POLITECHNIKA POZNAŃSKA
WYDZIAŁ BUDOWNICTWA I INŻYNIERII ŚRODOWISKA
mgr inż. Daria Horbik
BIODETERIORACJA A TRWAŁOŚĆ ELEWACJI OBIEKTÓW BUDOWLANYCH O RÓŻNYM
PRZEZNACZENIU
BIODETERIORATION AND THE DURABILITY OF ELEVATIONS IN DIFFERENT KINDS OF BUILDINGS
ROZPRAWA DOKTORSKA
Promotor:
dr hab inż. Aldona Łowińska- Kluge, prof. PP
Poznań 2013
Pragnę podziękować osobom, bez których praca ta nie mogłaby powstać.
Szczególnie dziękuję mojemu promotorowi, Pani dr hab. inż.
Aldonie Łowińskiej – Kluge, prof. PP, za życzliwość, pomoc i cenne uwagi przekazywane w trakcie przygotowywania niniejszej pracy.
Pragnę podziękować również moim Rodzicom za okazane wsparcie, cierpliwość i zrozumienie, które towarzyszyły mi na każdym etapie realizacji pracy.
SPIS TREŚCI
1. Wprowadzenie ... 6
2. Cel i zakres rozprawy doktorskiej ... 10
3. Korozja biologiczna obiektów budowlanych w świetle doniesień literaturowych ... 11
3.1. Przyczyny i skutki korozji biologicznej ... 11
3.2. Dotychczas stosowane metody badawcze ... 21
3.2.1. Oznaczanie obecności grzybów pleśniowych w powietrzu ... 21
3.2.2. Oznaczanie obecności grzybów pleśniowych na powierzchni materiału ... 25
3.2.3. Metody bioautograficzne ... 27
3.2.4. Określanie obecności grzybów w oparciu o emitowaną przez nie bioluminescencję ... 30
3.2.5. Najczęściej stosowane metody usuwania efektów korozji biologicznej ... 31
4. Tezy pracy ... 36
5. Przeprowadzone badania i stosowane metody ... 37
5.1. Materiały ... 37
5.2. Skażenie materiału biologicznego ... 37
5.3. Ocena oddziaływania grzybów na materiał budowlany ... 44
5.4. Analiza obecności ergosterolu ... 45
5.5. Obrazy mikroskopowe SEM ... 46
5.6. Pomiary bioluminescencji ... 47
5.7. Bezwzorcowa mikroanaliza rentgenowska EDS ... 49
5.8. Określenie odczynu pH ... 49
6. Wyniki badań własnych wraz z ich analizą ... 50
6.1. Warunki rozwoju wybranych grzybów pleśniowych ... 50
6.2. Określenie stopnia rozwoju wybranych rodzajów grzybów zależnie od rodzaju skażonego materiału ... 51
6.3. Wpływ korozji biologicznej na zmianę niektórych właściwości fizyko-chemicznych skażonych materiałów ... 67
6.3.1. Odczyn pH ... 67
6.3.2. Bezwzorcowa mikroanaliza rentgenowska EDS dla przykładowych materiałów ... 69
7. Podsumowanie ... 73
8. Wnioski końcowe ... 78
9. Streszczenie ... 89
10. Summary ... 90
11. Załączniki ... 80
Bibliografia ... 89
Wykaz ważniejszych oznaczeń:
AGI (ang. All Glass Impinger) szklane płuczki, do których zasysane jest powietrze przez prostą rurkę
AFLP (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism) – markery o szerokim polimorfizmie
DNA kwas deoksyrybonukleinowy
EDS (ang. Energy Dispersive Spectroscopy) bezwzorcowa mikroanaliza rentgenowska
ELISA (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) test immunoenzymatyczny lub immunosorbcyjny
GC-MS (ang. Gas Chromatography-Mass Spectrometry) chromatografia gazowa z życiem spektrometrii mas
HPLC (ang. High-Performance Liquid Chromatography) – wysokosprawna chromatografia cieczowa
HPLC-MS (ang. High-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) wysokosprawna chromatografia cieczowa z życiem spektrometrii mas
HPLC-UV (ang. High-Performance Liquid Chromatography-Ultraviolet) wysokosprawna chromatografia cieczowa w ultrafiolecie
I natężenie bioluminescencji, wyrażone w [cts/(mm2 *s)]
JTK (ang. CFU –Colony Forming Units) jednostki tworzące kolonie, wyrażone w [m3]
LLE (ang.Liquid – Liquid Extraction) ekstrakcja rozpuszczalnikiem typu ciecz- ciecz
MAE (ang. Microvawe Assisted Extracion) ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika wspomagana promieniowaniem mikrofalowym
PCR badanie genetyczne pozwalające na identyfikacji materiału genetycznego (DNA) grzyba
PDA (ang. Potato Dextrose Agar) agar dekstrozowo-ziemniaczany
Ph- ilościowa skala kwasowości i zasadowości roztworów wodnych związków chemicznych
RADP (ang. Radomly Amplified Polymorphic) metoda identyfikacji polimorfizmów; ustalenia genetycznego dystansu między gatunkami
RCS – Plus aparat do poboru próbek powietrza i oznaczania jednostek tworzenia kolonii SAS (ang. Surface Air System) impaktor
SEM (ang. Scanning Electron Microscope) skaningowy mikroskop elektronowy TCR (ang.T Cell Receptors) receptor limfocytu T
TLC (ang. Thin Layer Chromatoraphy) cienkowarstwowa chromatografia cieczowa
TLC-B bioautografia sprzężona z chromatografią cienkowarstwową
1.Wprowadzenie
Wiadomym jest, że trwałość obiektów budowlanych zależy od wielu czynników, z których podstawowym jest trwałość materiałów. Materiały używane do wznoszenia budowli w określonych warunkach narażone są na szkodliwe działanie różnych czynników zewnętrznych i wewnętrznych [Tokarski, Wolfke 1969; Stoch 1974;
Gruener 1980; Łowińska-Kluge 1997; Łowińska-Kluge, Błaszczyński 2012].Udział korozji biologicznej w degradacji materiałów ( rys.1.1) jest coraz większy [Gorbushina i inni 1993; Karyś, Ważny 2001; Piotrowska, Żakowska 2003; Rymsza 2003; Łowińska- Kluge, Słowek 2004; Rogoziński 2005; Żakowska 2006; Cwalina, Dzierżewicz 2007;
Cwalina 2008, Rosowsky 2008; Sanchez-Silva, Rosowsky 2008].
Rys. 1.1. Widok zniszczeń różnych materiałów budowlanych spowodowanych korozją biologiczną; a) cegła ceramiczna; b) beton; c) tynk cementowo - wapienny; d) obraz mikroskopowy przedstawiający zniszczenie betonu przez wytrawienie substancjami wydzielanymi przez grzyby pleśnie.
Ochrona przed zagrożeniami biologicznymi obiektów budowlanych należy do trudnych zagadnień ze względu na interdyscyplinarny charakter problemu, który łączy elementy wiedzy biologicznej i technicznej. Obiekty mogą być skażone wieloma gatunkami grzybów, glonów, mchów i porostów. Szczególnie czytelne i uciążliwe jest pojawienie się grzybów pleśniowych. Sprzyjają temu zmiany mikroklimatyczne (obniżanie się zawartości SO2 i SO3 w powietrzu oraz zwiększanie CO2), a także wprowadzenie nowych technik wykonywania przegród budowlanych, nie sprawdzonych jeszcze w długotrwałej eksploatacji [Zyska 1999].
Grzyby pleśniowe stanowią zagrożenie nie tylko dla obiektów, ale także dla zdrowia osób w nim przebywających. Wszystkie organizmy żywe, a więc w tym i grzyby pleśniowe, potrzebują do wzrostu następujących warunków:
- podwyższonej wilgotności,
- podłoża zawierającego węgiel, azot, fosfor i wiele innych pierwiastków, ale w śladowych ilościach,
- umiarkowanej temperatury,
- odczynu pH zbliżonego do wartości obojętnej.
Wiele z nich wydziela substancje toksyczne między innymi takie jak: endotoksyny, enterotoksyny, enzymy, grupy mikotoksyn [Chełkowski 1985, Nikulin 1994; Hall, Rao 1998; Hintikka i inni 1999; Rügamer 2004]. Działanie grzybów pleśniowych na zdrowie człowieka może być przyczyną alergii, astmy, reumatyzmu, niedotlenienia mózgu, chorób przewodu pokarmowego itd. [Piontek 1999; Wiszniewska i inni 2004].Wykazują one również działanie kancerogenne; prekursorem w takich badaniach w Polsce był Julian Aleksandrowicz z zespołem („domy rakowe”, „domy białaczkowe”) [Aleksandrowicz, Smyk 1971, Barabasz i inni 2005].
Zarodniki grzybów pleśniowych obecne w powietrzu mogą być łatwo przenoszone w różne obszary, w tym także do wnętrza budynku. Mikroflora pleśniowa może być również ,,wprowadzona” do budynku przez same materiały budowlane, które zostały skażone tymi organizmami już na etapie wytwarzania. Wpływ na to mają mieć zaniedbania wytwórców, niewłaściwe składowanie i przechowywanie na placu budowy a także nieświadomość producentów. Badania w zakładach betoniarskich wykazały, że pomieszczenia formowania i dojrzewania prefabrykatów były zanieczyszczone grzybami pleśniowymi [Zimmerman 1987].
Dobór skutecznych procedur mających na celu zahamowanie lub eliminację przyczyn tego rodzaju korozji warunkowany jest wczesnym i właściwym rozpoznaniem inwazji biologicznej oraz określeniem obszaru jej występowania. Wymaga precyzyjnego rozpoznania rodzaju grzyba powodującego korozję i dobrej znajomości jego fizjologii ze względu na wielość gatunków, różnorodność sposobów rozmnażania i odżywiania, tworzenia form przetrwalnikowych i występowania form symbiotycznych.
Wczesna informacja o rozwoju grzybów pozwala na zmniejszenie kosztów ich zwalczania i poprawia trwałość budowli.
W tym miejscu należy zwrócić uwagę na zagadnienia wynikające z nie uzyskania w naprawianych, odnawianych czy restaurowanych obiektach, uszkodzonych przez korozję biologiczną, oczekiwanego efektu końcowego zrealizowanej naprawy.
Wywołuje to często wątpliwości dotyczące skuteczności zastosowanych środków i metod zabezpieczania.
Wybrane przykłady takich przypadków przedstawiono na rys.1.2 i 1.3.
a) b) c) d)
Rys. 1.2. Kościół pod wezwaniem św. Ignacego Loyoli w Jastrzębiej Górze; a) widok ogólny;
b) przed wykonaniem renowacji; c) trzy miesiące i d) 12 miesięcy po wykonaniu renowacji - widoczny ponowny rozwój organizmów żywych i związane z tym zniszczenia.
a) b)
c) d)
Rys. 1.3. Widok ogólny kładki nad przejazdem do hali A4 na terenie Politechniki Poznańskiej;
a) stan przed renowacją, widoczne porażenie organizmami wywołującymi korozję biologiczną;
b) stan po wykonaniu renowacji; c) i d) stan po 1 roku od wykonania renowacji, ponowny rozwój organizmów żywych korodujących materiały kładki - widoczne pęcherze i spękania
warstwy naprawczej.
Z dokonanego przeglądu [Karyś, Matkowski 2002] wynika, że dotychczas stosowane metody diagnozowania oraz sposoby naprawy uszkodzeń spowodowanych grzybami pleśniowymi często są nieskuteczne ( rys.1.2 i rys.1.3). Istotnym czynnikiem warunkującym osiągnięcie lepszych efektów w zakresie zapobiegania i likwidacji skutków korozji biologicznej jest poszerzenie i uszczegółowienie metodyki badawczej.
2.Cel i zakres rozprawy doktorskiej
Podstawowym celem rozprawy doktorskiej było opracowanie poszerzonej metodyki badawczej pozwalającej na przygotowanie procedur kontrolnych, możliwych do zastosowania w obiektach o różnym przeznaczeniu. Dzięki temu możliwe będzie właściwe, lepsze niż dotychczas, zdiagnozowanie poszczególnych przypadków oraz ocena skuteczności zastosowanych metod naprawczych (rys. 2.1).
Rys. 2.1. Kierunek prowadzenia badań zmierzających do opracowania poszerzonej metodyki badawczej
Dla realizacji wytyczonego celu całość badań podzielono na kilka etapów, a mianowicie:
- etap pierwszy to ustalenie i identyfikacja najczęściej występujących grzybów pleśniowych wywołujących korozję biologiczną budowli,
- etap drugi to skażenie wybranych materiałów budowlanych wytypowanymi najczęściej występującymi i najsilniej niszczącymi grzybami pleśniowymi,
- etap trzeci to określenie stopnia rozwoju wybranych rodzajów grzybów zależnie od rodzaju skażonego materiału przez: określenie zmian w zawartości ergosterolu, pomiary bioluminescencji i badania mikroskopowe SEM,
- etap czwarty to określenie przyczyn i skutków obserwowanych uszkodzeń badanych materiałów w różnych okresach badawczych na podstawie pomiarów odczynu pH próbek skażonych i wzorcowych porównawczych oraz bezwzorcowej mikroanalizy rentgenowskiej EDS tychże próbek,
- etap piąty to propozycja poszerzonej metodyki badawczej, możliwej do praktycznego zastosowania w obiektach o różnym przeznaczeniu, pozwalającej na pełniejszą niż dotychczas ocenę zjawisk związanych z działaniem grzybów pleśniowych oraz ocenę skuteczności metod i preparatów użytych w działaniach naprawczych obiektów budowlanych.
Przedmiotem rozprawy doktorskiej jest badanie biodeterioracji mineralnych materiałów budowlanych. W rozprawie pominięto badania materiałów organicznych, np. drewno.
Rodzaj materiału
Stopień rozwoju grzyba
Stopień zniszczenia
materiału
Poszerzona metodyka badawcza
3. Korozja biologiczna obiektów budowlanych w świetle doniesień literaturowych.
3.1. Przyczyny i skutki korozji biologicznej
Problem korozji materiałów budowlanych jest znany od dawna a skuteczna ochrona budynków przed korozją biologiczną jest zagadnieniem bardzo złożonym i trudnym do realizacji. Przebieg procesów korozyjnych jest w tym przypadku zależny od wielu czynników wśród których wymienić należy z jednej strony właściwości fizyczne, chemiczne, strukturę i jakość stosowanych materiałów z drugiej zaś rodzaj organizmów żywych tę korozję wywołujących; ich budowę, fizjologię i wynikający z tego sposób działania na materiały w kontekście panujących warunków środowiskowych. Ten sposób działania pozostaje w ścisłym powiązaniu z działaniem destrukcyjnym wszelkiego rodzaju wód i zawilgoceń, w wyniku którego powstają warunki sprzyjające rozwojowi organizmów żywych. Wyjaśnienie mechanizmu niszczenia różnych materiałów budowlanych, jak i ich właściwego zabezpieczenia wymaga m. in.
znajomości przebiegów procesów korozyjnych [Tokarski, Wolfke 1969; Stoch 1974;
Gruener 1980; Łowińska-Kluge 1997; Łowińska-Kluge, Blaszczyński 2012]. Udział korozji biologicznej w degradacji materiałów ( rys.1.1) jest coraz większy [Kunert, Padolski 2000; Karyś, Ważny 2001; Rogoziński 2005; Żakowska 2006; Cwalina, Dzierżewicz 2007; Cwalina 2008; Rosowsky 2008; Sanchez-Silva, Rosowsky 2008].
Ogólnie stwierdzić można, że korozja biologiczna w budownictwie to zróżnicowane formy niszczenia elementów budowli wywołane działaniem organizmów żywych. Są to przede wszystkim grzyby domowe, grzyby pleśniowe, jednokomórkowe drożdże, glony, porosty oraz w przypadku drewna także owady – szkodniki drewna [Zyska 1999;
Karyś, Ważny 2001; Karyś 2003 ] Zależnie od tego czy materiał stanowi główne pożywienie organizmów żywych czy tylko na nim się rozwijają korzystając z innych źródeł pożywienia mamy głównie do czynienia z:
1) chemiczną asymilacyjną biodeterioracją – ma miejsce gdy materiał jest degradowany z racji swej wartości odżywczej. Procesowi chemicznej biodeterioracji podlegają takie materiały jak: wyroby papiernicze, w tym płyty G-K, materiały drewniane i drewnopochodne, materiały i powłoki malarskie, kleje i kity [Zyska 1999;
Karyś, Ważny 2001; Karyś 2003, Pionek i inni 2012];
2) chemiczną dysymilacyjną biodeterioracją - występuje gdy metabolity drobnoustrojów uszkadzają materiał wchodząc z nim w reakcje powodując korozję, pigmentację lub wydzielanie toksycznych metabolitów do materiału. Przykładem jest biologiczna korozja metali, betonu, cegieł, zapraw murarskich i tynkarskich, skał oraz szkła [Zyska 1999; Karyś, Ważny 2001; Karyś 2003].
Tak więc korozja biologiczna materiałów budowlanych jest wynikiem chemicznego i mechanicznego oddziaływania komórek glonów, grzybów, mchów, porostów i ich metabolitów na porowatą strukturę budowli. Inwazji biologicznej sprzyja duża wilgotność, podwyższone stężenie dwutlenku węgla oraz stała niezbyt wysoka temperatura i dla organizmów fotosyntetyzujących - światło.
Szczególną rolę wśród nich odgrywają grzyby pleśniowe. Generalnie wiadomo, że grzyby te to mikroorganizmy, które łatwo zasiedlają różne powierzchnie szybko adaptując się do panujących, nie zawsze korzystnych, warunków środowiska. Z ekonomicznego punktu widzenia, ich rozwój i negatywne oddziaływania przyczyniają się do ponoszenia określonych kosztów związanych z utrzymaniem wymaganych właściwości, estetyki obiektów oraz konieczności zapewnienia ,,odpowiedniego, zdrowego” mikroklimatu wewnątrz jak i w bezpośrednim otoczeniu obiektów.
Jak już wspomniano we wprowadzeniu, w powietrzu atmosferycznym znajdują się między innymi: konidia grzybów pleśniowych, drożdże oraz bakterie. Drobnoustroje te mogą wnikać do budynku z zewnątrz, a najważniejszym ich źródłem są różne substancje w samym budynku. Pyły i kurze pochodzenia organicznego bogate w drobnoustroje mogą pochodzić z licznych i jakże zróżnicowanych materiałów w budynkach, np. gnijące drewno, materiały wykończeniowe pokryte grzybami pleśniowymi [Płoński, Pogorzelski 1979; Żakowska 2006].
Wpływ obecności kurzu w budynkach na występowanie alergii u osób przebywających w pomieszczeniach zamkniętych był przedmiotem wielu opublikowanych badań. Syntetycznego ich przeglądu dokonał w 1958 r. holenderski lekarz P.J. van der Werff [Werff 1958].
Przedstawione wyniki, pomimo upływu wielu lat, nie utraciły nic ze swej aktualności.
Nadal kurz w domach jest rezerwuarem różnych bakterii i grzybów. Występują tu gatunki grzybów, które są wskaźnikami wilgoci w mieszkaniach; grzybów rozkładających celulozę; grzybów występujących też w powietrzu atmosferycznym oraz grzybów znanych dzisiaj jako chorobotwórcze.
Aby można było skutecznie walczyć z organizmami wywołującymi korozję biologiczną trzeba dobrze poznać ich budowę i ich fizjologię. Tak więc poniżej przedstawiono najważniejsze informacje dotyczące grzybów pleśni, których oddziaływanie na materiały budowlane jest przedmiotem niniejszej pracy (Aspergillus, Penicillium, Cladosporium). I tak:
Aspergillus to pleśnie charakteryzujące się główkowatym zakończeniem konidioforu;
wyrasta on bezpośrednio z podłoża, w którym jest grzybnia substratowa albo tworzy się na strzępkach powietrznych. Konidiofor rozszerza się u góry tworząc pęcherzyk o różnym kształcie tj.: kulistym, półkolistym, elipsoidalnym lub maczugowatym. Na całej powierzchni pęcherzyka lub na jego części powstają fialidy (komórki konidiotwórcze) lub metule i fialidy w jednym lub kilku rzędach. Konidia, zależnie od gatunku pleśni Aspergillus, mogą mieć kształt: kulisty, elipsoidalny i gładki oraz być chropowate lub kolczaste (o różnym zabarwieniu). Konidia osiągają wymiary w granicach 3-5 µm.
Pęcherzyk z metulami, fialidami i konidiami tworzy główkę konidialną (rys. 2.2). Budowa i układ zespołu konidialnego jest cechą charakterystyczną dla gatunku [Libudzisz 2007].
a) b)
Rys. 2.2. Rodzaj Aspergillus:
a) budowa morfologiczna konidioforu: 1 - konidiofor, 2 - pęcherzyk, 3 – metule, 4 - fialidy, 5- konidia; obraz mikroskopowy układu konidialnego Aspergillus versicolor [Libudzisz 2007].
Grzyby strzępkowe z rodzaju Aspergillus występują najliczniej w glebie, rozwijają się na resztkach roślinnych i zwierzęcych, charakteryzują się różnokierunkową aktywnością enzymatyczną. Znanych jest 185 gatunków, wśród których są odmiany powodujące psucie
żywności i biodeteriorację skóry, drewna, papieru oraz innych materiałów w tym i budowlanych. Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus ,nidulans i Aspergillus terreus to gatunki szczególnie patogenne dla ludzi i zwierząt [Goodall, Levi 1946; Włodawiec 1972; Piontek 1999; Godet, Munaut 2010; Piontek, Bednar 2011].
Penicillium to pleśnie, które charakteryzują się konidioforami o budowie przypominającej pędzel. U niektórych gatunków konidiofory mogą być zakończone okółkiem fialid, na których są wytwarzane łańcuchy konidiów. U większości gatunków konidiofory powstają przez rozgałęzienie strzępki konidionośnej. Elementami rozgałęzień są ramiona, a te dalej tworzą metule. Kolejnym etapem rozbudowy konidioforu są fialidy, wytwarzające konidia o wymiarach od 3-5 µm. Układy rozgałęzień mogą być symetryczne lub asymetryczne w stosunku do osi konidioforu. Liczba rozgałęzień, układ fiali oraz cechy morfologiczne konidiów są charakterystyczne dla gatunku [62].Obraz mikroskopowy Penicillium chrysogenum za [Libudzisz 2007] na rys. 2.3.
Rys. 2.3. Rodzaj Penicillium;
a). budowa morfologiczna konidioforu: 1- konidiofor ,2 – ramiona ,3 – ramiona ,4- melule ,5- fialidy, 6- konidia,
b). obraz mikroskopowy układu konidialngo Penicicllium chrysogenum [Libudzisz 2007].
Konidia pleśni z rodzaju Penicillium, podobnie jak innych grzybów strzępkowych, są przenoszone prądem powietrza. Aktywnie uczestniczą w rozkładzie materii organicznej.
a)
b)
Są przyczyną psucia zarówno surowców roślinnych podczas ich magazynowania, jak i produktów spożywczych, do których dostają się jako zanieczyszczenia wtórne z powietrza bądź z linii produkcyjnej. Niektóre szczepy wykorzystuje się w procesach biotechnologicznych, głównie w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym.
Grzyby strzępkowe z rodzaju Penicillium biorą czynny udział w procesach biodeterioracji różnych materiałów technicznych pochodzenia naturalnego oraz syntetycznych [Libudzisz 2007].
Cladosporium to także grzyby strzępkowe, początkowo tworzą one grzybnię białą przechodzącą później w czarną lub oliwkową. Tworzą rozgałęzione łańcuchy konidiów na trzonkach konidionośnych (rys. 2.4).
Rys. 2.4. Cladosposporium cladosporioides;
a) budowa morfologiczna konidioforu : 1 – konidiofor, 2- konidia;
b) obraz mikroskopowy układu konidialnego [Libudzisz 2007].
a)
b)
Konidia, wielo- lub jednokomórkowe mogą mieć kształty cylindryczne lub przybierające postać cytryny o wymiarach odpowiednio: szerokość 4 - 9 µm, długość 9 - 22 µm.
Cladosporium są szeroko rozpowszechnionymi saprotrofami materiału roślinnego, żywności, tekstyliów, materiałów gumowych i szeregu materiałów budowlanych. Znane są również jako patogeny roślin. Rodzaj Cladosporium obejmuje obecnie 50 poznanych i opisanych gatunków [Libudzisz 2007].
Produkowane przez grzyby pleśnie mikotoksyny oraz alergeny są często niebezpieczne dla zdrowia, a nawet życia człowieka [Fisher 1961; Goodall, Levi 1946; Thorne 1992;
Hintikka, Nikulin 1994, Hintikka, Nikulin 1998, Hippelein, Rügamer 2004; Żurkiewicz- Sobczak i inni 2012]. Mikotoksyny to metabolity wtórne. Są związkami o nieznanej lub drugorzędnej funkcji biologicznej. Tworzenie mikotoksyn może być wynikiem zmiany warunków środowiskowych, prowadzi do nadprodukcji metabolitów pośrednich.
Mikotoksyny są produkowane w grzybni i magazynowane jako endotoksyny w grzybni i sporach oraz wydzielane do środowiska jako egzotoksyny. Szczepy toksynotwórcze grzybów pleśniowych występują wśród gatunków z rodzaj: Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Alternaria, Rhizopus, Mucor, Stachybotrys.
Toksynotwórczość grzybów strzępkowych nie jest cechą gatunku, lecz właściwością szczepu, ujawnioną w warunkach wilgotności podłoża, temperatury i dostępności substancji odżywczych. Często jeden szczep wytwarza kilka różnych toksyn [Goodall, Levi 1946; Fisher 1961; Thorne 1992]. Morfologicznie szczepy toksynotwórcze i nietoksynotwórcze nie wykazują żadnych różnic, a obfitość rozwoju pleśni nie jest skorelowana z ilością wydalanej toksyny do podłoża.
Do najważniejszych mikotoksyn, ze względu na powszechność występowania, należą:
aflatoksyny, ochratoksyna A, paulina, fumonizyny, zearaleon, trichoteceny, sterigmatocystyna i womitoksyna Są to związki należące do różnych grup (pod względem chemicznym): pochodne kumaryny, antrachinonu, cyklicznych peptydów oraz sterydów;
wykazują one właściwości słabo polarne, są ciepłostabilne, nie ulegają destrukcji podczas pasteryzacji, a także w wyższych temperaturach . [Hintikka, Nikuli 1998; Hall, Rao 1999].
Mikotoksyny są zwykle produkowane w warunkach deficytu składników pokarmowych, wymaganych do wzrostu grzyba. I tak: aflatoksyny – produkowane są przez różne szczepy Aspergillus flavus Link i Aspergillus parasiticus Speerae, ochratoksyny – produkowane przez niektóre gatunki Penicillium i Aspergillus, trichoceny – wytwarzane przez między innymi przez gatunki rodzaju Fusarium, Stachybrotys i
Myrothecium [Hintikka, Nikulin 1994; Hintikka, Nikulin 1998; Hall, Rao 1999; Godet, Munaut 2012].
Aflatoksyny są wysoce nasyconymi, heterocyklicznymi związkami, zawierającymi fragmenty furanowe. Ochratoksyny to grupa pentaketydów, pochodnych izokumaryny, powiązanej do L- fenyloalaniny.
Trichoceny stanowią grupę sesguierpenoidów, zawierających tricykliczny szkielet złożony z cykloheksanu, cyklopentanu i 6- członowego oksyranowego pierścienia.
Deoksyniwalenol –zawiera również pierścień epoksydowy. Natomiast roridyna, (należąca do makrocyklicznych trichocen i wykrywana w próbkach materiałów budowlanych, zawiera tetrahydropyranowy pierścień [Benbough 1993; Baron 2001].
Jak już wspomniano powyżej mikotoksyny powodują u ludzi i zwierząt różnorodne ostre i chroniczne efekty chorobowe. Ich przyczyną mogą być zarówno zarodniki grzybów, jak i sama grzybnia. W zarodnikach kumulowana jest zasadnicza część wtórnych metabolitów, które tworzone są w widocznych wodnych kroplach wydzieliny na powierzchni grzybni [Chełkowski 1985; Koziróg, Żakowska 2011].W nowszych kliniczno-epidemiologicznych badaniach opisano przypadki zatrucia inhalacyjnego, wywołanego przez mikotoksyny zawarte w zarodnikach należących szczególnie do grzybów pleśniowych, takich jak np.: Stachybotrys chartarum, Aspergillus, Penicillium., Trichoderma, Paedliomyces [Hintikka, Nikulin 1994, Hippelein, Rügamer 2004]. Należy uwzględnić, że wchłonięta drogą wziewną do organizmu każda patogenna spora pleśni może zawierać jedną lub kilka „zamaskowanych" mikotoksyn. [Hintikka, Nikulin 1994] Szczególnie makrocykliczne trichoteceny (satratoksyny, roridyny), produkowane przez grzyby Stachybotrys chartarum, Myrothecium verrucaria (występujące na przegrodach budowlanych zawilgoconych mieszkań), są przyczyną problemów z układem oddechowym, poczuciem zwiększonego zmęczenia, częstych bólów głowy, występujących podrażnień skóry i błon śluzowych (zapalenie spojówek, blokada nosa).
Jak wynika z powyższego samo oznaczenie gatunku grzyba pleśniowego jest niewystarczające do charakterystyki jego znaczenia dla organizmów żywych zasiedlających różne obiekty budowlane. Istotne jest także ustalenie produkowanych przez dany gatunek mikotoksyn. Tyle o wpływie na zdrowie i życie ludzi.
Natomiast jeśli chodzi o trwałość obiektów budowlanych pamiętać należy, że wszystkie materiały z których zostały wzniesione podlegają destrukcyjnym oddziaływaniom różnych czynników. Tradycyjnie sądzi się, że korozja biologiczna występuje tylko w materiałach pochodzenia organicznego tj. na drewnie i elementach
drewnopochodnych.
Grzyby to organizmy heterotroficzne. Nie mają one zdolności syntezy podstawowych związków organicznych z prostych surowców nieorganicznych przy wykorzystaniu energii zewnętrznej (światła, energii chemicznej). Niezbędną do życia energię czerpią z rozkładu substancji organicznej, a źródłem węgla są m.in. węglowodory, alkohole, kwasy tłuszczowe, węglowodany, a także ksenobiotyki.
Węglowodory, zarówno liniowe, o bardzo prostej strukturze, jak metan i jego izomery, a także rozbudowane węglowodory policykliczrie i aromatyczne, to podstawowe związki organiczne. Zdolność do wykorzystywania węglowodorów jest jednak u grzybów raczej wyjątkiem niż regułą. Metany mogą katabolizowć tylko niektóre gatunki drożdży z rodzaju Sporobolomyces (np. S. mseus), Rhodotorula (np. R glutinis) i Pichia (P. pasloris). Wydaje się, że metabolizm metanu w komórkach tych grzybów jest zbliżony do tego obserwowanego w bakteriach metanotroficznych. Przy udziale oksygenazy metanowej metan zostaje przekształcony do metanolu, a następnie utleniony dehydrogenazą metanolową do aldehydu, który po przekształceniu we fruktozo-6-fosforan zostaje włączony w metabolizm komórkowy.
Najczęściej wykorzystywanymi związkami alkoholi jest metanol oraz etanol. Jako źródło węgla i energii wykorzystują je m.in. Candida utilis, Aspergillus nidulans i Armillaria mellea.
Kwasy tłuszczowe mogą być źródłem węgla w przypadku wielu gatunków grzybów.
Ich utlenianie przebiega u wszystkich grzybów w peroksysomach i zachodzi w wyniku fi-oksydacji kwasów tłuszczowych.
Powszechnym źródłem węgla dla grzybów są natomiast węglowodany, zarówno cukry proste, jak i złożone: disachardy, a także polisacharydy, w tym rozbudowane organiczne polimery, jak skrobia, celuloza, chityna, keratyna czy lignina. Warunkiem koniecznym wykorzystania tych węglowodanów jest ich rozłożenie do glukozy, która stanowi podstawowe źródło węgla dla grzybów [Szweykowska, Szweykowski 2007].
Na podłożach nieorganicznych występują najczęściej w symbiozie z glonami tworząc porosty. Grzyby w stosunkowo krótkim czasie mogą całkowicie zniszczyć tylko naturalne substancje organiczne, np. drewno; a w małym stopniu będą atakować materiały organiczne wchodzące w skład tynków, względnie farb. W momencie pojawienia się grzybni wnikających w mikropory znajdujące się na powierzchni elewacji, dochodzi jedynie do powierzchniowych uszkodzeń.
Kamień naturalny należy do najbardziej odpornych materiałów budowlanych, jednak i on ulega niszczącemu wpływowi agresji biologicznej, chemicznej, fizycznej i mechanicznej [Deer i inni; Griffin i inni 1991]. Jest to naturalny i normalny proces starzenia się, czas życia kamiennych obiektów zabytkowych systematycznie ulega skróceniu. Na skutek braku profilaktycznej konserwacji - stan zachowania większości kamiennych obiektów w Polsce należy uznać za alarmujący. Nie doceniając tego zagadnienia, tj. stałej profilaktycznej ochrony i pielęgnacji elementów kamiennych – obserwujemy skutki działania wielu czynników niszczących jak: pęknięcia, szczeliny, rozwarstwienia, pęcherze, złuszczenia, odpryski, wykruszenia, rozmywanie powierzchni, osypywanie, odpadanie nawarstwień i osypywanie się rozłożonych, także wewnętrznych partii kamienia oraz odkształcenia i deformacje. Profilaktyka konserwatorska musi uwzględniać te czynności oraz dobierać odpowiednie metody i środki konserwacji [Gutarowska, Smok 2006].
Nie ma materiału, który byłby całkowicie odporny na niszczące działanie grzybów pleśni.
Materiały nieorganiczne nie stanowią źródła pokarmu dla grzybów. Grzyby odżywiają się związkami organicznymi (białka, tłuszcze, węglowodany, skrobia, cukry i inne) i zużywają go na budowę nowych związków organicznych i komórek, resztę wydzielają w postaci licznych produktów przemiany materii jak: wody, dwutlenku węgla, kwasów organicznych i innych związków chemicznych, wydzielanych przez strzępki grzybni do otoczenia [Szweykowska, Szweykowski 2007].
W obiektach z kamienia substancje organiczne mogą występować w formie szczątkowej. Są to przede wszystkim użyte w postaci warstw malarskich, środków wzmacniających lub hydrofobowych np. białko, kazeina, olej lniany, żywice naturalne, woski itp. Ponadto na ich powierzchni osiadają pyliste cząstki różnych substancji organicznych, mogących być, przy odpowiedniej wilgotności, dostatecznym źródłem węgla dla wielu organizmów żywych.
Grzyby i grzyby pleśniowe najczęściej występują w partiach przyziemnych kamienia i fundamentów gdzie warunki wilgotnościowe i cieplne są odpowiednie do ich rozwoju.
Generalnie przyjmuje się, ze grzyby mogą rozwijać się na podłożach o pH od 3 do 10, przy czym najlepszy wzrost zachodzi na podłożach lekko kwaśnych. Najbardziej narażone na zniszczenie są wapienie lub kamień mający w swym składzie mineralogicznym węglan wapnia. Węglan wapnia pod wpływem kwasów rozkłada się wydzielając dwutlenek węgla i wodę. Należy pamiętać również i o tym, że rozrastająca się grzybnia natrafia na
mechaniczny opór kamieni, rozrasta się po ich powierzchni, wnika w najdrobniejsze nawet szczeliny i wypełnia wolne przestrzenie, powodując różne zmiany, jak wzrost wilgotności, plamy i wykwity soli mineralnych oraz powolną korozję. W obszarze działania grzybów spoiwo przestaje dostatecznie wiązać ziarna piasku i ulega rozluźnieniu.
Pigmenty wytwarzane przez strzępki grzybni powodują zmianę zabarwienia partii porażonych skał, zaś kwasy organiczne wydzielane przez grzyby jak: mlekowy, octowy, jabłkowy, bursztynowy, szczawiowy i inne oddziałują chemicznie na składniki materiałów budowlanych nieorganicznych wywołując w nich korozję chemiczną. Tak więc tworzą z solami wapnia, żelaza, potasu łatwo rozpuszczalne mleczany, octany, cytryniany i inne związki. Związki te są łatwo rozpuszczalne i wtedy zostają wymyte co powoduje osłabienie struktury materiału bądź powstają związki zwiększające swą objętość (np.
działanie siarkowodoru) powodując pęcznienie czy rozsadzanie materiału. W efekcie końcowym następuje powolna korozja, stopniowe skruszenie, odpryskiwanie betonu, skał, ceramiki i zaprawy. Rozwojowi grzybów na przegrodach towarzyszy często silne zawilgocenie, wykwity soli, barwne plamy, wybrzuszenia i odpadanie powierzchniowych warstw. Jeżeli mury kamienne połączone są zaprawą wapienną, to w obszarze działania grzybów spoiwo wapienne przestaje dostatecznie wiązać ziarna piasku, w wyniku czego ulega; rozluźnieniu i skruszeniu. Szczególnie zmniejszoną odporność na działanie substancji wydzielanych przez grzyby obserwuje się na materiałach zawierających w swym składzie dużo związków wapnia. I tak np. dwutlenek węgla wytwarzany przez grzyby rozpuszcza się w wodzie i powoduje przejście węglanu wapnia, z zaprawy czy betonu, w kwaśny węglan wapnia wg następującej reakcji chemicznej CaCO3 + H2CO3 = Ca(HCO3)2.
Kwaśny węglan wapnia jest łatwo rozpuszczalny i jest wymywany. Powoduje to utratę spoistości zapraw i betonów.
W pierwszej kolejności w reakcje wchodzi wapń z wodorotlenku wapniowego (CaOH2) oraz z powstałego w wyniku jego karbonatyzacji węglanu wapnia CaCO3 wchodzi w reakcje z wydzielanymi przez grzyby, w trakcie ich procesów życiowych, związkami chemicznymi. W dalszej kolejności następuje rozpad faz odpowiedzialnych za wytrzymałość mechaniczną (C-S-H; uwodnione krzemiany wapniowe) i stąd jest zabierany do dalszych reakcji wapń. W efekcie końcowym beton ulega stopniowemu niszczeniu, wytrawianiu i rozkruszaniu.
Procesom tym ulega również ceramika i kamienie naturalne [Griffin i inni 1991; Deer i inni 1999]. Tutaj inne związki ulegają rozkładowi. Obserwowany efekt finalny jest jednak
taki sam. Tu również następuje wytrawianie, rozkruszanie i rozkład materiałów.
3.2. Dotychczas stosowane metody badawcze
Mamy tutaj do dyspozycji kilka grup metod. Jedne z nich dotyczą określania obecności mikroorganizmów w powietrzu, inne oznaczania obecności, ilości grzybów oraz rodzaju grzybów występujących na powierzchni materiału. Rozpoznanie grzybów pleśni wymaga często stosowania specjalnych metod badawczych opartych na sztucznej hodowli i obserwacjach mikroskopowych. Generalnie metody te służą ocenie ilościowej i jakościowej skażeń grzybami pleśniowymi. Do określania obecności mikroorganizmów w powietrzu służą także metody oparte na analizie DNA oraz analizach immunoenzymatycznych (TCR, TEST, ELISA) [Sedgwick, Czerkinsky 1992;
Ewen, Baca- Estrada 2001; Doherty i inni 2005; Rakeman i inni 2005; Lim 2011].
3.2.1. Oznaczanie obecności grzybów pleśniowych w powietrzu
Pierwsze próby unormowań mikrobiologicznej czystości powietrza w Polsce sięgają wieku XIX (Bujwid); następnie zagadnienia te wysuwają się na pierwszy plan dopiero w drugiej połowie XX wieku. Najczęściej przytaczane są standardy czystości opracowane przez Krzysztofika dla powietrza wewnątrz mieszkań i pomieszczeń użyteczności publicznej oraz na zewnątrz [Krzysztofik 1992].
Zazwyczaj poziom obecności mikroorganizmów w powietrzu określa się liczbą jednostek tworzących kolonie – JTK w l m3 powietrza [Ruehle 1915; Dianowa 1957;
Turżecki, Oleniewa 1957; Bożko i inni 1961; Krogulski, Podsiadły 2003; Matkowski 2011].
Do analizy czystości mikrobiologicznej powietrza stosuje się metody oparte na działaniu grawitacji oraz wymuszonego poboru powietrza. Dotychczas do oznaczania zanieczyszczenia powietrza stosuje się następujące metody: sedymentacyjne, zderzeniowe, filtracyjne, mikroskopowe, odśrodkowe, badania polegające na wywołaniu reakcji immunologicznej.
Dotychczas stosowane metody nie rozwiązują problemu określania mikrobiologicznej jakości powietrza, a także aparatury stosowanej do poboru próbek. Nie został wprowadzony jednolity sposób pobierania próbek, a także nie wytypowano aparatu, który spełniłby stawiane wymagania dotyczące oceny stopnia mikrobiologicznego
powietrza.[Wiejak 2011]
Dotychczas wykorzystywano różne przyrządy do badań mikrobiologicznych powietrza , m.in. 6- stopniowy aparat Andersena, próbnik kaskadowy Casella ( cascade sampler Casella), impaktor SAS (Surface Air System), aparat Krotowa, aparat szczelinowy Chirana i aparat RCS – Plus oraz płuczki AGI (All Glass Impinger) .
W ostatnim czasie do pobierania próbek powietrza do badań mikrobiologicznych stosowane są głównie metody aspiracyjne z wykorzystaniem podłoży stałych, przy użyciu do tego celu nowoczesnej aparatury – próbników różnego typu i różnej konstrukcji.
Ruehle [Ruehle 1915] uzyskiwał 2-32 razy większą liczbę mikroorganizmów pobierając próbki metodą filtracyjną.
Według Dianowa [1957] w Moskwie na jednej z ulic większe ilości bakterii zostały wykryte metodą filtracyjną niż sedymentacyjną.
Natomiast Turżecki i Oleniewa [1957] metodą zderzeniową (za pomocą aparatu Krotowa) wykrywali 3-6 krotnie mniejsze ilości bakterii w powietrzu atmosferycznym niż metodą sedymentacyjną.
Bożko i inni [1961] pobierali próbki metodą sedymentacyjną i zderzeniową (stosując czeski aparat szczelinowy firmy Chirana). Uzyskali oni większą ilość bakterii w przypadku 66% próbek pobierając próbki powietrza metodą sedymentacyjną w porównaniu z metodą zderzeniową.
Elrich i inni [1966] podali, że za pomocą aparatu szczelinowego ilość wychwytywanych mikroorganizmów stanowi 43,5 % ilość mikroorganizmów pobieranych metodą filtracyjną (AGI-30).
Kudrawcew i inni [1966] określili, że skuteczność wychwytywania mikroorganizmów metodą filtracyjną wynosiła 84% przy przyjęciu wyników uzyskanych przy użyciu aparatu szczelinowego za 100% (potraktowano je jako badanie porównawcze).
Jak wynika z badań przeprowadzonych przez Randalla i Ledbettera [1966] w pobliżu komory napowietrzania komunalnej oczyszczalni ścieków ilość mikroorganizmów pobieranych metodą sedymentacyjną wynosiła 51876 jtk/m3, metodą zderzeniową przy użyciu aparatu Andersena 30700 jtk/m3 , metodą filtracyjną przy użyciu impringera 41300 jtk/m3. Badania te wykazały znaczną przewagę metody sedymentacyjnej w stosunku do zderzeniowej i filtracyjnej.
Jak wynika z badań Wanner i Deuber [1969] przy pobieraniu metodą filtracyjną obecność w powietrzu substancji hamujących dostających się do płuczek metodą filtracyjną zaobserwowano mniejsze ilości wyrastających kolonii na płytkach.
Badania wykazane przez Sayer i innych [1969] wykazały, że metoda sedymentacyjna nie powinna być stosowana do badań ilościowych bakterii i grzybów w powietrzu.
Porównali wyniki otrzymane przy zastosowaniu do pobierania próbek powietrza 6- stopniowego aparatu Andersena z wynikami uzyskanymi metodą sedymentacyjną.
Włodawiec [1972] podzielił metody pobierania próbek powietrza do badań mikrobiologicznych na jakościowe i ilościowe. Według Włodawca [1972] metoda sedymentacyjna nie jest przydatna do ilościowego oznaczania mikroflory powietrza, ponieważ prądy powietrzne sztucznie zwiększają liczbę mikroorganizmów osadzających się na powierzchni podłoży.
Zimmermann i inni [1987] stosowali metodę filtracyjną przy użyciu aparatu rozbijającego konglomeraty mikroorganizmów, AGI – 30 Maya. Stwierdzili, że uzyskanie bardziej wiarygodnych wyników jest możliwe przy pomiarze spodziewanych małych ilości komórek mikroorganizmów w powietrzu.
Thorne i inni [1992] porównali trzy metody pobierania próbek powietrza: metodę zderzeniową (aparat Andersena), metody filtracji przez filtry ciekłe (aparat AGI) i metodę filtracji przez filtry NFE (nucleopore filtration). Najbardziej efektywna do wychwytywania grzybów z powietrza okazała się metoda AGI, a do wychwytywania bakterii – metoda zderzeniowa (aparat Andersena).
Benbough i inni [1993] wykonywali badania przy zastosowaniu dwóch aparatów : próbnika kaskadowego Casella i RCS –Plus . Według Benbough [1993] aparat RCS –Plus zbiera 78 % cząstek pobieranych aparatem Casella , traktowanym jako urządzenie o skuteczności 100 %. Według Benbough [1993]aparat RCS –Plus może być stosowany do badania mikrobiologicznego powietrza w laboratoriach, zakładach pracy, zakładach żywienia zbiorowego oraz szpitalach.
Buttner i Stetzenbach [1993] porównali efektywność oznaczania mikroorganizmów w próbkach powietrza pobranych przy zastosowaniu do badań czterech aparatów: 6 stopniowego aparatu Andersena, aparatu szczelinowego Burkarba, impaktora SAS I aparatuRCS –Plus z metodą sedymentacyjną. Wyniki badań odnosili do pomiaru cząstek o średnicy 0,5-30 µm licznikiem cząstek (APS). Przy zastosowaniu 6 – stopniowego aparatu Andersena uzyskali największe ilości komórek mikroorganizmów i dużą powtarzalność wyników.
Krogulski i Podsiadły [2003] porównywali metodę zderzeniową i sedymentacyjną przy określaniu liczebności grzybów w powietrzu atmosferycznym i w powietrzu pomieszczeń.
Przy pobieraniu próbek metodą zderzeniową uzyskali większą liczebność grzybów.
Gutarowska i Smok [2006] wykonywały badania pobierając próbki trzema metodami:
sedymentacyjną, zderzeniową (4 aparaty ,w tym 1 wirówkowy), filtracyjną (2 aparaty) oraz metodę chemiczną – oznaczania ergosterolu. Największą liczbę grzybów strzępkowych wykrywały metodą filtracyjną ( przy zastosowaniu jednego próbnika) i metodą zderzeniową (przy zastosowaniu jednego aparatu szczelinowego). Największą liczbę mikroorganizmów otrzymano metodą sedymentacyjną.
Według Thorne i innych [1992] badania różnymi metodami w tym samym punkcie pomiarowym i czasie, mogą różnić się tak znacznie, że ich interpretacja może być przeprowadzana tylko w odniesieniu do metody, która została wykorzystana do badań.
Analiza morfologiczna, biochemiczna, badania palinologiczne, sporologiczne nie dają jednoznacznych wyników
Coraz częściej do określenia przynależności gatunkowej materiału biologicznego stosuje się metody genetyczne. Są one mniej kosztowne (niższy koszt analiz DNA) a wyniki uzyskiwane bardziej wiarygodne [Rakeman 2005]
W Instytucie Botaniki Uniwersytetu Jagiellońskiego zastosowano metodę PCR (metoda badania DNA) do rozróżniania gatunków z rodzaju Penicillium.
Według Lim [2011] na prawidłową identyfikację 20-70 % gatunków pozwala gen COI.
Jedną z metod stosowanych do identyfikacji różnych gatunków grzybów jest analiza ich DNA [Linacre i inni 2002; Rakeman 2005; Lim 2011]. Metoda ta polega na wykorzystaniu pojedynczych, krótkich starterów w całym genomie. Stosowano metodę RADP do identyfikacji polimorfizmów i ustalaniu genetycznego dystansu między gatunkami.
Metodą znajdującą zastosowanie w systematyce molekularnej na poziomie gatunku jest metoda analizy DNA, w przypadku grzybów stosowana jest technika amplified fragment length polymorphism (AFLP) [Linacre i inni 2002; Rakeman 2005; Lim 2011].
Do identyfikacji gatunkowej grzybów najczęściej wykorzystywane są regiony ITS1 i ITS2 [Matsumoto i inni 2009; Park i inni 2001; Korabecna 2007].
Jak pokazują badania prowadzone przez różne ośrodki naukowe, wielość dostępnych i stosowanych metod nie przekłada się na wiarygodność i porównywalność uzyskiwanych wyników.
3.2.2. Oznaczanie obecności grzybów pleśniowych na powierzchni materiału
Do oznaczania zanieczyszczenia powierzchni stosuje się następujące metody:
1) Metody wizualne polegające na określaniu procentowego skażenia powierzchni próbki przez grzyby pleśniowe. Stopień skażenia oznaczano wizualnie (okiem nieuzbrojonym lub mikroskopowo). W metodach tych określa się ponadto liczbę gatunków zasiedlających materiał [Charkowska 2003; Kaiser, Wolski 2007; Matkowski 2011] oraz liczba gatunków.
2) Metody hodowlane pozwalające na wykrycie ogólnego stanu zagrzybienia. W metodzie tej określa się liczbę jednostek tworzących kolonie na metr kwadratowy jtk/m2 lub ocenia liczebność kolonii grzybów danego gatunku wyhodowanych na specjalnych podłożach selektywnych [Gutarowska, Smok 2006; Kaiser, Wolski 2007].
3) Metody odciskowe polegającą na wykorzystaniu specjalnych płytek o wypukłej powierzchni. Umożliwia to pobranie dokładnego odcisku badanej powierzchni. Po określonym czasie inkubacji odczytuje się, zależnie od typu płytki, liczbę kolonii lub porównuje gęstość wyrośniętej kolonii.
4) Metodę oznaczeń taksonomicznych (próbki do badań pobiera się w podobny sposób jak w metodzie odciskowej). Po okresie inkubacji przynależność pleśni do rodzaju i gatunku określa się na podstawie budowy anatomicznej grzybów, korzystając z kluczy i atlasów [Charkowska 2003; Kaiser, Wolski 2007; Matkowski 2011]
5) Metody analizy chemicznej to metody enzymatyczne, metody immunologiczne lub metody oznaczania składników komórkowych, takich jak: chityna lub ergosterol.
Ergosterol jest charakterystycznym składnikiem błon komórkowych grzybów. Jego odpowiednikiem w błonie ssaków jest cholesterol. Związek ten obecny jest we wszystkich fazach rozwoju grzybni oraz w konidiach [Gutarowska 1999, Nielsen, Madsen 2000; Gutarowska, Cichocka 2010; Koziróg, Żakowska 2011; Piotrowska, Żakowska 2011]. Ergosterol można oznaczyć z wykorzystaniem różnych technik chromatograficznych w tym wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją w ultrafiolecie (HPLC-UV) 5,22-24 93 lub z detekcją z użyciem spektrometrii mas (HPLC-MS) 24,25-27 94. Stosowano również chromatografię gazową ze spektrometrią mas (GC-MS) 95 .13,22,28,29. HPLC z detekcją UV może być wykonywane w niemal każdym laboratorium, ponieważ wymaga stosunkowo niskich kosztów sprzętu. Jednak
wykrywalność jaką uzyskuje się przy użyciu tej techniki jest ograniczona[Sluis 1981].
Według Seitza i współpracowników [1977] ergosterol jako związek obecny w grzybiczych błonach komórkowych wykorzystuje się do oszacowania zanieczyszczenia grzybami, gdyż nie jest on obecny lub jest mniej ważnym składnikiem ściany komórkowej w roślinach wyższych. Ergosterol w komórkach grzybów jest obecny zarówno w formie wolnej jak i związanej. W formie związanej występuje jako estry, które przy zastosowaniu zmydlania pozwalają uzyskać ergosterol w postaci wolnej.
Dlatego można analizować trzy różne rodzaje różnych próbek. Wolny ergosterol może być ekstrahowany bezpośrednio metanolem. Całkowity obojętny ergosterol otrzymuje się przez zmydlanie ekstraktu metanolowego zawierającego estry ergosterolu.
Całkowity alkaliczny ergosterol oznacza się przez równoczesne zmydlanie i ekstrakcję próbek, co pozwala na uzyskanie również ergosterolu wbudowanego w formie estrów w ściany komórkowe [Newell 1994]. W tym celu konwencjonalna ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE) jest powszechnie stosowana. Konwencjonalna procedura ekstrakcji jest czasochłonna i wymaga dużych ilości reagentów i próbek [Young 1995; Montgomery 2000]. W celu rozwiązania związanych z tym problemów ekstrakcja wspomagana mikrofalami (MAE) została zaproponowana przez Younga [1995]. W tym celu powszechnie stosowana jest konwencjonalna ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE).
Konwencjonalna procedura ekstrakcji jest czasochłonna i wymaga dużych ilości reagentów i próbek [Montogmery 2000]. W celu zmniejszenia związanych z tym problemów Young [1995] zaproponował ekstrakcję wspomaganą mikrofalami (MAE).
Dobra korelacja pomiędzy ilością ergosterolu a biomasą grzybni pozwoliła na słormułowanie przez Gutarowską [1999] równania do wyznaczania ilości grzybni w badanych materiałach na podstawie zawartości ergosterolu:
0,004 E
10 8,429 E
10 1,575
G 6 2 4 (1) gdzie:
G sucha masa grzybni [g], E zawartość ergosterolu [µg].
Niestety, jak wykazały badania m. innymi [ Gutarowska 1999; Nielsen, Madsen 2000; Gutarowska, Smok 2006; Koziróg, Żakowska 2011] jest on także identyfikowany w przypadku grzybów martwych, a więc również po przeprowadzanych procesach dezynfekcji z wykorzystaniem związków chemicznych. Preparaty chemiczne w komórkach grzybów strzępkowych mogą działać w kilku obszarach: w ścianie i błonie
komórkowej oraz we wnętrzu komórek - a w nim głównie na DNA i białka. Mechanizm działania związków przeciwgrzybowych w przypadku błony komórkowej dotyczy głównie oddziaływań na ergosterol poprzez zablokowanie jego syntezy lub rozkład samego strolu. I tak na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że zastosowanie biobiójczego związku N,N-bis ( 3 aminopropylo) dodecyloaminy w stężeniu 0,1 % po 24 h działania powoduje zahamowanie rozwoju grzybni, co przejawia się spadkiem jej suchej masy. Nie powoduje to jednak zmniejszenia ilości identyfikowanego ergosterolu. Jego ilość w przeliczeniu na suchą masę wzrasta.
Komórki grzybni są nieaktywne, ale nadal pozostają w nich struktury błoniaste bogate w ergosterol, co tłumaczy jego wysoką zawartość w martwej grzybni.
Zawartość ergosterolu nie jest więc dobrym parametrem, który informuje o rzeczywistym stanie zagrzybienia powierzchni.
3.2.3. Metody bioautograficzne
Analizę zanieczyszczenia grzybami można przeprowadzić z wykorzystaniem odpowiednich markerów chemicznych. W tym celu, można analizować zarówno zawartość mikotoksyn jak i ergosterolu. Oba wyżej wymienione znaczniki mogą być określane przy użyciu klasycznych metod mikrobiologicznych oraz technik chromatograficznych [Choma 2005; Botz 2011].
1. W metodach mikrobiologicznych określa się zmiany barwy markerów barwiących lub pomiar stref zahamowania wzrostu [Kelly 1999; Brehm- Stecher, Johnson 2003]. Metody te dzieli się na :
- metody rozcieńczeniowe - badany roztwór zawierający substancję hamującą dodawany jest do pożywki lub agaru, który zawiera kultury bakterii;
- metody dyfuzyjne- badanie polega na zahamowaniu wzrostu bakterii lub grzybów na podłożach stałych pod wpływem wybranych substancji hamujących. Tu mamy do dyspozycji trzy rodzaje metod zależnie od sposobu umieszczenia substancji hamujących, a mianowicie: a) dyskową - naniesionych na papierowe dyski; b) studzienkową - umieszczonych w studzienkach wydrążonych w podłożu; c) cylinderkową - w cylinderkach umieszczanych na powierzchni podłoża.
2. Bioautografia (chromatografia cienkowarstwowa) - jest metodą przesiewową (skriningową), która wykrywa substancje (przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze,
przeciwnowotworowe) wpływające na szybkość wzrostu testowych mikroorganizmów w złożonych mieszaninach i matrycach. Dalej przedstawiono tok postępowania w tej metodzie na przykładzie analizy substancji przeciwbakteryjnych [Betina 1973, Botz 2001;
Choma 2005].
Płytkę TLC z plamkami analizowanych substancji (antybiotyków) dociska się do podłoża agarowego, ewentualnie pokrywa agarem lub pożywką z posiewem bakteryjnym. Płytkę się następnie inkubuje, wybarwia i obserwuje strefy zahamowania wzrostu bakterii [Steward 1995].
Wyróżnia się tu bioatografię:
- kontaktową [Meyers, Smith 1964; Narasimhachari, Ramachadran 1967; Betina 1973, Eymann, Hauck 2000; Botz 2001; Choma 2005] - w metodzie tej płytkę TLC z naniesionym badanym antybiotykiem umieszcza się warstwą skierowaną na stronę pożywki z posiewem bakteryjnym na kilka minut lub godzin, następnie usuwa się tę płytkę, a agar poddaje inkubacji. Strefy zahamowania wzrostu bakterii obserwuje się w miejscach, w których plamki z antybiotykami stykają się z agarem. Metoda kontaktowa została wykorzystana po raz pierwszy do oznaczania czystości penicyliny. Goodal i Levi [1946] rozwinięty chromatogram bibułowy dociskali do powierzchni pożywki agarowej umożliwiając dyfuzję antybiotyków z bibuły na pożywkę. Kilkanaście lat później, powstała bioautografia sprzężona z chromatografią cienkowarstwową – (TLC-B). Metodę tę stosował Betina [1973].
- zanurzeniową [Betina 1973; Botz 2001; Choma 2005; Zchmourlo 2005] - w metodzie tej chromatogram pokrywa się półpłynnym agarem z posiewem bakteryjnym. Po stwardnieniu, inkubacji i wybarwieniu mierzone są strefy zahamowania wzrostu bakterii.
Zahamowanie obserwowane jest w miejscu, w którym plamki z antybiotykami stykały się z agarem.
- bezpośrednią
– rozwinięta płytka zanurzana jest lub spryskiwana zawiesiną z mikroorganizmami rosnącymi na odpowiedniej pożywce. [Homans, Fuchs 1970; Sluis 1981; Hostettman 1997; Eymann, Hauck 2000; Botz 2001; Queiroz 2002; Williams, Bergersen 2001; Nagy 2002, Moricz 2003;Nagy 2003; Tyihak 2004; Choma 2005]
Jedną z odmian bioautografii bezpośredniej jest wykorzystanie zjawiska luminescencji wydzielanej przez niektóre bakterie i związki chemiczne [Schmourlo 2005; Weins, Jork 1996]. Służy ona głównie do wykrywania poziomu zanieczyszczenia. Poziom
zanieczyszczenia określa się na podstawie krzywej kalibracyjnej. Do związków chemicznych można zaliczyć lucyferynę (pigment zdolny do emitowania światła na skutek reakcji utleniania lucyferazą), a do najbardziej znanych bakterii luminescencyjnych należą: Vibrio phosporeum, Vibrio fischeri harveyi oraz Photobacterium luciferum, które swą budową i fizjologią przypominają bakterie znajdujące się we florze jelitowej.
Właściwości luminescencyjne bakterii Vibrio fischeri wykorzystano w analityce [100].
Dla uzyskania pełnej informacji o poszczególnych składnikach konieczne jest zastosowania chromatografii cienkowarstwowej (TLC lub HPTLC) z detekcją bioluminescencyjną. Podjęto próbę połączenia HPLC-(HP)TLC – bioluminescencja [Eberz 1996, Weins, Jork 1996;Weins 2006]. Takie połączenie TLC - bioluminescencja zastosowano w analizie ekstraktów roślinnych, sprawdzaniu czystości preparatów chemicznych [ Seifert 2000; Tepe 2004; Weins 2006; Verbittski 2008; Reemtsma 1999], analizie toksyn [Verbitski 2006; Kloppel 2008]. Jako testy skriningowe można traktować testy oparte o Vibrio fischeri.
Na rynku dostępne są testy bioluminescencyjne, m.in. firmy ChromaDex i Camag.
Generalnie w testach tych płytki TLC lub HPTLC (z naniesionymi substancjami) zanurza się w zawiesinie bakterii Vibrio fischeri (płyn bioluminescencyjny), dalej obserwuje się i mierzy bioluminescencję za pomocą kamery CCD. Bioluminescencja utrzymuje się ok. 30 minut tj. do czasu wyschnięcia płytki. Substancje toksyczne identyfikuje się jako ciemne plamki na świecącym tle.
Bioautografia jest stosowana przede wszystkim do:
- wykrywania i oznaczania antybiotyków, a także substancji aktywnych charakteryzujących się między innymi właściwościami przeciwgrzybiczymi,
- kontroli preparatów farmaceutycznych,
-poszukiwania nowych substancji przeciwgrzybiczych, przeciwbakteryjnych i przeciwnowotworowych.
3.2.4. Określanie obecności grzybów w oparciu o emitowaną przez nie bioluminescencję
Glony, grzyby i mchy w trakcie swego wzrostu wykazują bioluminescencję i luminescencję indukowaną światłem. Procesy biochemiczne zachodzące w żyjących organizmach mogą dostarczać energii niezbędnej do wzbudzenia elektronów, które oddają część tej energii w postaci promieniowania luminescencyjnego. Luminescencja indukowana światłem jest efektem wzbudzenia elektronów zachodzącego dzięki pochłonięciu energii kwantów światła padającego na próbkę i następującej po nim emisji części z tej zaabsorbowanej energii w postaci światła. Ten rodzaj luminescencji obserwowany jest praktycznie dla wszystkich materiałów. Odróżnienie
„bioluminescencji” od luminescencji indukowanej światłem jest możliwe poprzez wyciemnianie mierzonego obiektu. Składowa luminescencji indukowanej światłem zanika znacznie szybciej. Promieniowanie to może być użyte jako specyficzny miernik aktywności życiowej grzybów (zarówno tych występujących w postaci aktywnej jak i utajonej) [Floryszak – Wieczorek i inni 2011; Górski i inni 2011;Łowińska – Kluge , Górski 2012 ].
Dotychczas nie były stosowane jako miernik grzybiczego skażenia materiałów, pomiary natężenia bioluminescencji emitowanej przez same grzyby pleśniowe bez użycia wzmacniaczy chemoluminescencyjnych
Stosowana w rozprawie metoda pozwala na rejestrację światła emitowanego bezpośrednio przez grzyby a nie tak jak robiono to dotąd światła emitowanego przez dodawane z zewnątrz obce substancje chemiczne (luminol, lucygenina, lucyferaza itd.) [Wilson, Hastings 1998; Rice i inni 2001; Shimomura 2001; Greer, Szalay 2002; Andreu i inni 2011]
Te dodawane substancje mogą emitować światło również w wyniku reakcji chemicznej nie związanej z metabolizmem grzyba. Stosowana metoda jest wolna od tej wady.
Takie właśnie badania wykonano w niniejszej rozprawie.
3.2.5. Najczęściej stosowane metody usuwania efektów korozji biologicznej
Najważniejszą metodą zaradczą jest profilaktyka, która odpowiednio stosowana w ochronie budynków powinna mieć miejsce w fazie:
•projektowania – polega na takim doborze rozwiązań technicznych i materiałów, które zagwarantują maksymalne zabezpieczenie obiektu przed zawilgoceniem: środki impregnacyjne powinny być właściwie dobrane do poszczególnych elementów konstrukcji
•wykonawstwa – zgodnego z projektem, solidnego, respektującego wszelkie wymogi
sztuki budowlanej
•eksploatacji – natychmiastowe usuwanie źródeł i skutków zawilgocenia wodami opadowymi, gruntowymi lub z urządzeń wodno-kanalizacyjnych: w przypadku awarii, niedopuszczenie do zawilgocenia pomieszczeń wilgocią wewnętrzną, eksploatacyjną (brak wentylacji, przeludnienie pomieszczeń).
Utrzymanie wilgotności względnej powietrza poniżej 60% jest jednym z warunków ochrony konstrukcji murowych przed grzybami. Zwalczanie istniejących grzybów środkami chemicznymi jest złem koniecznym. Przede wszystkim należy skupić się na profilaktyce niedopuszczającej do stworzenia warunków, w których mogą się rozwijać grzyby.
Dbałość o stan techniczny konstrukcji i niedopuszczenie do gromadzenia się w niej wilgoci są najprostszymi środkami zapobiegającymi wzrostowi i rozwojowi grzybów pleśniowych w konstrukcjach murowych. Ilość wilgoci zgromadzonej w konstrukcjach budowlowych jest uzależniona od wielu czynników, między innymi:
-podciągania kapilarnego wód gruntowych przez materiały,
-zawartości wilgoci spowodowanej wadami złej technologii, usterką instalacji wodnej, - napływu wilgoci związanej z czynnościami bytowymi człowieka.
W dobrze zaprojektowanym i wykonanym budynku wilgoć przemieszcza się od źródła powstania, przez miejsca gromadzenia się, do miejsc jej odprowadzenia. Ruch wilgoci w budynku nie powinien powodować zniszczenia biologicznego nawet w materiałach podatnych na rozkład biologiczny [Tokarski, Wolfke 1969; Stoch 1974;
Gruener 1980; Broniewski, Fiertak 1991; Łowińska-Kluge 1997; Kunert, Padolski 2000; Karyś, Ważny 2001; Rogoziński 2005; Sanchez-Silva, Żakowska 2006; Cwalina,
Dzierżewicz 2007; Cwalina 2008; Rosowsky 2008; Łowińska-Kluge, Błaszczyński 2012].
W przypadku złych rozwiązań może wystąpić zjawisko kondensacji pary wodnej na powierzchniach lub wewnątrz przegrody budowlanej, przez co powstają obszary podatne na porażenie grzybami.
Podsumowując, najczęstszymi przyczynami korozji biologicznej w obiektach budowlanych wg [Gruener 1980; Zyska 1999; Karyś, Ważny 2001; Karyś 2003;
Łowińska – Kluge, Słowek 2004; Rogoziński 2005; Wołejko, Matejczyk 2011] są:
-wbudowanie do budynku drewna o zbyt dużej wilgotności, - brak wentylacji przestrzeni konstrukcyjnych,
- brak lub niewłaściwe wykonanie izolacji przeciwwilgociowych,
- stosowanie materiałów skażonych lub niewłaściwie zabezpieczonych przed korozją biologiczną,
- błędy projektowe i wykonawcze przegród budowlanych, - wprowadzenie do konstrukcji porażonych elementów, - usterki izolacji, instalacji i obróbek blacharskich,
- niezgodne z przeznaczeniem wykorzystywanie pomieszczeń,
- nieprawidłowe wykonanie systemu odprowadzenia wód gruntowych i powierzchniowych,
- brak należytej konserwacji obiektu.
Zabezpieczenie istniejącej konstrukcji murowej przed wpływami korozji biologicznej obejmuje przede wszystkim działania zmierzające do stworzenia warunków uniemożliwiających rozwój grzybów oraz propagacji zagrzybienia w przypadku jego powstania.
Jednym z elementów profilaktyki mikologicznej umożliwiającej wczesne ujawnianie korozji biologicznej jest bieżąca kontrola przegród. Dzięki ocenie wizualnej istnieje możliwość istotnego ograniczenia strat i stosunkowo łatwego zahamowania procesów destrukcyjnych. Sposób postępowania z zagrzybionym murem wymaga indywidualnego podejścia. W praktyce stosuje się procedury ułatwiające ocenę porażenia biologicznego i projektowanie prac remontowych pod kątem eliminacji przyczyn zagrożeń.
Bardzo poważną rolę w przygotowaniu prac odgrzybieniowych odgrywa opinia mikologiczna, określająca aktualny stan techniczny obiektu, przyczyny porażenia oraz sposoby likwidacji ujawnionych zjawisk.
Zebranie odpowiednich danych do dokumentacji obejmuje:
- oględziny konstrukcji,
- zapoznanie się z dokumentacją techniczną,
- zebranie istotnych informacji od użytkowników obiektu, - wykonanie niezbędnych szkiców, zdjęć, pomiarów, - wykonanie odkrywek w miejscach charakterystycznych, - pobranie próbek do badań laboratoryjnych,
- oznaczenie gatunków występujących mikroorganizmów.
W czasie oględzin zewnętrznych konstrukcji murowej należy zwrócić uwagę na wszelkie usterki techniczne powodujące zawilgocenie i właściwie ocenić:
- rodzaj tynków i ich stan techniczny (zacieki, przebarwienia pęknięcia, ubytki), - stan gzymsów, okapów, cokołów, opasek odwadniających,
- szczelność i drożność rynien i rur spustowych,
- stan techniczny izolacji przeciwwilgociowej fundamentów,
- ukształtowanie terenu wokół budynku pod względem zabezpieczenia przed wodami powierzchniowymi,
- stan techniczny drenażu terenu przyległego i jego drożność, - rodzaj gruntu i głębokość występowania wód gruntowych, - stan techniczny stolarki otworowej,
- stan zabezpieczeń przed zaciekaniem wód opadowych.
W czasie oględzin wewnątrz budynku należy zwracać uwagę na objawy występowania korozji biologicznej, do których należą:
- podwyższona wilgotność materiałów budowlanych, - specyficzna woń wewnątrz pomieszczeń,
- występowanie zawilgoceń ścian, zacieki, plamy, wykwity soli, - występowanie grzybów w postaci grzybni, sznurów i owocników, - pryzmatyczne spękania drewna,
- obecność pleśni na powierzchni tynków,
- łuszczenie się farb, wybrzuszanie się i odpadanie tynków [Zyska 1999; Karyś, Ważny 2001; Karyś 2003; Pionek i inni 2012].
Zapobieganie obrastaniu elewacji ma szczególne znaczenie w przypadku realizowanych obecnie bardzo często dociepleń budynków w systemie lekkim mokrym.
Po zastosowaniu termoizolacji powierzchnia tynku jest wilgotna przez dłuższy czas,
gdyż ciepło doprowadzane jest jedynie od zewnątrz. Wymusza to na producentach proponowanie do stosowania na elewacjach materiałów wysoce wodoszczelnych, nie zmniejszających jednak dyfuzji gazów oraz pary wodnej wydostającej się z wnętrza domów. Tego typu rozwiązaniami stały się tynki o charakterze silikatowym oraz silikonowym.
Coraz częściej praktykuje się także malowanie farbami o odczynie pH uniemożliwiającym rozwój mikroorganizmów. Farby elewacyjne o odczynie kwasowym (pH poniżej 2) są praktycznie niedostępne, natomiast znacznie łatwiej o farby o charakterze alkalicznym. Są to farby tworzące powłoki charakteryzujące się właściwościami fizyko-chemicznymi ograniczającymi możliwość ponownego zasiedlenia przez mikroorganizmy. Przykładem farb o odczynie alkalicznym mogą być farby silikatowe. Tak wysoka zasadowość uniemożliwia rozwój mikroorganizmów w malarskiej powłoce. Farby tego typu są z reguły stosowane do wymalowań zewnętrznych elewacji, w celu ich ochrony przed wodą, czynnikami atmosferycznymi, chemicznymi i biologicznymi. Używanie ich jest szczególnie polecane do podłoży wymagających powłok o wysokiej dyfuzji pary wodnej i gazów.
Innymi farbami, służącymi do zabezpieczania elewacji budynków przed niekorzystnym działaniem środowiska są farby silikonowe. Służą zarówno do zabezpieczenia przed efektami korozji biologicznej jak i chemicznej. Ich mikroporowata struktura pełniąca funkcję tzw. „szczotki molekularnej” farby, nie tworzy szczelnej powłoki na malowanej powierzchni, a zapewnia swobodną wymianę gazów i pary wodnej, przy jednoczesnej ochronie przed wodą w stanie ciekłym.
Dodatkowo wyschnięta powłoka farby uniemożliwia gromadzenie się ładunków elektrostatycznych na powierzchni powłoki, dzięki czemu elewacja ulega samooczyszczaniu pod wpływem nawet najmniejszych opadów atmosferycznych.
Wiele podłoży mineralnych można poddać swego rodzaju impregnacji, pokrywając je środkami hydrofobizującymi. Ze względu na małocząsteczkową strukturę, preparaty te wykazują bardzo dobre zdolności penetracji i wnikania w głąb materiału. W materiale budowlanym reagują chemicznie w obecności wilgoci atmosferycznej w porach materiału, przechodząc w hydrofobową, odporną na promieniowanie ultrafioletowe i działanie czynników atmosferycznych substancję czynną. Po zabiegu substancja ta odkłada się na ściankach kapilar i porów, jako makromolekularna, czyli
