Struktura drugorzędowa i próba regulacji alternatywnego
składania pre-mRNA genu MAPT
Rozprawa doktorska
Promotor pracy:
Prof. dr hab. Ryszard Kierzek
Pracę wykonano
w Instytucie Chemii Bioorganicznej
Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu
w Zakładzie Chemii i Biologii
Strukturalnej Kwasów
Nukleinowych
Serdecznie dziękuję
prof. dr hab. Ryszardowi Kierzkowi
za zaangażowanie oraz
wszelką pomoc i cenne wskazówki
SPIS TREŚCI I. CEL PRACY ... 7 II. ABSTRACT ... 9 III. STRESZCZENIE ... 11 IV. CZĘŚĆ LITERATUROWA ... 14 1. Składanie genów ... 14 1.1. Konstytutywny splicing ... 14
1.2. Reakcja transestryfikacji w czasie składania genów ... 16
1.3. Spliceosom ... 16
1.4. Alternatywny splicing ... 19
1.5. Regulacja alternatywnego splicingu ... 20
1.6. Alternatywny splicing w komórkach nerwowych ... 24
1.7. Wpływ struktury drugorzędowej na alternatywne składanie genów ... 25
1.7.1. Wpływ struktury drugorzędowej na identyfikację miejsc splicingowych 5’ i 3’ oraz miejsca rozgałęzienia... 27
1.7.2. Wpływ struktury drugorzędowej na modyfikacje alternatywnego splicingu przez elementy regulatorowe działające w układzie cis ... 28
1.7.3. Wpływ struktury drugorzędowej na modyfikacje alternatywnego splicingu przez oddziaływania dalekiego zasięgu ... 30
2. Tauopatie ... 32
2.1. Białko tau ... 33
2.2. Choroby związane z agregatami białka tau ... 35
3. Otępienie czołowo-skroniowe połączone z zespołem parkinsonowskim sprzężone z chromosomem 17 ... 37
3.1. Objawy, diagnoza, leczenie FTDP-17 ... 37
3.2. Mutacje w genie MAPT ... 39
3.2.1. Mutacje zmieniające alternatywny splicing eksonu 10 znajdujące się w regulatorowej spince ... 41
3.2.2. Pozostałe mutacje zmieniające alternatywny splicing eksonu 10 ... 43
3.3. Regulacja alternatywnego składania eksonu 10 genu MAPT przez czynniki działające w układzie trans ... 45
V. WYNIKI I DYSKUSJA ... 50
1. Badanie parametrów termodynamicznych regulatorowej spinki i jej mutantów .... 50
1.1. Parametry termodynamiczne badanych spinek RNA ... 53
1.2. Widma dichroizmu kołowego badanych spinek RNA ... 55
1.3.1. Parametry termodynamiczne kompleksu RNA-neomycyna ... 58
1.3.2. Parametry termodynamiczne kompleksu RNA-kanamycyna ... 60
1.3.3. Parametry termodynamiczne kompleksu RNA-tobramycyna ... 61
1.3.4. Parametry termodynamiczne kompleksu RNA-mitoksantron ... 62
1.4. Porównanie stałych dysocjacji modelowych spinek RNA i ich kompleksów z badanymi ligandami ... 65
2. Analiza struktury fragmentu pre-mRNA genu MAPT ... 67
2.1. Analiza struktur fragmentu pre-mRNA genu MAPT przy pomocy programu komputerowego służącego do przewidywania struktury drugorzędowej RNA... 67
2.2. Otrzymywanie cząsteczek RNA używanych do badań strukturalnych ... 73
2.3. Wykorzystanie izoenergetycznych macierzy RNA do badania struktury drugorzędowej fragmentów pre-mRNA genu MAPT ... 74
2.3.1. Przygotowanie izoenergetycznych macierzy dedykowanych 11 cząsteczkom fragmentu pre-mRNA genu MAPT ... 76
2.3.2. Mapowanie mikromacierzowe fragmentów pre-mRNA genu MAPT ... 76
2.4. Mapowanie chemiczne 11 cząsteczek fragmentu pre-mRNA genu MAPT ... 80
2.4.1. Mapowanie metodą SHAPE 11 cząsteczek fragmentu pre-mRNA genu MAPT 81 2.4.2. Mapowanie siarczanem dimetylu (DMS) 11 cząsteczek fragmentu pre-mRNA genu MAPT ... 81
2.5. Struktura drugorzędowa fragmentu pre-mRNA genu MAPT zaproponowana w oparciu o program RNAstructure ... 84
2.6. Struktura drugorzędowa fragmentu pre-mRNA genu MAPT zaproponowana w oparciu o program vsfold5 ... 88
2.7. Udokładnianie struktury drugorzędowej fragmentu pre-mRNA genu MAPT zaproponowanej przez program vsfold5. ... 91
2.8. Struktura trzeciorzędowa fragmentu pre-mRNA genu MAPT ... 93
3. Badanie alternatywnego splicingu eksonu 10 genu MAPT na liniach komórkowych cos-7 ... 96
3.1. Ocena ilościowa wpływu badanych mutacji na alternatywny splicing eksonu 10 genu MAPT ... 97
3.2. Regulacja alternatywnego splicingu eksonu 10 genu MAPT z zastosowaniem niskocząsteczkowych ligandów ... 99
3.3. Regulacja alternatywnego splicingu eksonu 10 genu MAPT z zastosowaniem oligonukleotydów antysensowych ... 102
4. Proponowany model regulacji alternatywnego splicingu eksonu 10 pre-mRNA genu MAPT ... 106
4.2. Model regulacji, a czynniki splicingowe ... 111
4.3. Model regulacji, a rearanżacja struktury fragmentu pre-mRNA genu MAPT ... 112
4.4. Model regulacji, a mutacje w FTDP-17 ... 116
VI. PODSUMOWANIE ... 119
VII. MATERIAŁY I METODY ... 122
1. Materiały ... 122 1.1. Odczynniki ... 122 1.2. Enzymy ... 123 1.3. Plazmidy ... 123 1.4. Linia komórkowa ... 123 1.5. Akcesoria dodatkowe ... 123 1.6. Izotopy promieniotwórcze ... 123
1.7. Gotowe zestawy do badań biochemicznych ... 123
1.8. Szczepy bakteryjne ... 124
1.9. Wzorce długości kwasów nukleinowych ... 124
1.10. Oligonukleotydy ... 124
1.11. Roztwory i bufory ... 127
1.12. Pożywki ... 130
1.13. Żele ... 131
1.14. Ważniejsza aparatura, którą stosowano podczas prowadzenia badań ... 132
1.15. Ważniejsze programy stosowane podczas prowadzenia badań ... 132
2. Metody ... 133
2.1. Synteza chemiczna oligonukleotydów ... 133
2.2. Odblokowywanie i oczyszczanie modyfikowanych heptamerów zawierających łącznik C6-aminoheksylowy na końcu 5’ oraz pseudonukeotyd pirenowy na końcu 3’, stosowanych jako dodatkowe sondy na mikromacierzy. ... 133
2.3. Odblokowywanie i oczyszczanie oligorybonukleotydów... 134
2.4. Odblokowywanie i oczyszczanie oligodeoksyrybonukleotydów oraz oligodeoksyrybonukleotydów zawierających nukleotydy z serii LNA oraz 6-FAM na 5’ końcu. ... 134
2.5. Pomiary trwałości termodynamicznej z użyciem metody topnienia UV ... 135
2.6. Pomiary widm dichroizmu kołowego spinek RNA. ... 136
2.7. Znakowanie kwasów rybonukleinowych izotopem 32P ... 136
2.8. Elektroforeza DNA w żelach agarozowych produktów reakcji PCR ... 136
2.10. Elektroforeza kwasów nukleinowych w żelach poliakrylamidowych w warunkach
denaturujących ... 137
2.11. Elektroforeza kwasów nukleinowych w żelach poliakrylamidowych w warunkach niedenaturujących ... 137
2.12. Elucja kwasów nukleinowych z żelu poliakrylamidowego ... 138
2.13. Strącanie kwasów nukleinowych po elucji z żelu poliakrylamidowego... 138
2.14. Oczyszczanie kwasów nukleinowych metodą fenol-chloroform... 138
2.15. Otrzymywanie matryc do transkrypcji in vitro ... 139
2.16. Selekcja matryc do transkrypcji in vitro w plazmidzie pUC19 ... 140
2.17. Amplifikacja matryc do transkrypcji in vitro ... 142
2.18. Transkrypcja in vitro ... 142
2.19. Analiza homogenności RNA w żelach poliakrylamidowych w warunkach niedenaturujących ... 143
2.20. Mapowanie struktury drugorzędowej RNA metodą SHAPE ... 143
2.21. Mapowanie struktury drugorzędowej RNA siarczanem dimetylu ... 145
2.22. Przygotowanie płytek mikroskopowych ... 145
2.23. Przygotowanie sond do drukowania na mikromacierzy ... 145
2.24. Drukowanie sond na mikromacierzy ... 145
2.25. Hybrydyzacja na mikromacierzy ... 146
2.26. Przygotowanie plazmidów pSPL3b ... 147
2.27. Rozmrażanie komórek cos-7 ... 148
2.28. Hodowla komórek cos-7 ... 149
2.29. Pasaż komórek cos-7 na płytkę 24 dołkową ... 149
2.30. Transfekcja komórek cos-7 ... 149
2.31. Izolacja całkowitego RNA z komórek cos-7 ... 150
2.32. Analiza alternatywnego splicingu w oparciu o reakcje RT-PCR ... 151
I. CEL PRACY
Jednym z ważniejszych mechanizmów regulujących ekspresję genów jest alternatywne ich składanie, w wyniku czego dwa lub więcej białek może powstawać z jednego transkryptu (genu). Zaburzenia w regulacji tego procesu mogą u ludzi prowadzić do poważnych chorób. Jednym z przykładów choroby związanej ze zmianami w alternatywnym składaniu genu jest otępienie czołowo-skroniowe połączone z zespołem parkinsonowskim sprzężone z chromosomem 17 (FTDP-17). Przyczyną stanu patologicznego w tej chorobie są agregaty białka
tau kodowanego przez gen MAPT. U chorych na FTDP-17 zidentyfikowano mutacje
powodujące powstawanie nieaktywnego białka tau lub mutacje zaburzające proces alternatywnego splicingu eksonu 10 genu MAPT. Mutacje występujące w niekodujących fragmentach genu MAPT, a wpływające na zmianę wzorca alternatywnego splicingu mogą być wykorzystane w badaniach nad mechanizmem regulacji alternatywnego składania genów.
Celem niniejszej pracy była kompleksowa analiza wybranych mutacji we fragmencie pre-mRNA genu MAPT, obejmująca badania termodynamiczne, strukturalne i badania na liniach komórkowych.
W pierwszym etapie badań określono parametry termodynamiczne spinek RNA zawierające wybrane do badań mutacje. Dodatkowo, postanowiono ocenić wpływ niskocząsteczkowych ligandów na stabilność termodynamiczną spinki regulującej alternatywne składanie eksonu 10.
Kolejnym zadaniem było modelowanie struktury drugorzędowej fragmentu pre-mRNA genu MAPT. Wykonano badania strukturalne dla wszystkich wybranych mutacji, aby uzyskać informację, jak wpływają one na lokalną strukturę drugorzędową fragmentu pre-mRNA genu MAPT. Wykorzystano trzy metody eksperymentalne badania struktury drugorzędowej RNA, a mianowicie: mapowanie mikromacierzowe, mapowanie metodą SHAPE i modyfikacje chemiczne z użyciem DMS. W oparciu o wyznaczoną strukturę drugorzędową zaproponowano model struktury trzeciorzędowej badanego fragmentu pre-mRNA genu MAPT.
Dane termodynamiczne i strukturalne wykorzystano do zaprojektowania i przeprowadzenia badań służących poznaniu mechanizmu regulacji alternatywnego splicingu eksonu 10 białka tau w liniach komórkowych cos-7. W badaniach wykorzystano ligandy niskocząsteczkowe oraz oligonukleotydy antysensowe.
Szczegółowa analiza uzyskanych wyników badań strukturalnych oraz uzyskanych na liniach komórkowych pozwoliła na zaproponowanie modelu regulacji alternatywnego splicingu eksonu 10 genu MAPT.
II. ABSTRACT
Tau protein is a product of MAPT gene and belongs to the microtubule associated protein family. In 1998 the first mutation in MAPT gene was found, and over 40 mutations are uncovered nowadays. MAPT gene mutations can be divided into two types. The first type causes the change in biochemical properties of tau protein. The second one disrupts alternative splicing of exon 10. Alternative splicing of exon 10 produces 3R (without exon 10) and 4R (with exon 10) protein isoforms. In healthy brain the ratio of 3R and 4R forms is approximately 1.
Alternative splicing of exon 10 is controlled by trans-acting factors and cis-acting elements. It is reported that splicing of exon 10 is regulated by two weak, 5’ and 3’ splice sites and seven cis-acting elements: SC35-like enhancer, PPE (polypurine enhancer), A/C rich enhancer, ESS (exonic splicing silencer), ESE (exonic splicing enhancer), ISS (intronic
splicing silencer) and ISM (intronic splicing modulator). However, it is reported that a hairpin
containing a fragment of exon 10 and intron 10-11 is the main factor responsible for exon 10 splicing regulation. It is suggested that the changes in stability of the studied hairpins directly affect the interaction of its fragments with U1 snRNP or indirectly affect the binding of
trans-acting factors. Most of the splicing studies which were already published are focused on
the pre-mRNA sequence. However, there are more examples proving that the secondary structure regulates splicing.
Described herein research was focused on the end of exon 10 and beginning of intron 10-11 which forms a hairpin structure. Destabilization of this hairpin is induced by mutation and causes excess or reduction of exon 10, which follows a change in a ratio of 3R/4R tau isoforms. The effect of disorder in quantity of 3R and 4R isoforms is a pathological state manifested in FTDP-17 disease. It is supposed that a relaxed form of the hairpin is better available to interact with U1 snRNP.
Thermodynamic studies were performed using the 11 RNA molecules, 25/26- nucleotide long containing a fragment of regulatory hairpin: wild type RNA-WT, five mutants naturally occurring in humans and destabilizing hairpin 11C, 12U, 13G, DD-PAC, 16U, one hairpin with stabilizing mutation 19G, two molecules with DD-PAC mutation and with stabilizing mutations, i.e. DDI-17T and DD-10C, two molecules with stabilizing mutations – WTI-17T and WT-10C. The UV melting experiments enabled to obtain the thermodynamic parameters for all mutants. Besides, the additional UV melting experiments with mutants and
stabilizing hairpin molecules: neomycin, kanamycin, tobramycin and mitoxantrone were performed. As expected, the experiments confirmed that the mutation in a non-coding region of intron 10-11 causes significant differences in RNA hairpin stability. Three aminoglycoside antibiotics (neomycin, kanamycin, tobramycin) and mitoxantrone were chosen to change the thermodynamic stability of the tested RNAs. The results have shown that, except one case, the presence of chosen ligands enhance thermodynamic stabilities.
Hybridization on isoenergetic microarray and chemical mapping (SHAPE and DMS) demonstrate that all studied RNA molecules 194/195 long have almost the same secondary structure. The presented data show that mutations 11C, 12U, 13G, DD-PAC, 16U, 19G, DD-10C, DDI-17T, WT-10C and WTI-17T do not affect the secondary structure of the 194/195 nucleotide fragment of MAPT pre-mRNA. It seems that the mutations affect only the thermodynamic stability of the regulatory hairpin. The data from this experiment were used for the prediction of secondary structure of MAPT pre-mRNA. Moreover, a model of exon 10 alternative splicing regulation was proposed.
The last part of the research was performed on cos-7 cell lines and included the impact of antibiotics and antisense oligonucleotides on the regulation of alternative splicing of exon 10 of MAPT gene. Neomycin, kanamycin, tobramycin caused concentration-dependent decrease of 4R tau isoform in the case of molecule with 11C, 12U, 13G, DD-PAC and 16U mutations. The antisense oligonucleotides allowed to eliminate the mutation effect by interacting with the regulatory elements of alternative splicing of exon 10.
III. STRESZCZENIE
Białko tau należy do rodziny białek zasocjowanych z mikrotubulami. W wyniku transkrypcji genu MAPT (ang. microtubule associated protein tau) powstaje pre-mRNA, z którego podczas alternatywnego splicingu powstaje sześć izoform tego białka. U dorosłego człowieka białko tau występuje w części aksonalnej neuronów. Główne funkcje tego białka to polimeryzacja i stabilizacja mikrotubul, a co za tym idzie, pełni rolę w morfogenezie, rozszerzaniu aksonalnym i transporcie białek w aksonach. Biologiczna funkcja tau jest regulowana głównie przez hiperfosforylację. W stanach patologicznych białko tau występuje w całej komórce nerwowej i może tworzyć helikalne włókna PHFs (ang. paired helical
filaments) oraz neurofibrylarne sploty NFTs (ang. neurofibrillary tangles).
Zespół chorób, w których występują patologiczne formy białka tau (PHFs oraz NFTs) nazywamy tauopatiami. Do tych chorób zaliczamy jednostki związane z chorobą Alzheimera AD (ang. alzheimer disease) oraz różnego typu otępienia czołowo-skroniowe FTDs (ang.
frontotemporal demetias). W 1998 roku odkryto pierwsze mutacje w genie MAPT, które są
odpowiedzialne za chorobę neurodegeneracyjną, a mianowicie otępienie czołowo-skroniowe połączone z zespołem parkinsonowskim sprzężone z chromosomem 17, FTDP-17 (ang.
frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17).
Mutacje genu MAPT mogą mieć dwojaki charakter. Pierwszy typ mutacji, powoduje zmianę właściwości biochemicznych białka. Drugi rodzaj, to mutacje zaburzające proces alternatywnego splicingu. U zdrowego człowieka stosunek izoform 3R/4R białka tau w przybliżeniu równy jest jeden. Różnica w ilości domen wiążących się do mikrotubul związana jest z wycięciem (izoforma 3R) lub pozostawieniem (izoforma 4R) eksonu 10 w czasie alternatywnego splicingu.
W regulacji alternatywnego składania eksonu 10 białka tau bierze udział wiele czynników splicingowych i elementy działające w układzie cis. Z danych literaturowych wiadomo, że miejsca akceptorowe i donorowe eksonu 10 to miejsca słabe, dlatego do przyłączenia składników spliceosomu potrzebują dodatkowych miejsc regulujących. W przypadku eksonu 10 pre-mRNA genu MAPT można wyróżnić siedem następujących elementów działających w układzie cis: wzmacniacz splicingu SC35 (ang. SC35-like
enhancer), polipurynowy wzmacniacz splicingu PPE (ang. polypurine enhancer),
wzmacniacz splicingu ACE (ang. A/C rich enhancer), eksonowy wyciszacz splicingu ESS (ang. exonic splicing silencer), eksonowy wzmacniacz splicingu ESE (ang. exonic splicing
enhancer), intronowy wyciszacz splicingu ISS (ang. intronic splicing silencer) i intronowy modulator splicingu ISM (ang. intronic splicing modulator). Intronowy wyciszacz splicingu ISS przyjmuje formę spinki RNA i zawiera 5’ miejsce splicingowe. Wydaje się, że element ten pełni kluczową rolę w regulacji alternatywnego składania eksonu 10 pre-mRNA genu MAPT. Sugeruje się, że zmiany w stabilności termodynamicznej tego motywu spinkowego w sposób bezpośredni lub pośredni powodują różnice w oddziaływaniu z nim składników spliceosomu.
W niniejszej pracy doktorskiej przedstawiono badania dotyczące wpływu wybranych mutacji na alternatywne składanie eksonu 10 pre-mRNA genu MAPT. Podzielić je można na trzy części: badania termodynamiczne, strukturalne i badania na liniach komórkowych cos-7.
Do badań termodynamicznych wykorzystano 11 cząsteczek RNA o długości 25/26 nukleotydów, które obejmowały motyw spinkowy na granicy eksonu 10 i intronu 10-11. W eksperymentach wykorzystano spinkę RNA dla formy typu dzikiego (WT), sześć mutacji występujących w chorobie FTDP-17 (11C, 12U, 13G, DD-PAC, 16U oraz 19G) oraz cztery mutanty skonstruowane sztucznie (DD-10C, DDI-17T, WT-10C i WTI-17T). Pomiary trwałości termodynamicznej metodą topnień UV pozwoliły na uzyskanie parametrów termodynamicznych wszystkich spinek RNA. Wykonano także pomiary ich trwałości termodynamicznej w obecności niskocząsteczkowych ligandów: neomycyny, kanamycyny, tobramycyny i mitoksantronu. Badania potwierdziły znaczący wpływ mutacji na stabilność termodynamiczną spinek RNA. Dodatkowo, stabilność termodynamiczna spinek RNA może być zwiększona przez oddziaływanie z antybiotykami.
Kolejnym etapem badań było określenie struktury drugorzędowej jedenastu 194/195 nukleotydowych fragmentów pre-mRNA genu MAPT. Mapowanie struktury drugorzędowej wykonano trzema metodami: wykorzystując izoenergetyczne macierze RNA, metodę SHAPE i z użyciem siarczanu dimetylu (DMS). Dane eksperymentalne zostały wsparte programami komputerowymi służącymi do przewidywaniu pofałdowania RNA i pozwoliły na zaproponowanie struktury drugorzędowej badanego fragmentu pre-mRNA. Dodatkowo, na podstawie otrzymanej struktury drugorzędowej udało się wymodelować strukturę trzeciorzędową o optymalnej energii swobodnej.
Ostatnią częścią badań były eksperymenty na liniach komórkowych cos-7, które obejmowały badanie wpływu mutacji na alternatywne składanie eksonu 10 pre-mRNA genu MAPT. Z wyjątkiem jednej mutacji (19G), udało się zauważyć korelacje pomiędzy
stabilnością termodynamiczną regulatorowej spinki ISS, a ilością powstających izoform 3R i 4R białka tau. Ponadto, wykorzystano ligandy niskocząsteczkowe (neomycyna, kanamycyna, tobramycyna i mitoksantron) do regulacji procesu splicingu eksonu 10. Wszystkie badane ligandy, oprócz mitoksantronu, powodowały zwiększenie ilości izoformy 4R białka tau w przypadku mutacji naturalnie występujących w FTDP-17 i destabilizujących regulatorową spinkę ISS (11C, 12U, 13G, DD-PAC, 16U). Dodatkowo, w eksperymentach na liniach komórkowych badano także wpływ modyfikowanych oligonukleotydów antysensowych, nakierowanych na blokowanie innych niż spinka ISS elementów regulujących splicing eksonu 10. Także w tym przypadku udało się zmienić stosunek ilościowy tworzących się izoform białka tau.
Wyniki uzyskane we wszystkich przeprowadzonych badaniach pozwoliły na zaproponowanie nowego modelu regulacji alternatywnego splicingu eksonu 10 pre-mRNA genu MAPT. Postuluje on, że po transkrypcji do cząsteczki pre-mRNA przyłączają się czynniki splicingowe powodujące lokalną rearanżację struktury, co uniemożliwia rozpoznanie miejsca akceptorowego eksonu 10. Zmiany w ilości izoform białka tau spowodowane mutacjami destabilizującymi spinkę regulatorową wynikają z niemożności wiązania się białka PSF do takiej spinki. Mutacja 19G nie wpływa na stabilność termodynamiczną spinki, ale powoduje stabilizację motywu dwuniciowego powstałego w wyniku lokalnej rearanżacji pre-mRNA. W konsekwencji ilości tworzących się 3R i 4R izoform białka tau są odmienne od tych tworzonych w przypadku pre-mRNA typu dzikiego.
IV. CZĘŚĆ LITERATUROWA
1. Składanie genów
Splicing, czyli składanie genów jest jednym z procesów posttranskrypcyjnej obróbki prekursorwego mRNA (pre-mRNA). Z cząsteczki RNA, która niesie informacje o budowie białka usuwane są rejony niekodujące, czyli introny. Dojrzała cząsteczka mRNA, składa się z fragmentów kodujących zwanych eksonami. Oprócz składania genów, posttranskrypcyjna obróbka pre-mRNA obejmuje: 1) przyłączanie na końcu 5’ pre-mRNA, za pomocą wiązania 5’-5’ trifosforanowego, czapeczki (ang. cap) zawierającej 7-metyloguanozynę, 2) redagowanie RNA polegające na insercji, delecji lub deaminacji reszt nukleotydowych, 3) poliadenylację sprowadzającą się do przyłączenia na końcu 3’ pre-mRNA fragmentu poliadenylowego poli(A), 4) eksport mRNA z jądra do cytoplazmy.
Reakcja wycinania intronów składa się z dwóch reakcji transestryfikacji, o czym będzie mowa w dalszej części tego rozdziału. Za prawidłowy i sprawny splicing odpowiedzialny jest kompleks składania pre-mRNA zwany spliceosomem. U człowieka do poprawnego zajścia wycinania intronów potrzebna jest aktywność ponad 170 białek i małych jądrowych RNA bogatych w urydynę tzw. U snRNA (ang. small nuclear RNA) (1, 2).
1.1. Konstytutywny splicing
Pierwszym i być może najważniejszym etapem splicingu jest poprawne rozpoznanie fragmentu, który powinien być wycięty. W intronach znajdują się elementy działające w układzie cis (ang. cis-acting elements), czyli sekwencje regulujące splicing SREs (ang. splicing
regulatory elements), sekwencje konserwatywne, niezbędne do przeprowadzenia
konstytutywnego składania genów (Rysunek 1). Określenie 5’ miejsca splicingowego (ang. 5’ splice site, donor site) zwanego również miejscem donorowym oraz 3’ miejsca splicingowego (ang. 3’ splice site, acceptor site) określanego mianem miejsca akceptorowego jest kluczowe dla poprawnego wycięcia intronu. Prawidłowe wycinanie fragmentu niekodującego związane jest z rozpoznaniem sekwencji donorowych i akceptorowych przez składniki spliceosomu, a także określeniem miejsca cięcia pre-mRNA (3).
Miejsce splicingowe na końcu 5’ wycinanego intronu definiowane jest jako sekwencja o długości dziewięciu nukleotydów leżąca na granicy eksonu i intronu. U ssaków sekwencja ta wygląda następująco: 5’YAG/GURAGU3’, gdzie Y to nukleotyd pirymidynowy, R to nukleotyd
purynowy, a ukośnik określa granicę ekson-intron (4). Z rejonem tym oddziałuje fragment RNA z U1 snRNP (ang. U1 small nuclear ribonucleoprotein) i ze względu na jego komplementarność oraz dostępność dla U1 snRNP możemy wyróżnić mocne i słabe 5’ miejsce splicingowe (ang.
strong, weak 5’ss). Miejsce akceptorowe 3’ określają dwa rejony leżące wewnątrz wycinanego
intronu. Pierwszym fragmentem jest polipirymidynowy trakt PPT (ang. polypirimidine tract) o różnej długości, znajdujący się pomiędzy miejscem rozgałęzienia BP (ang. branch point), a 3’ miejscem splicingowym. Samo miejsce akceptorowe na końcu 3’ intronu posiada sekwencję NYAG/G. Miejsce to zazwyczaj znajduje się około czterdziestu nukleotydów od miejsca rozgałęzienia (4, 5). Lokalizacja BP określa adenozynę biorącą udział w reakcji transestryfikacji, miejsce to posiada wysoce zdegenerowaną sekwencję 5’YNYURAY3’ (6, 7). W genomie ludzkim istnieją także miejsca donorowe i akceptorowe splicingu posiadające inne sekwencje, ale nie stanowią one więcej niż 1,5% wszystkich używanych miejsc splicingowych (8).
EKSON INTRON EKSON
pre-mRNA
5’ss BP PPT 3’ss
A
5’ 3’
Rysunek 1. Sekwencje konserwatywne regulujące proces splicingu: 5’ss-miejsce splicingowe 5’,
BP-miejsce rozgałęzienia, PPT-polipirymidynowy trakt, 3’ss-miejsce splicingowe 3’.
U wszystkich organizmów, u których występuje wycinanie intronów z cząsteczki pre-mRNA możemy zaobserwować, że większość komponentów jest sekwencyjnie konserwatywna, niemniej jednak długość intronów i eksonów jest różna (9-11). U ssaków dominują krótkie eksony i długie introny. Średnia długość fragmentu kodującego w pre-mRNA waha się pomiędzy 50-300 nukleotydów, a wielkość intronu to średnio 3400 nukleotydów. U organizmów niższych występują dłuższe eksony niż introny (3, 9-13). Składniki spliceosomu są podobne, a różnice wynikają ze sposobu definiowania fragmentu, który ma ulec wycięciu (3). Kiedy introny są krótkie, spliceosom określa wycinany fragment w oparciu o intron. Odwrotnie jest w przypadku ssaków, gdzie usuwany fragment definiowany jest w odniesieniu do eksonu. Sekwencja miejsc splicingowych, jak i określenie wycinanego fragmentu są kluczowe, ale nie są jedynymi sygnałami dla poprawnego przebiegu reakcji splicingu. W genomie ludzkim częściej niż prawdziwe eksony występują pseudoeksony. Posiadają one poprawne, ale nieużywane miejsca splicingowe (4, 14). O innych sekwencjach regulujących składanie pre-mRNA działających w układzie cis będzie mowa w dalszych rozdziałach.
1.2. Reakcja transestryfikacji w czasie składania genów
Pod względem chemicznym proces splicingu składa się z dwóch reakcji transestryfikacji (Rysunek 2). W pierwszym etapie następuje atak nukleofilowy grupy 2’-hydroksylowej adenozyny w miejscu rozgałęzienia BP na centrum fosforowe, z jednoczesnym rozerwaniem wiązania P-O przy atomie O3’ ostatniej reszty nukleotydowej wchodzącej w skład eksonu, bezpośrednio sąsiadującej z końcem 5’ wycinanego intronu. Następnie, uwolniona grupa 3’-hydroksylowa eksonu przeprowadza atak nukleofilowy na centrum fosforowe, z jednoczesnym rozerwaniem wiązania P-O przy atomie O3’ reszty nukleotydowej z końca 3’ intronu. Dzięki tym reakcjom następuje połączenie się eksonów, a intron będący w formie lassa (pętli) jest degradowany (15).
Rysunek 2. Schemat przebiegu dwóch reakcji transestryfikacji zachodzących w czasie splicingu.
N = A, G, C lub U.
1.3. Spliceosom
Za prawidłowe i sprawne składanie genów odpowiedzialny jest kompleks składania RNA zwany spliceosomem. W organizmach eukariotycznych, w większości reakcji wycinania intronów bierze udział klasyczny spliceosom typu U2 (ang. U2-dependent
spliceosome). W skład tego spliceosomu wchodzą cząsteczki snRNA nazwane: U1, U2, U4,
U5 oraz U6, które wraz z białkami tworzą małe jądrowe rybonukleoproteiny snRNP (ang. small nuclear ribonucleoprotein) (1, 2). Mniej niż 1% splicingu zachodzi przy udziale
spliceosomu typu U12 (ang. U12-dependent spliceosome) i wtedy składnikami spliceosomu są cząsteczki U11, U12, U4atac, U6atac snRNP (16). Cząsteczki U snRNA możemy podzielić na
dwie klasy. Pierwsza to grupa Sm (U1, U2, U4, U4atac, U5, U7, U11, U12,) posiadająca
miejsce wiązania dla białek Sm. Druga klasa to Lsm (U6, U6atac) oddziałująca z białkami
podobnymi do Sm (ang. like Sm protein) (16). Oprócz białek tworzących spliceosom i oddziałujących z snRNA istnieje szereg czynników białkowych biorących aktywny udział w składaniu pre-mRNA tzw. czynników splicingowych non-snRNP (17). Skład białkowy poszczególnych cząsteczek U snRNP przedstawiony jest na rysunku 3.
Rysunek 3. Schemat struktury snRNA tworzących spliceosom oraz zestawienie oddziałujących z nimi
białek (15).
Splicing odbywa się przy udziale dynamicznego, wieloskładnikowego, rybonukleoproteinowego kompleksu zwanego spliceosomem. Miejsca łączenia się dwóch eksonów przybliżają się do siebie w wyniku zmian w kształcie (strukturze) kompleksu składania pre-mRNA. W większości przypadków reakcji splicingu głównymi elementami
spliceosomu są cząsteczki U1 snRNP, U2 snRNP, U4/U6 snRNP, U5 snRNP,
U4/U5/U6 snRNP i czynniki splicingowe non-snRNP. Przebieg procesu wycinania intronów z udziałem spliceosomu odbywa się w kilku etapach (Rysunek 4). U człowieka U1 snRNP składa się z 164 nukleotydowego snRNA oraz 3 czynników białkowych, a mianowicie 70K, A i C. Przyłącza się on do pre-mRNA w pierwszym etapie splicingu tworząc pierwszy
splicingowy kompleks E. Do pre-mRNA wraz z cząsteczką U1 snRNP (kompleksu E) przyłącza się U2 snRNP, który zbudowany jest z snRNA o długości 188 nukleotydów i 12 czynników białkowych: A’, B”, SF3a120, SF3a66, SF3a60, SF3b155, SF3b145, SF3b130, SF3b49, SF3b14, SF3bp14b oraz SF3b10. W wyniku przyłączenia się tych dwóch cząsteczek snRNP tworzy się kompleks A inaczej zwany pre-spliceosomem. Na tym etapie rozpoznawane jest 5’ miejsce splicingowe przez U1 snRNA, miejsce rozgałęzienia BP przez SF1/BBP, polipirymidynowy trakt przez U2AF65 oraz 3’ miejsce splicingowe przez U2AF35. Jeżeli w sekwencji pre-mRNA występują wzmacniacze splicingu to są one rozpoznawane przez białka SR. W następnej kolejności ma miejsce wiązanie się oddziałujących ze sobą cząsteczek U4/U5/U6 snRNP. Grupa ta składa się z trzech cząsteczek RNA o długości
144 nukleotydów (U4 snRNA), 142 nukleotydów (U5 snRNA) i 106 nukleotydów (U6 snRNA) oraz szeregu białek: Prp8, hBrr2, Snu114, hPrp6, hPrp28, 40K, hDib1, hPrp3, hPrp31, hPrp4, CypH, 15.5K, hSnu66, hSad1 i 27K. Tworzy się wtedy kompleks B określany mianem pre-katalitycznego spliceosomu. W tym momencie cząsteczki U1 i U4 snRNP oddysocjowują z kompleksu i tworzy się aktywny kompleks spliceosomu Bact. Dzięki hydrolizie ATP zachodzą zmiany konformacyjne, czego rezultatem jest zbliżenie się nukleotydów biorących udział w dwóch reakcjach transestryfikacji, powstaje katalitycznie aktywny kompleks B*. Pierwsza reakcja zachodzi w tak zwanym kompleksie C, a druga w kompleksie C*. Następuje połączenie się eksonów i usunięcie intronu. Dojrzałe mRNA opuszcza spliceosom, cząsteczki U2, U5, U6 oddysocjowują od intronu i mogą ponownie oddziaływać z cząsteczką pre-mRNA (15).
1.4. Alternatywny splicing
W roku 2001 określono pełną sekwencję genomu ludzkiego, co pozwoliło na oszacowanie liczby genów u człowieka na około 26 tysięcy (18). Za tak małą liczbę genów w stosunku do ilości różnych białek w organizmach odpowiedzialne są procesy związane z dojrzewaniem RNA, w szczególności alternatywny splicing. Jest to proces, w którym dwa lub więcej białek może powstawać z jednego transkryptu (genu), w wyniku usuwania z niego jednego lub kilku eksonów. Istnieje korelacja pomiędzy złożonością organizmu, a liczbą genów ulegających alternatywnemu splicingowi. W czasie dojrzewania pre-mRNA około 95% ludzkich genów ulega alternatywnemu składaniu (19), około 60% u Drosophila
melanogaster (20) i 25% u Caenorhabditis elegans (21). Im więcej w organizmie rodzajów
komórek i tkanek tym większy procent genów ulega procesowi alternatywnego splicingu. Alternatywne składanie genów odgrywa znaczącą rolę w różnicowaniu się komórek i w rozwoju organizmu, ponieważ różne izoformy tego samego białka mogą powstawać w różnych tkankach. Najlepszym potwierdzeniem jak alternatywne składanie genu wpływa na różnorodność białek jest przykład genu Dscam u Drosophila melanogaster. Na drodze alternatywnego splicingu tego genu może powstać 38 016 różnych izoform mRNA i białek (22). Powstawanie dwóch lub więcej izofrom mRNA z jednej cząsteczki pre-mRNA może być wynikiem pięciu głównych schematów alternatywnego splicingu: 1) pominięcie eksonu, 2) zatrzymanie intronu, 3) wybór jednego z eksonów, 4) alternatywne 5’ miejsce splicingowe, 5) alternatywne 3’ miejsce splicingowe (Rysunek 5).
Rysunek 5. Schemat alternatywnego splicingu pokazujący jak z jednego pre-mRNA mogą powstawać
dwa transkrypty.
1.5. Regulacja alternatywnego splicingu
Jak wcześniej wspomniano, konstytutywny splicing opiera się na regionach konserwatywnych działających w układzie cis (5’ss, 3'ss, PPT, BP). Najnowsze badania
in silico pokazują, że 92-95% ludzkich genów może podlegać procesowi alternatywnego
splicingu, co za tym idzie, stopień komplementarności 5’ miejsca splicingowego do U1 snRNA oraz definicja wycinanego fragmentu nie mogą być jedyną podstawą w identyfikacji usuwanego rejonu (19, 23, 24). W procesach konstytutywnego splicingu, jak i alternatywnego splicingu, bardzo ważnym elementem jest rejon sąsiadujący z miejscem splicingowym, 50 nukleotydów powyżej i 80 nukleotydów poniżej tego miejsca. Znany jest alternatywny mechanizm rozpoznawania miejsc splicingu; dzieje się to dzięki rejonom regulującym splicing SREs (ang. splicing regulatory elements), nazywanymi również sekwencjami posiłkowymi (ang. auxiliary elements), leżącymi wewnątrz eksonu oraz w przyległych intronach. Możemy wyróżnić cztery główne rodzaje takich rejonów (12):
a) ESEs (ang. exonic splicing enhancers) eksonowe wzmacniacze splicingu, b) ESSs (ang. exonic splicing silencers) eksonowe wyciszacze splicingu, c) ISEs (ang. intronic splicing enhancers) intronowe wzmacniacze splicingu, d) ISSs (ang. intronic splicing silencers) intronowe wyciszacze splicingu.
Sekwencje regulujące splicing są rozpoznawane przez czynniki splicingowe działające w układzie trans (ang. trans-acting factor), które łączą się z regulatorowym rejonem i mogą oddziaływać z innymi cząsteczkami, w tym z snRNP. Eksonowe wzmacniacze splicngu ESE definiowane są jako takie, do których przyłączają się białka z rodziny SR, czyli białka bogate w serynę i argininę (ang. serine/arginie-rich protein family). Jedna z teorii głosi, że białka SR przyłączają się bezpośrednio do ESE, co wyzwala oddziaływanie z innymi czynnikami splicingowymi i pozwala na rekrutację pierwszych komponentów spliceosomu tj. U1 snRNP oraz U2AF. Inne badania wskazują, że białka SR wiążą się dopiero po utworzeniu pierwszego kompleksu spliceosomu (12, 25-27). Bez względu na mechanizm można powiedzieć, że wzmacniacze splicingu ESE i ISE aktywują konstytutywne, alternatywne, słabe lub mocne miejsca splicingowe przez oddziaływanie z białkami SR lub komponentami spliceosomu, co wzmacnia rozpoznawanie eksonu (12, 28, 29). Na składanie genów mają także wpływ rejony regulatorowe wyciszające splicing, które mogą być zlokalizowane w eksonie lub intronie ESS i ISS (30). Uważa się, że miejsca wyciszenia określa rejon, do którego wiążą się białka PTB (ang. polypyrimidine tact-binding protein) inaczej zwane hnRNP I (ang. heterogeneous
nuclear ribonucleoproteins). Oddziałują one z polipirymidynowymi traktami. Białka PTB
mogą blokować wiązanie się spliceosomu przez multimeryczne wiązanie się do eksonu, mogą wypętlać ekson lub mogą wpływać na wiązanie się U1 snRNP z 5’ miejscem splicingowym (31-34).
Wiele jest poziomów regulacji alternatywnego splicingu, jednak wydaje się, że regulacja przez białka jest najbardziej elastyczną formą i może odpowiadać za tkankowo-specyficzną zmienność w reakcji składania genów. Wpływ czynników białkowych, w różnych tkankach czy komórkach może być regulowany przez stężenie jednego lub wielu czynników splicingowych, przez wpływ na lokalizację komórkową tych regulatorów oraz przez potranslacyjne modyfikacje tych białek (15). Białka biorące udział w wycinaniu intronów z cząsteczki pre-mRNA możemy podzielić na białka splicingowe, które tworzą spliceosom oraz inne białka biorące udział w splicingu, czyli czynniki splicingowe. Do większości rejonów regulujących składanie pre-mRNA przyłączają się czynniki splicingowe będące represorami lub aktywatorami, które mogą wzmacniać lub osłabiać formowanie się kompleksu białkowego spliceosomu. Czynniki te możemy podzielić na trzy główne grupy: 1) białka SR bogate w serynę i argininę, najczęściej wzmacniające rozpoznawanie miejsc splicingowych, 2) białka hnRNP, maskujące miejsca splicingowe, 3) tkankowo-specyficzne czynniki splicingowe (35). Wszystkie wymienione białka posiadają, często w wielu kopiach,
specyficzne domeny wiążące do RNA: motyw rozpoznający RNA, RRM (ang.
RNA-recognition motif), domenę KH (ang. K homology domain) lub domenę palca
cynkowego. Wielkość spliceosomu i ilość czynników białkowych biorących udział w tym procesie powoduje, że eksony mniejsze niż 50 nukleotydów mogą być za małe dla pomieszczenia wszystkich białek i mogą być pomijane i wycinane z transkryptu (36).
Procesy, jakim poddawana jest cząsteczka pre-mRNA w jądrze są ze sobą ściśle powiązane. Zaobserwowano sprzężenie transkrypcji z procesem splicingu. Wycinanie intronów może odbywać się równocześnie z syntezą pre-mRNA (37-40). Zaproponowano dwa mechanizmy wpływu transkrypcji na splicing. Pierwsza koncepcja mówi o bezpośrednim oddziaływaniu spliceosomu z polimerazą RNA II lub jej promotorem (41). Druga teoria dotyczy wpływu kinetyki reakcji transkrypcji na alternatywny splicing. Uważa się, że C końcowa domena polimerazy RNA II jest miejscem wiązania się różnych kompleksów białkowych związanych z dojrzewaniem pre-mRNA (42, 43). Ponadto w czasie kotranskrypcyjnego splicingu następuje przestrzenne i czasowe rozdzielenie miejsc splicingowych (37). Pokazano, że U1 snRNP oddziałuje z głównym czynnikiem inicjacji elongacji transkrypcji TFIIH (ang. transcription factor II human) (44). Zidentyfikowano również białka SR w kompleksie z polimerazą RNA II. Szybkość elongacji pre-mRNA może wpływać na alternatywny splicing (45-47). Szybka transktypcja może powodować nierozpoznanie słabych miejsc splicingowych (37).
Pierwszym etapem w dojrzewaniu nowopowstałego transkryptu jest dodanie na końcu 5’ czapeczki (kapu), która chroni pre-mRNA przed działaniem 5’ egzonukleaz. Pokazano, że transkrypt z kapem powoduje wzrost wydajności splicingu (48). Istnieją dowody na oddziaływanie pomiędzy czynnikami biorącymi udział w poliadenylacji, jak polimeraza poli(A), białko CPSF (ang. cleavage and polyadenylation specificity factor) i CFII (ang. cleavage
factor II) z cząsteczką U2AF65 (49-53). Poza tym wykazano, że czynnik splicingowy SRm160
promuje cięcie na końcu 3’, a cząsteczka U1 snRNP wykazuje wpływ inhibitorowy na ten proces (54).
Kompleks białkowy EJC (ang. exon junction complex) zaangażowany w eksport cząsteczki mRNA z jądra do cytoplazmy zawiera wiele białek związanych z alternatywnym składaniem genów takich jak: SRm160, DEK i RNPS1. W kompleksie tym wykryto również czynnik inicjacji translacji eIF4A3, co pozwala wysnuć wniosek, że czynniki splicingowe mogą
oddziaływać z czynnikami biorącymi udział w translacji i pośrednio wpływać na jej przebieg (55-57).
Splicing powiązany jest z procesami rozpoznawania i degradacji mRNA, określanych mianem NMD (ang. nonsense-mediated decay), które zawierają przedwczesny kodon stop PTC (ang. premature termination codon). Składanie genów jest ważne do określenia transkryptów przeznaczonych do degradacji NMD przez znakowanie mRNA z PTC przez czynniki splicingowe SR. Z drugiej strony proces NMD reguluje ekspresję wielu białek SR. Uważa się, że jedna trzecia transkryptów może być regulowana na drodze degradacji cząsteczek mRNA posiadających przedwczesny kodon stop. Proces ten może maskować niektóre mutacje czynników splicingowych (58-62). Również modyfikacje histonów mogą pomagać w rekrutacji czynników białkowych regulujących alternatywne składanie genów (63).
Kolejnym elementem wpływającym na splicing pre-mRNA jest jego struktura drugorzędowa i oddziaływania trzeciorzędowe. Rozpoznanie miejsc splicingowych, elementów regulatorowych działających w układzie cis odbywa się na zasadzie oddziaływania tych elementów z czynnikami białkowymi. Struktura drugorzędowa może prowadzić do wyeksponowania lub maskowania regulatorowych elementów (64, 65). Jak już wcześniej wspomniano, pre-mRNA biorą udział w splicingu w czasie transkrypcji (37-40). W komórkach ssaków jest wiele białek z rodziny hnRNP, które oddziałują z cząsteczkami RNA uniemożliwiając im wytworzenie stabilnej struktury. Nasuwają się pytania, czy nowopowstająca cząsteczka pre-mRNA „ma czas” na uformowanie stabilnej struktury i czy czynniki białkowe nie ograniczają tego procesu oraz czy struktura drugorzędowa ma wpływ na proces alternatywnego splicingu? Przyjmuje się, że wpływ na alternatywny proces składania genu ma struktura lokalna poszczególnych fragmentów, a nie struktura globalna, która „nie zdąży” się uformować w czasie transkrypcji (66). Małe cząsteczki mogą naturalnie regulować alternatywny splicing przez wpływ na strukturę drugorzędową pre-mRNA. Pirofosforan tiaminy TPP (ang. thiamine pyrophosphate) znany jako ryboprzełącznik, może wiązać się z intronem genu związanego z syntezą TPP, powodując, że to właśnie ten intron nie zostanie wycięty. Pozostawienie fragmentu niekodującego znacznie obniża stabilność powstałego mRNA (67). Także pentamidyna może wiązać się do motywu spinki do włosów pre-mRNA genu TNNT2 (ang. troponin T type 2) i powodować redukcję splicingu przez inhibicję wiązania się cząsteczki U2AF65 (68). Przykłady te pokazują, że alternatywny splicing może być regulowany na drodze zmian w strukturze drugorzędowej transkryptu.
Podsumowując, regulacja składania pre-mRNA jest wieloetapowa i skomplikowana. Kluczową rolę odrywają miejsca 5’ i 3’ splicingowe, które pozwalają na zdefiniowanie eksonu. Ponadto, na wycinanie intronów mają wpływ sekwencje regulujące splicing SRE o charakterze konstytutywnym (5’ss, 3'ss, PPT, BP) lub posiłkowym (ESE, ESS, ISE, ISS). Cząsteczka pre-mRNA posiada specyficzną i zdefiniowaną strukturę drugorzędową, co może doprowadzić do wyeksponowania lub maskowania poszczególnych elementów regulatorowych. Konsekwencją występowania w pre-mRNA słabego miejsca splicingowego 5’ lub 3’ lub zamaskowanych miejsc SRE, może być wystąpienie alternatywnego splicingu. Dodatkowo, wycinanie intronu z pre-mRNA jest ściśle powiązane z różnymi procesami regulującymi dojrzewanie genów i ich ekspresję.
1.6. Alternatywny splicing w komórkach nerwowych
Alternatywny splicing powoduje powstawanie nowych białek o różnych funkcjach. Analiza genomu człowieka pokazała, że tkanka mózgowa ma największą liczbę tkankowo-specyficznych izoform białkowych powstałych w procesie alternatywnego splicingu (69). W tkance nerwowej alternatywne składanie genów odpowiedzialne jest za aktywność białek w synapsach i jest bardzo ważne dla genów związanych z przekazywaniem sygnałów w organizmie takich jak geny kodujące: receptory, białka biorące udział w transdukcji sygnału, czynniki transkrypcyjne i regulatory splicingu (70). Alternatywny splicing może wpływać na funkcję i aktywność receptorów neuronowych. Przykładem jest receptor NMDA R1 (ang. n-methyl-d-aspartic acid receptor 1), w którym w zależności od obecności w transkrypcie eksonu C1, powstaje białko zlokalizowane w błonie cytoplazmatycznej lub w cytoplazmie (71). Złożoność i ilość reakcji alternatywnego splicingu w komórkach nerwowych i neuronach ruchowych powoduje, że istnieje szereg chorób neurodegeneracyjnych związanych z zaburzeniami w alternatywnym składaniu genów. Choroby takie jak: stwardnienie zanikowe boczne, ALS (ang. amyotrophic lateral sclerosis) (72) i rdzeniowy zanik mięśni, SMA (ang. spinal muscular atrophy) (73) spowodowane są przez mutacje w genach czynników splicingowych. Otępienie czołowo-skroniowe z zespołem parkinsonowskim sprzężonym z chromosomem 17, FTDP-17 ujawnia się w wyniku zaburzeń w alternatywnym splicingu białka tau (74).
1.7. Wpływ struktury drugorzędowej na alternatywne składanie genów
W licznych procesach zachodzących w komórce struktura drugorzędowa RNA odgrywa istotną rolę we właściwościach funkcjonalnych tej cząsteczki (75). W przypadku pre-mRNA uważa się, że lokalne motywy strukturalne mają wpływ na proces alternatywnego splicingu, w przeciwieństwie na przykład do cząsteczki tRNA, która przyjmuje ścisłe zdefiniowaną globalna strukturę. Początkowo sądzono, że białka hnRNP oddziałują z nowo powstałym transkryptem uniemożliwiając uzyskanie przez pre-mRNA struktury drugorzędowej (76). Jednak do tej pory udokumentowano wiele przykładów mówiących o wpływie struktury drugorzędowej na alternatywne składanie genów (77).
Jak wcześniej wspomniano, kluczowym etapem składnia genów jest rozpoznanie 5’ i 3’ miejsc splicingowych. Selekcja miejsc splicingowych może być regulowana przez strukturę drugorzędową fragmentów biorących udział w splicingu (64, 78). Struktura drugorzędowa może hamować lub aktywować wiązanie się spliceosomu do pre-mRNA. Dodatkowo, regulacje motywów strukturalnych mogą dotyczyć elementów działających w układzie cis. Większość czynników splicingowych wiąże się do rejonów jednoniciowych w pre-mRNA o długości 2-10 nukleotydów, znajdujących się najczęściej w rejonach pętli struktur spinkowych. Maskowanie i uwydatnianie takich rejonów jak: ESS, ESE, ISE czy ISS wywiera znaczny wpływ na regulację procesu alternatywnego splicingu. Ponadto, dzięki przyjmowaniu określonych motywów strukturalnych przez pre-mRNA możliwe jest bliskie sąsiedztwo elementów regulujących, działających w układzie cis, których umiejscowienie w sekwencji jest od siebie odległe.
Potwierdzeniem wpływu struktury drugorzędowej na alternatywne składanie genów jest korelacja pomiędzy występowaniem alternatywnego splicingu i ustrukturalizowaniem miejsc splicingowych. Modelowanie struktur drugorzędowych 60 nukleotydowych fragmentów obejmujących rejony: (1) podlegające konstytutywnemu splicingowi (13 426 eksonów), (2) zawierające 5’ i 3’ miejsca alternatywnego splicingu (4 179 eksonów), (3) regulujące zatrzymanie lub ominiecie eksonu (8 385 eksonów) uwidoczniło różnice w strukturze drugorzędowej pomiędzy nimi (Rysunek 6) (65). Miejsca splicingowe, które nie ulegają konstytutywnemu splicingowi posiadają konserwatywne motywy strukturalne. Fragmenty w obrębie alternatywnych miejsc splicingowych posiadają procentowo większą zawartość par G-C, co za tym idzie struktura drugorzędowa tworzona przez te rejony jest stabilniejsza. Korelacja pomiędzy stabilnością motywów strukturalnych, a zdarzeniami w
alternatywnym splicingu nie dotyczy pominięcia lub zatrzymania eksonu. Uważa się, że w tym przypadku większy wpływ na to zdarzenie ma wielkość eksonu niż struktura drugorzędowa.
Rysunek 6. Porównanie energii swobodnej motywów strukturalnych. A-pomiędzy konstytutywnym i alternatywnym miejscem splicingowym 5’, B-pomiędzy konstytutywnym, a alternatywnym miejscem splicingowym 3’, C-pomiędzy konstytutywnym splicingiem eksonu, a pominięciem eksonu w reakcji składania genów (65).
Na podstawie danych o konserwatywnych motywach strukturalnych, które mogą regulować alternatywny splicing udało się przewidzieć wzór składania genów w czterech typach tkanek u myszy (79).
1.7.1. Wpływ struktury drugorzędowej na identyfikację miejsc splicingowych 5’ i 3’ oraz miejsca rozgałęzienia
Struktura drugorzędowa wpływa na dostępność miejsca splicingowego w pre-mRNA genu ludzkiego hormonu wzrostu GH1 (ang. human growth hormone) (80). Dwie izoformy tego białka produkowane są w przysadce, wariant krótszy i dłuższy, w zależności od wyboru miejsca akceptorowego B lub B’. Pre-mRNA tego genu zawiera strukturę spinki do włosów, która obejmuje miejsce splicingowe i miejsce rozgałęzienia dla izoformy dłuższej. Obecność takiego motywu strukturalnego związana jest ze wzrostem ilości izoformy krótszej białka. Uważa się, że występuje równowaga pomiędzy dwoma formami pre-mRNA genu GH1 z dostępnym miejscem i zamaskowanym miejscem splicingowym. Ponieważ utrudniony jest dostęp do miejsca splicingowego odpowiedzialnego za ekspresję formy dłuższej to powstaje około 10 razy więcej izoformy krótszej ludzkiego hormonu wzrostu. Wykorzystanie miejsca splicingowego powodującego powstanie formy dłuższej jest zależne od stabilności motywu spinkowego. Im mniejsza energia swobodna, tym więcej powstaje izoformy krótszej ludzkiego hormonu wzrostu. Okazało się, że istnieje liniowa zależność pomiędzy wykorzystaniem miejsca splicingowego B’, a energią swobodną motywu spinkowego.
Zaobserwowano wpływ struktury drugorzędowej na alternatywne składanie czynnika splicingowego hnRNP A1 (81). W wyniku alternatywnego splicingu eksonu 7B powstają dwie izoformy tego białka, a mianowicie hnRNP A1 i hnRNP A1B, które różnią się zdolnością do wiązania się do miejsc splicingowych. Fragment 84 nukleotydowy nazwany CE6IO, tworzy bardzo trwały motyw dwuniciowy z miejscem akceptorowym dla eksonu 7B i prowadzi do ominięcia tego eksonu w reakcji składania genów. Powstanie stabilnego dupleksu pomiędzy CE6IO, a rejonem z 5’ miejscem splicingowym dla eksonu 7 powoduje zmniejszone oddziaływanie tego miejsca akceptorowego z U1 snRNP.
Alternatywny splicing genu ludzkiej β-tropomiozyny, TPM2 (ang. β-tropomiosin 2) jest tkankowo specyficzny. W wyniku tego procesu powstają dwie izoformy białka zawierające ekson 6A lub ekson 6B. Wpływ na alternatywne składanie genu TPM2 ma struktura drugorzędowa fragmentu obejmującego ekson 6B i intron pomiędzy eksonem 6A i
6B (82). Struktura drugorzędowa, jaką przybiera ten rejon wpływa na wiele etapów w procesie składnia tego pre-mRNA. Miedzy innymi, zmniejsza stopień rozpoznawania miejsca akceptorowego, redukuje oddziaływanie czynników splicingowych z miejscem rozgałęzienia i innymi elementami regulującymi. Zmiany w sekwencji tego rejonu zmniejszające ustrukturalizowanie, powodują wzrost wydajności splicingu. Zagadką pozostaje fakt, dlaczego taka regulacja występuje tylko w wybranych tkankach.
Kolejnym przykładem wpływu struktury drugorzędowej na identyfikację miejsca splicingowego jest motyw spinki RNA występujący w pre-mRNA białka tau. Motyw ten występuje w miejscu akceptorowym eksonu 10. Przypadek ten zostanie szczegółowo omówiony w dalszej części pracy.
1.7.2. Wpływ struktury drugorzędowej na modyfikacje alternatywnego splicingu przez elementy regulatorowe działające w układzie cis
Motywy strukturalne występujące w pre-mRNA mogą także regulować rozpoznanie miejsc regulatorowych działających w układzie cis (64, 78). Większość białek oddziałuje z rejonami jednoniciowymi, tak więc, aby odpowiednio regulować alternatywny splicing fragmenty regulatorowe powinny znajdować się w jednoniciowych rejonach. Przez modulację struktury drugorzędowej możliwe jest maskowanie lub uwidacznianie sekwencji wyciszających splicing lub sekwencji wzmacniających splicing, co prowadzi do zmian w alternatywnym składaniu genów (Rysunek 7).
We wszystkich przykładach przedstawionych przez Hiller’a widać różnice w alternatywnym splicingu w zależności od tego czy element regulatorowy znajduje się w pętli spinki czy w jej trzonie. W przypadku elementu wzmacniającego splicing ESE w genie CD44 umiejscowienie go w trzonie spinki powoduje wyłączne powstanie izoformy krótszej, czyli element ten nie był rozpoznany w tym procesie. W elemencie wzmacniającym splicing, który został zaproponowany, widać podobną tendencję, tylko umiejscowienie ESE w trzonie spinki nie powoduje całkowitej eliminacji splicingu. W przypadku elementu wyciszającego splicing w genie hnRNP A1 widać wyraźną różnicę w ilości izoform, gdy element regulacyjny znajduje się w pętli i trzonie spinki. W zaproponowanym elemencie wyciszającym doskonale widać wpływ struktury na regulację splicingu przez elementy działające w układzie cis. Umiejscowienie wyciszacza w rejonie dwuniciowym spowodowało prawie całkowite zatrzymanie eksonu podczas alternatywnego składania genów.
Rysunek 7. Wpływ umiejscowienia sekwencji regulatorowych w motywie spinkowym. A-regulujące
elementy w pętli spinki lub w trzonie. B-analiza ilościowa powstałych izoform. C-wykres procentowej ilości zachowanego eksonu (64).
Ekson EDA znajduje się w pre-mRNA genu fibronektyny i jest regulowany przez dwa elementy (tzn. ESE i ESS) działające w układzie cis. Alternatywny splicing eksonu zależny jest od oddziaływania białek SR z regulującymi elementami, a wiązanie się białek zależne jest od struktury drugorzędowej tych elementów (83, 84).
U ludzi istnieją dwie kopie genu kodującego białko SMN (ang. survival motor neurons) (73). Produkty ekspresji tych genów różnią się obecnością lub brakiem eksonu 7, dlatego wyróżniamy białko SMN1 (z eksonem 7) i SMN2 (bez eksonu 7). Różnica w sekwencji obu genów wynika z mutacji punktowej C→T w eksonie 7. Różnica w sekwencji nie powoduje zmiany aminokwasu w białku, ale wpływa na alternatywny splicing eksonu 7. Mutacja powoduje wyeksponowanie elementu ISS w rejonie 3’ miejsca splicingowego, co powoduje ominięcie eksonu 7 i powstanie białka SMN2. W tym przypadku mutacja powoduje zmianę w strukturze drugorzędowej, co z kolei wpływa na alternatywny splicing. SMN1 u człowieka pełni funkcję czynnika splicingowego. Przyczyną choroby genetycznej, jaką jest rdzeniowy zanik mięśni, SMA (ang. spinal muscular atrophy) jest delecja w genie kodującym SMN1. W konsekwencji białko to nie spełnia swoich funkcji regulatorowych, co prowadzi do
degradacji neuronów ruchowych. Białko SMN2 nie może rekompensować braku aktywnego białka SMN1, ponieważ nie posiada eksonu 7. Zmiana regulacji alternatywnego składania eksonu 7 w genie SMN2 jest jednym z głównych celów w terapii SMA.
Również mutacja punktowa nie powodująca zmiany w sekwencji aminokwasowej genu kodującego regulator syntezy błonowego kanału chlorkowego CFTR (ang. cystic
fibrosis transmembrane conductance regulator) w eksonie 12 powoduje redukcję tego eksonu
w transkrypcie z 80% do 25%. W tym przypadku zmiana jednego nukleotydu nie powoduje dużych zmian strukturalnych. Mutacja powoduje zwiększenie rejonu jednoniciowego w elemencie wyciszającym splicing ESS i wzrost ustrukturalizowania elementu wzmacniającego ESE (85).
Wpływ struktury drugorzędowej na alternatywny splicing może być wzmacniany przez oddziaływanie czynników splicingowych z motywami strukturalnymi i stabilizację tych struktur. Wiązanie się czynnika białkowego MBNL1 (ang. muscleblind-like protein) powoduje alternatywny splicing eksonu 5 w genie cTNT (ang. cardiac troponin T) (66). W 3’ miejscu splicingowym pre-mRNA tego genu może wystąpić motyw spinkowy uniemożliwiając wiązanie się cząsteczki U2AF65, przy czym białko MBNL1 dodatkowo stabilizuje strukturę spinki.
1.7.3. Wpływ struktury drugorzędowej na modyfikacje alternatywnego splicingu przez oddziaływania dalekiego zasięgu
Oprócz lokalnych motywów strukturalnych również oddziaływania dalekiego zasięgu mogą mieć wpływ na alternatywny splicing. Długie introny mogą tworzyć 100-300 nukleotydowe spinki z pętlami wielkości nawet 15 000 nukleotydów, co ułatwia ich wycinanie (65). Najbardziej znanym przykładem regulacji alternatywnego składania genów wynikającej z oddziaływań dalekiego zasięgu jest gen Dscam z Drosophila
melanogaster (86). W wyniku alternatywnego składania tego genu może powstać 38 016
różnych transkryptów przez pominiecie lub zatrzymanie 95 różnych eksonów. Przykładem w jaki sposób regulowany jest splicing tak wielu eksonów jest przypadek wzajemnie wykluczających się eksonów w grupie eksonu 6 genu Dscam. Za eksonem 5, który podlega konstytutywnemu splicingowi znajduje się sekwencja dokująca (ang. docking site), z którą oddziałują wybrane sekwencje (ang. selector sequances) znajdujące się przed eksonami 6.36, 6.37 oraz 6.38. W zależności od tego, z którym fragmentem będzie oddziaływać sekwencja
dokująca, wycinanie różnych eksonów może być zatrzymane (Rysunek 8). Regulacja alternatywnego splicingu w genie Dcam jest przykładem jak utworzenie stabilnego motywu dwuniciowego może powodować wypętlenie się części pre-mRNA i przestrzennie zbliżyć rejony oddalone od siebie sekwencyjnie.
sekwencje oddziałujace z miejscem dokowania miejsce dokowania
zatrzymanie eksonu 6.36 zatrzymanie eksonu 6.37
represory splicingu
Rysunek 8. Regulacja alternatywnego splicingu grupy eksonów 6 w genie Dscam. W zależności od
tego, z którym rejonem oddziałuje sekwencja dokująca, w transkrypcie znajduje się ekson 6.36 lub 6.37 (65).
Pre-mRNA genu receptora czynnika wzrostu fibroblastów (ang. fibroblast growth
factor receptor 2) także ulega alternatywnemu splicingowi powodując powstanie dwóch
izoform białka, z eksonem IIIb lub IIIc (87). Ekspresja poszczególnych izoform jest tkankowo-specyficzna. Proces składania genów jest regulowany przez elementy działające w układzie cis, które znajdują się w dużej odległości od siebie. W tych rejonach powstaje długi motyw dwuniciowy z motywem pętli wielkości 735 nukleotydów. Taka rearanżacja tego rejonu powoduje, że elementy regulujące znajdują się blisko siebie i mogą wpływać na alternatywny splicing tego pre-mRNA.
Również do prawidłowego wycięcia intronu z genu rp51b u Saccharomyces cerevisiae potrzebne jest oddziaływanie dwóch krótkich fragmentów, które sekwencyjnie oddzielone są o 200 nukleotydów (88).
Wszystkie opisane przykłady dowodzą, że struktura drugorzędowa wpływa na alternatywne składanie genów i jest częścią kodu (ang. mRNA splicing code) pozwalającą na rozszyfrowanie zdarzeń, jakim poddawana jest cząsteczka pre-mRNA. Warto również dodać, że wystarczy polimorfizm jednego nukleotydu, aby zauważyć zmiany w fałdowaniu się mRNA (89), a co za tym idzie, punktowe zmiany w sekwencji mogą prowadzić do dużych zmian w alternatywnym splicingu pre-mRNA.
2. Tauopatie
Neuron jest komórką asymetryczną, składa się z ciała komórki, czyli perikarionu i wypustek cytoplazmatycznych dendrytów i aksonów. Komórka nerwowa może posiadać nawet 10 tysięcy połączeń z innymi komórkami nerwowymi, co wymaga obecności wielu białek biorących udział w przekazywaniu sygnałów w synapsach. Rybosomy zaopatrujące neuron w nowe porcje niezbędnych białek znajdują się tylko w ciele komórki nerwowej (69). Nowopowstałe białka muszą być przetransportowane do wszystkich rejonów komórek nerwowych, w szczególności do aksonów. Za transport aksonalny odpowiedzialne są mikrotubule i białka motoryczne (dyneina, kinezyna, miozyna) (90). Dzięki polimeryzacji α i β tubuliny powstają sztywne struktury rurek-mikrotubule, biorące udział w tworzeniu cytoszkieletu w komórce oraz wyznaczaniu szlaku dla transportu białek. W związku z tym, że komórka nerwowa do pełnienia swojej funkcji potrzebuje dużej ilości różnych białek oraz białka te muszą być przetransportowane na dosyć duże odległości, stan patologiczny w postaci agregatów białek może być bardzo szkodliwy dla neuronów, powodując zapchanie się aksonów i neurodegenerację (91).
Depozyty białkowe, jako czynnik patogenny pojawiają się w wielu chorobach występujących u ludzi. Głównie dotyczą neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym, ale także w neuronach ruchowych. Depozyty białkowe występują w następujących chorobach (92):
• choroba Alzheimera, AD (ang. alzheimer disease) z depozytami β amyloidu oraz białka tau,
• choroba Parkinsona, PD (ang. parkinson disease) z agregatami α synukleiny, • choroba Huntingtona, HD (ang. huntington disease) z depozytami huntingtyny,
• stwardnienie zanikowe boczne, ALS (ang. amyotrophic lateral sclerosis), gdzie agregaty tworzy białko TDP-43 (ang. TAR DNA-binding protein 43),
• choroba Creutzfeldta-Jakoba, CJD (ang. creutzfeldt - jakob disease) z depozytami prionowymi,
• otępienie czołowo-skroniowe FTD (ang. frontotemporal dementia) z agregatami białka tau.
2.1. Białko tau
Białko tau zostało po raz pierwszy wyizolowane w 1975 roku (93). Należy ono do rodziny białek zasocjowanych z mikrotubulami. W wyniku transkrypcji genu kodującego białko tau powstaje pre-mRNA, z którego podczas alternatywnego splicingu powstaje sześć izoform białka. U dorosłego człowieka występuje ono w neuronach w części aksonalnej (94, 95). Główne funkcje tego białka to składanie i stabilizacja mikrotubul, co za tym idzie, pełni rolę w morfogenezie, rozszerzaniu aksonalnym i pośrednio w transporcie czynników białkowych w aksonach (90). Biologiczna funkcja tau jest regulowana głównie przez fosforylację (96, 97). W stanach patologicznych białko tau występuje w całej komórce nerwowej i może tworzyć nierozpuszczalne agregaty: heliakalne włókna PHFs (ang. paired helical filaments) oraz eurofibrylarne sploty NFTs (ang. neurofibrillary tangles) (Rysunek 9) (98-100).
Białko tau kodowane jest przez gen MAPT (ang. microtubule-associated protein tau), u dorosłego człowieka ulega ekspresji głównie w systemie nerwowym (90, 95). Główną funkcją białka tau jest stabilizacja i wiązanie się do mikrotubul. Pre-mRNA genu MAPT ulega alternatywnmu splicingowi, co skutkuje powstaniem sześciu różnych izoform białka tau (Rysunek 10) (101). Eksony 2, 3, 10 są alternatywnie wycinane w czasie dojrzewania cząsteczki mRNA. Eksony 2 i 3 kodują fragment 29 aminokwasowy na końcu N białka tau. Ze względu na obecność eksonów 2 i 3 izoformy białka tau można podzielić następująco: 0N (nie zawiera eksonów 2 i 3), 1N (zawiera ekson 3) oraz 2N (zawiera eksony 2 i 3). Ekson 10 koduje jedną z czterech domen wiążących się z mikrotubulami. W wyniku alternatywnego składania eksonu 10 może powstać izoforma 3R (zawiera 3 domeny wiążące się do mikrotubul, bez domeny kodowanej przez ekson 10) oraz izoforma 4R (zawiera wszystkie cztery domeny wiążące się do mikrotubul). Wszystkie izoformy białka tau występujące u ludzi to: 4R/2N o długości 441 aminokwasów, 4R/1N o długości 412 aminokwasów, 4R/0N o długości 383 aminokwasów, 3R/2N o długości 410 aminokwasów, 3R/1N o długości 381 aminokwasów oraz 3R/0N o długości 352 aminokwasów (101-103)
MONOMER
DIMER
ROZPUSZCZALNY OLIGOMER
HELIKALNE WŁÓKNA-PHFs
NEUROFIBRYLARNE SPLOTY-NFTs
Rysunek 9. Rodzaje agregatów białka tau występujące w przypadkach neurodegeneracji.
.
Główna regulacja białka tau odbywa się przez fosforylację. Tau posiada 30 lub więcej miejsc fosforylacji w każdej lizoformie (96, 97). Modyfikacje te mogą wpływać na przyłączanie się białka tau do mikrotubul i stabilizację tych struktur komórkowych. Nadmierna fosforylacja białka jest najprawdopodobniej czynnikiem decydującym o jego agregacji w chorobach neurodegeneracyjnych. Udowodniono, że nierozpuszczalne agregaty tau PHFs i NFTs składają się z hiperfosforylowanej formy białka (104). Istnieją dwie teorie tłumaczące patogenne właściwości hiperfosforylowanego białka tau (92). Pierwsza mówi o dysfunkcji samego białka, ufosforylowane białko nie może oddziaływać z mikrotubulami, gromadzi się w komórce i dochodzi do powstawania depozytów białkowych. Obumieranie neuronów wynika z niestabilności mikrotubul, a nie jest spowodowane występowaniem agregatów. Druga koncepcja tłumaczy, że to fosforylacja prowadzi do agregacji, a ta sytuacja powoduje zapchanie się neuronów i neurodegenerację. Wydaje się, że drugi pogląd jest bardziej prawdopodobny. U myszy z wyłączonym genem MAPT nie dochodzi do neurodegeneracji, czyli brak białka nie powoduje śmierci komórek nerwowych (105). Zauważono również, że agregaty białka tau sprzyjają powstawaniu nowych nierozpuszczalnych form tau i rozprzestrzenianie się stanu patologicznego. Po rozpadzie neuronu depozyty białka tau znajdują się w przestrzeni międzykomórkowej i mogą być wchłaniane na drodze endocytozy przez następną komórkę nerwową (106-108).
2.2. Choroby związane z agregatami białka tau
Wszystkie choroby neurodegeneracyjne, w których występują agregaty białka tau nazywamy tauopatiami. Na podstawie obserwacji modelu zwierzęcego można powiedzieć, że patogeneza wywołana agregatami białka tau rozpoczyna się od mikroglejozy i patologii synaps (109). Depozyty białka tau wykryto w chorobie Alzheimera (AD), jako agregaty towarzyszące płytkom starczym z β amyloidu. Oprócz AD do tauopatii zaliczamy otępienia czołowe (FTD), do których możemy zaliczyć: otępienie czołowo-skroniowe z zespołem parkinsonowskim sprzężonym z chromosomem 17, FTDP-17, chorobę Picka PD (ang. pick
disease), zwyrodnienie korowo-podstawne, CBD (ang. corticobasal degeneration), postępujące
porażenie nadjądrowe, PSP (ang. progressive supranuclear palsy) oraz encefalopatię bokserską, DP (ang. dementia pugilistica) (99, 110, 111).
Można wysnuć przypuszczenie, że agregaty białka tau w chorobie Alzheimera i w otępieniach czołowych mają inną genezę. W AD agregaty białka tau występują najpierw w
