodu i macicy (61), komórki nabłonkowe gruczołu mlekowego (62), oraz leukocyty krwi obwodowej (63). Wykorzystywano też komórki, których fenotyp i pocho­

dzenie nie zawsze były dokładnie określone. Były to głównie komórki o morfolo­

gii flbroblastów wyprowadzone z tkanek dorosłych zwierząt, takich jak tkanka uszna czy skóra (64), mięsień najdłuższy grzbietu (65,66) oraz z fragmentów tka­

nek płodowych (67,68).

Wiele uwagi poświęcono synchronizacji cyklu komórkowego w fazie GO/Gl po­

pulacji komórek somatycznych, dawców jąder opracowując kilka sposobów syn­

chronizacji, przy czym najczęściej stosowaną metodą jest „głodzenie” (69). Nie jest to metoda odpowiednia dla synchronizacji cyklu komórek świńskich, dla których opracowano alternatywną metodę polegającą na ich hodowli in vitro do stanu pełnej konfluencji (70). Dla uzyskania komórek GO/Gl wykorzystywana jest też cytometria przepływowa w celu odsortowania populacji komórek tej frakcji (71).

Innym ważnym czynnikiem rozwoju rekonstruowanych zarodków jest sztuczna aktywacja. Uzyskiwano ją stosując różne warianty elektroaktywacji (72) lub używając do tego celu czynników chemicznych (73). Stosowane do tej pory metody aktywacji mają wiele niedostatków, trwają badania mające na celu ich wyeliminowanie.

Dużym problemem klonowania somatycznego są poważne straty postimplanta- cyjne oraz okołoporodowe. Większość poronień powodowana jest nieprawidłowym łożyskiem. Częste są też poważne defekty stwierdzone u narodzonego potomstwa takie jak pneumonia czy zaburzenia krążeniowe (74).

W krajowych badaniach z zakresu klonowania somatycznego przeprowadzonych na bydle (66), kozach (75) i owcach (76) uzyskano znaczny odsetek rozwijających się in vitro zrekonstruowanych zarodków, jednak pełnego rozwoju in vivo do tej pory nie stwierdzono. Doświadczenia skoncentrowane są m.in. na badaniach dotyczących cytometrycznej analizy i synchronizacji cyklu komórkowego oraz odsortowywaniu z badanych populacji fazy GO/Gl (77).

4. Transgeneza zwierząt

Uzyskiwanie zwierząt transgenicznych ze względu na olbrzymi potencja! cieszy się rosnącym zainteresowaniem nie tylko na świecie, ale również i w Polsce. Podsta­

wową metodą uzyskiwania zwierząt transgenicznych, zarówno laboratoryjnych jak i gospodarskich, jest mikroiniekcja egzogennego DNA do przedjądrza zapłodnionej komórki jajowej. W ostatnich latach w związku z rozwojem metod klonowania so­

matycznego powstała możliwość uzyskiwania transgenicznych zwierząt poprzez uży­

cie do klonowania jąder komórek z wprowadzonymi konstruktami genowymi. Po­

dejmowane są też próby uzyskiwania zwierząt gospodarskich przy zastosowaniu metod ukierunkowanej transgenezy, czyli osobników z wyłączonym lub zmodyfiko­

wanym genomem.

W chwili obecnej zarysowały się następujące kierunki wykorzystania transge­

nicznych zwierząt gospodarskich, których celem jest:

1) poprawa cech użytkowych zwierząt gospodarskich poprzez oddziaływanie na receptory hormonu wzrostu oraz modyfikacje dotyczące obniżenia zawartości tłusz­

czu w mięsie i zmiana jego składu (78-80);

2) szeroko rozumiana modyfikacja składu mleka polegająca na poprawie jego przyswajalności dzięki obniżeniu zawartości laktozy; wprowadzenie czynników o działaniu bakteriostatycznym; wzbogacenie składu mleka o białka mające właś­

ciwości terapeutyczne (81-83);

3) modyfikacja systemu immunologicznego świni umożliwiająca wykorzystanie transgenicznych osobników jako dawców tkanek i narządów do ksenotransplantacji (84);

4) pozyskiwanie modeli zwierzęcych przydatnych do opracowania odpowiedniej terapii w leczeniu chorób cywilizacyjnych, a także prób z terapią genową, testowa­

niem farmaceutyków oraz badaniem funkcji genów (knock-out genów) (85,86);

5) uzyskiwanie zwierząt odpornych na choroby m.in. na BSE (87).

Podstawowym problemem transgenezy zwierząt gospodarskich pozostaje niska efektywność metody oraz ograniczona oferta konstruktów genowych, interesu­

jących z punktu widzenia realizacji głównych celów transgenezy. Postęp w tym za­

kresie będzie uwarunkowany lepszym poznaniem genomu zwierząt gospodarskich oraz wynikającym z tego typowaniem właściwych genów kandydatów do modyfika­

cji. Drugim istotnym warunkiem rozwoju transgenezy zwierząt gospodarskich bę­

dzie opracowanie efektywnych metod klonowania somatycznego, wykorzystujących zmodyfikowane linie komórek.

Badania krajowe dotyczące transgenezy ssaków gospodarskich prowadzone są od blisko dziesięciu lat na takich gatunkach jak: królik (88-90), koza (91), Świnia (92) oraz bydło (93,94).

Badania z zakresu transgenezy prowadzone na królikach jako zwierzętach ho­

dowlanych dotyczyły modyfikacji genetycznych mających na celu uzyskanie nowego

p

Zdzisław Smorąg

białka w mleku (88-90), regulację wzrostu (88) oraz wyprodukowanie zwierząt od­

pornych na choroby (95). Doświadczenia z zakresu transgenezy kóz koncentrowały się na uzyskaniu zwierząt produkujących mleko o właściwościach bakteriostatycz- nych. Stosunkowo dużo badań poświęcono transgenicznym świniom. Dotyczyły one użycia genów hormonu wzrostu (96), genów modyfikujących skład mleka dla uzy­

skania właściwości bakteriostatycznych (92) oraz genów modyfikujących skład tkan­

ki tłuszczowej.

Efektem prowadzonych badań u wszystkich wymienionych gatunków zwierząt było uzyskanie DNA pozytywnych zwierząt, z których część wykazywała ekspresję transgenu.

Literatura

1. Johnson L. A., (2000), Anim. Reprod. Sci., 60-61, 93-107.

2. Seidel G. E.jr., Schenk j. L., Herickoff L. A., Doyle S. P., Brink Z., Green R. D., Gran D. G., (1999), Theriogenology, 52, 1407-1420.

3. Schenk j. L., Such T. K., Seidel G. E. j., (1999), Theriogenology, 52, 1375-1391.

4. Johnson L. A., Welch G. R., Rens W., (1999), J. Anim. Sci. (Suppl. 2), 213-220.

5. Bochenek M., Smorąg Z., Pilch J., (2001), Theriogenology, 56, 557-567.

6. Bochenek M., (2000), Ann. Anim. Sci., 26, 4, 219-226.

7. Smorąg Z., Ryńska B., Kątska L., Słota E., (1993), Anim. Sci Papers and Reports, 11, 117-120.

8. Bredbacka P., (1998), Reprod. Nutr. Dev., 38, (6), 605-613.

9. Wayda E., Plucienniczak G., Jura J., Płucienniczak A., Kątska L., Skrzyszowska M., Smorąg Z., (1995), Med. Wet., 9, 530-532.

10. Płucienniczak G., Płucienniczak A., (ł999). Acta Biochimica Polonica, 46, 4, 873-878.

11. HaslerJ. F., (1998), J. Anim. Sci., 76, Suppl. 3, 52-74.

12. Bousquet D., Twagiramungu H., Morin N., Brisson C., Carboneau G., DurocherJ., (1999), Therioge­

nology, 51, 59-70.

13. Carlin S. K., Garst A. S., Tarraf C. G., Bailey T. L., McGilliard M. L., Gibbons J. R., Ahamadzadeh A., Gwazdauskas F. C., (1999), Theriogenology, 51, 1489-1503.

14. Dieleman S.J., Hendriksen P. J. M., ViufFD., Thomsen P. D., Hyttel P., Knijn H. M., Wrenzycki C., Kruip T. A. M., Niemann H., Gadella B. M., Bevers M. M., Vos P. L. A. M., (2002), Theriogenology, 57, 5-20.

15. Wilmut 1., Young L., DeSousa P., King T., (2000), Anim. Reprod. Sci., 60-61, 5-14.

16. Crozet N., Huneau D., DeSmedt V., Theron M. C., Szollosi D., Torres S., Sevellec C., (1987), Gamete Research, 16, 159-170.

17. Rho G. J., Hahnel A. C., Betteridge K. J., (2001), Theriogenology, 56, 503-516.

18. Palmer E., Bezard J., Magistrini M., Duchamp G., (1991), J. Reprod. Fert., (Suppl.), 44, 375-384.

19. Prather R. S., Day B. N., (1998), Theriogenology, 49, 23-32.

20. Gajda B., Smorąg Z., (1998), Biotechnologia, 2, 41, 10-32.

21. DobrinskyJ. R., (1997), J. Reprod. Fertil., 52, 301-312.

22. Vajta G, (2000), Anim. Reprod. Sci., 2, 60, 357-364.

23. Kątska L., Kauffold P., Smorąg Z., Duschinski U., Torner Fł., Kanitz W., (1989), Theriogenology, 32, 767-777.

24. Kątska L., Smorąg Z., Bak M., Wierzbowski S., (1991), Medycyna Wet., 47 (4), 169-171.

25. Kątska L., Ryńska B., Smorąg Z., (1996), Anim. Reprod. Sci., 44 (1), 23-31.

26. Członkowska M., Ejsmont U., Głuszkiewicz A., Kossakowski M., Dziak J., (1991), Molec. Reprod.

Dev., 30, 34-38.

27. Kątska L., Kania G., Ryńska B., Gajda B., Smorąg Z., (2002), Med. Wet., 58 (6), 462-463.

28. Okólski A., Słonina D., Banasinska K., (1993), Equine Vet. J., (Suppl.), 15, 84-86.

29. Kątska L., Ryńska B., Smorąg Z., (1998), J. Anim. Feed Sci., 7, 353-362.

30. Duszewska A. M., Reklewski Z., Pieńkowski M., Karasiewicz J., Modliński J. A., (2000), Theriogeno- logy, 54, 1239-1247.

31. Kątska L, Kania G., Smorąg Z., Wayda E., Plucienniczak G., (1999), Reprod. Dom. Anim., 34 (3-4), 255-260.

32. Goto K., Kinoshita A., Takuma Y., Ogawa K., (1990), Vet. Rec., 127, 517-520.

33. Skrzyszowska M., Smorąg Z., Kątska L., Bochenek M., Gogol P., Kania G., Ryńska B., (2002), CzechJ.

Anim. Sci., 47 (3), 85-91.

34. Smorąg Z., Kątska L., Gogol P., Ryńska B., (1998), Anim. Sci. Pap. and Rep., 16, Suppl. 1, 57-58.

35. Smorąg Z., Gogol P., Kątska L., Jażdżewski J., (1999), Med. Wet., 55 (5), 317-320.

36. Lechniak D., Świtoński M., Sosonowski M., (1996), Theriogenology, 46, 267-277.

37. Ozil j. P., (1983), j. Reprod. Fertil., 69, 463-468.

38. Williams T. J., Elsden R. P., Seidel R. A., (1984), Theriogenology, 22, 521-531.

39. Skrzyszowska M., Smorąg Z., (1988), Theriogenology, 32, 115-122.

40. Baker R. D., (1985), Theriogenology, 23, 225 abstr.

41. Smorąg Z., Ozil j. P., Modliński j. A., Wierzchoś E., Babusik P., Skrzyszowska M., (1985), Med. Wet., 10, 627-629.

42. Skrzyszowska M., Znaniecki R., Bychawski S., Smorąg Z., (1988), Med. Wet., 7, 412-414.

43. Skrzyszowska M., Smorąg Z., Kątska L., (1997), Theriogenology, 48(4), 551-557.

44. Wilmut I., Schnieke A. E., McWhirj., Kind A. j., Campbell K. H. S., (1997), Nature, 385, 810-813.

45. Wells D. N., Misica P. M., Tervit H. R., (1999), Biol. Reprod., 60, 996-1005.

46. Stice S. L., Keefer C. L., Matthews L., (1994), Mol. Reprod. Dev., 38, 61-68.

47. Bondioli K. R., Westhusin M. E., Looney C. R., (1990), Theriogenology, 33, 165-174.

48. Modliński j. A., Smorąg Z., (1991), Mol. Reprod. Dev., 28, 361-372.

49. Skrzyszowska M., Smorąg Z., (1999), Ann. Anim. Sci., 26(4), 181-198.

50. Piotrowska K., Modliński j. A., Korwin-Kossakowski M., Karasiewicz j., (2000), Biol. Reprod., 63, 677-682.

51. Evans M. j., Kaufman M. H., (1981), Nature, 292, 154-156.

52. Nagy A., Rossant J., Nagy R., Abramow-Newerly W., Roder J. C., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8424-8428.

53. Karasiewicz j., (1995), Biotechnologia 3(30), 84-89.

54. Modliński j. A., Reed M. A., Wagner T. E., Karasiewicz j., (1996), Anim. Reprod. Sci., 42, 437-446.

55. Karasiewicz J., Szablisty E., Guszkiewicz A., Kossakowski M., Stefański G., Reed M., Modliński J. A., (1996), Roux’s Arch. Dev. Biol., 205, 437-442.

56. Schnieke A., Kind A. j., Ritchie W. A., Mycock K., Scot A. R., Ritchie M., Wilmut I., Colman A., Cam­

pbell K. H. S., (1997), Science, 278, 2130-2133.

57. Cibelli j. B., Stice S. L., Goluece P. J., Kane J. j., Jerry j., Blackwell C., et. al., (1998), Science, 280, 1256-1258.

58. Baguisi A, Behboodi E, Melican D. T., PollockJ. S., Destrempes M. M., Cammuso C. H., WilliamsJ. L., Nims S. D., Porter C. A., Midura P., Palacios M. J., Ayres S. L., Denniston R. S., Hayes M. L., Ziomek C. A., Meade H. M., Godke R. A., Gavin W. G., Overstrom E. W., Echelard Y., (1999), Nature Biotech.,

17, 456-461.

59. Onishi A., Iwamoto M., Akita T., Mikawa S., Takeda K., Awata T., Hanada H., Perry A. C. F., (2000), Science, 289, 1188-1190.

60. PolejaevaJ. A., Chen S-H., Vaught T. D., Page R. L., Mullins J., Ball S., Dai Y., Boone J., Walker S., Ay- ares D. L., Colman A., Campbell K. H. S., (2000), Nature, 407, 86-90.

61. Kato Y., Tani T., Sotomaru Y., Kurokawa K., Kato J-Y., Doguchi H., Yasue H., Tsunoda Y., (1998), Science, 282, 2095-2098.

62. Kishi M., Itagaci Y., Takakura R., Imamura M., Sudo T., Yoshinari M., Tanimoto M., Yasue H., Kashi- ma N., (2000), Theriogenelogy, 54, 675-684.

63. Galii C., Duchi R., Moor R. M., Lazzari G., (1999), Cloning, 1(3), 161-170.

64. Cho J. K., Lee B. C., ParkJ. I., Lim J. M., Shin S. J., Kim K. Y., Lee B. D., Hwang W. S., (2002), Therio­

genology, 57, 1819-1829.

Zdzisław Smorąg

65. Shiga K., Fujita T., Hirose K., Sasae Y., Nagai T., (1999), Theriogenelogy, 52, 527-535.

66. Skrzyszowska M., Shoya Y., Nagai T., Geshi M., Takenouchi N., (2000), Theriogenology, 53, 244.

67. Verma P. J., Du Z-T., Crocker L., Faast R., Grupen Ch. G., Mcllfatrick S. M., Ashman R. J., Lyons 1. G., Nottie M. B., (2000), Mol. Reprod. Dev., 57, 262-269.

Tao T., Machaty Z., Boquest A. C., Day B. N., Prather R. S., (1999), Anim. Reprod. Sci., 56, 133-141.

Zakhartchenko V., Durcova-Flills G., Stojkovic M., Schernthaner W., Prelle K., Steinborn R., Muller M., Brem G., Wolf E., (1999), J. Reprod. Fertil., 115, 325-331.

Betthauser J., Forsberg E., Augenstein M., Childs L., Eilertsen K., Enos J., Forsythe T., Golueke P., Jurgella G., Koppang R., Lesmeister, T., Mallon K., Meli G., Misica P., Pace M., Pfister-Genskow M., Strelchenko N., Voelker G., Watt S., Thompson S., Bishop M., (2000), Nature Biotech., 18, 1055-1059.

Boquest A. C., Day B. N., Prather R. S., (1999), Biol. Reprod., 60, 1013-1019.

Zhu J., Telfer E. E., Fletcher J., Springbett A., Dobrinsky J. R., DeSousa P. A., Wilmut 1., (2002), Biol.

Reprod., 66, 635-641.

Loi P., Ledda S., Fulka J. Jr., Cappai P., Moor R. M., (1998), Biol. Reprod., 58, 1177-1187.

Flill J. R., Burghardt R. C., Jones K., Long C. R., Looney C. R., Shin T., Spencer T. E., Thompson J. A., Winger Q. A., Westhusin M. E., (2000), Biol. Reprod., 63, 1787-1794.

Skrzyszowska M., Smorąg Z., Kątska L., Ryńska B., Kania G., Gajda B., Kareta W., Jurkiewicz J., (2001), Mat. II Zjazdu Towarzystwa Biologii Rozrodu, 55-56.

Plusa B., Grabarek J., Karasiewicz J., Modliński J. A., (2001), Oncology Research, 12, 286.

Kątska L., Bochenek M., Kania G., Ryńska B., Smorąg Z., (2002), Theriogenology (w druku).

Kopchick J. J., Jura J., Mukkerji P., Kelder B., (1995), Biotechnologia, 3 (30), 20-32.

Pursel V. G., Rexroad C. E. Jr., (1993), J. Anim. Sci., 71(Suppl. 3), 10-19.

Solomon M. B., Pursel V. G., (1992), J. Anim. Sci., (Suppl.) 69, 342.

VilotteJ. L., L’Huiller P., MercierJ. C., (1998),J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 3 (3), 351-362.

Pintado B., Goutierrez-Adan A., (1999), Reprod. Nutr Dev., 39(5-6), 535-544.

Stromqvist M., Floudebine M., Andersson J. 0., Edlund A., Johansson T., Viglietta C., Puissant C., Hansson L., (1997), Transgenic Res., 6(4), 271-278.

Biihler L., Friedman T., Jacomini J., Cooper D. K. C., (1999), Frontier in Bioscience, 4, 416-432.

DeMattos R. B., Bales K. R., Parsadanian M., O’Dell M. A., Foss E. M., Paul S. M., Holtzmann D. M., (2002), J. Neurochem., 81 (2), 229-236.

Blackburn A. C., Jerry D. J., (2002), Breast Cancer Res., 4 (3), 101-111.

Scott M. R., Supattapone S., Nguyen FI. 0., DeArmond S. J., Prusiner S. B., (2000), Arch. Virol., (Sup- pi.), 16, 113-124.

88. Jura J., (1995), Biotechnologia, 3 (30), 20-32.

89. Rosochacki S. J., Snmirnov A., Kozikowa L., Sadowska J., Jefimow A., Zwierzchowski L., (1992), Anim. Sci. Pap. Rep., 9, 81-90.

Zwierzchowski L., Żebrowska T., Malewski T., Went D. F., (1994), Proc. Eur. Conf. Embryo Rechn 8;

Genet. Engin in Cattle and Sheep, (March 24-25), Kraków.

Jura J., Smorąg Z., Gajda B., Kareta W., KopchickJ. J., Kelder B., Prieto A. P., (2000), Ann. Anim. Sci., 27, 4, 105-113.

Smorąg Z., Jura J., Kopchick J.J., Gajda B., Skrzyszowska M., Różycki M., PasiekaJ., (1998), Biotech­

nologia, 2 (41), 145-152.

93. Jura J., Kopchick J. J., Chen W. Y., Modliński J. A., Reed M. A., Smorąg Z., (1994), Theriogenology, 41, 1259-1266.

94. Jura J., Kopchick J. J., Chen W. Y., Wagner W. Y., Modliński J. A., Reed M. A., Knapp J. R., Kątska L., Attal J., Floudebine L.-M., Smorąg Z., (1994), Proc. Eur. Conf. Embryo Techn. An Engin in Cattle and Sheep, Kraków, (24-25.03.1994), 169-183.

Rola M., Kuźmak J., Jura J., Bicka L., Skrzyszowska M., Gajda B., Smorąg Z., Glenn FI., Cantor. Bull.

Vet. Inst. Puławy (w druku).

Różycki M., Smorąg Z., Kopchick J. J., Chen W. Y.,Jura J., PasiekaJ., Orzechowska B., Gajda B., Skrzyszowska M., (1999), J. Applied Genetic, 40, 1, 29-37.

68.

69.

70.

71.

72.

73.

74.

75.

76.

77.

78.

79.

80.

81.

82.

83.

84.

85.

86.

87.

90.

91 92.

95.

96.