Transmisja, I/I 0

Krzysztof Gibasiewicz

Zakład Biofizyki Molekularnej tel. 61 829 6370

e-mail: krzyszgi@amu.edu.pl

Metody spektroskopii molekularnej

- III rok biofizyki molekularnej

Metody eksperymentalne biofizyki

- I rok II stopnia fizyki medycznej i optometrii

http://bio4.fizyka.amu.edu.pl/MSM/MSM.htm Biofizyka molekularna

Ćwiczenia – demonstracje: czwartki 9.00-10.30 lub inny termin po uzgodnieniu z

osobami prowadzącymi; pierwsze zajęcia – dr A. Wilk 23 luty 2012 (wilk@amu.edu.pl)

Literatura

Wiliam W. Parson, Modern Optical Spectroscopy, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2007

Zbigniew Kęcki, Podstawy spektroskopii molekularnej, PWN W-wa

1992 lub nowsze wydanie

Metody spektroskopii molekularnej – plan wykładów

1) Spektroskopia optyczna (12 wykładów)

- wprowadzenie do zjawisk optycznych (absorpcja, fluorescencja, rozpraszanie światła) i technik z nimi związanych (3 wykłady),

- wprowadzenie do mechaniki kwantowej jako podstawy rozumienia zjawisk optycznych (3 wykłady),

- światło - klasyczny i kwantowo-mechaniczny opis promieniowania elektromagnetycznego (2 wykłady), - zjawiska absorpcji i fluorescencji w ujęciu kwantowo- mechanicznym (4 wykłady).

2) Spektroskopia magnetyczna (3 wykłady)

- jądrowy rezonans magnetyczny (NMR, nuclear magnetic resonance),

- elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR, electron

paramegnetic resonance).

Plan wykładu wprowadzającego

1) Zagadnienia do przypomnienia 2) Definicje i podział spektroskopii

3) Informacje wstępne nt. spektroskopii optycznej 4) Wprowadzenie do zjawisk absorpcji i fluorescencji 5) Metody pomiaru absorbancji

6) Wprowadzenie do zjawisk dichroizmu liniowego i kołowego 7) Podstawowe pojęcia i techniki pomiaru fluorescencji

8) Wprowadzenie do spektroskopii podczerwieni i rozpraszania

ramanowskiego

Zagadnienia do przypomnienia

1) Światło jako fala (elektrodynamika)

2) Kwantowa natura poziomów energetycznych atomów i cząsteczek (fizyka atomu i cząsteczki).

3) Orbitale atomowe i molekularne (chemia organiczna).

4) Formy energii cząsteczek – rotacyjna, oscylacyjna i

elektronowa (podstawy biofizyki II).

Spektroskopia – nauka o badaniu materii za pomocą promieniowania (elektromagnetycznego, neutronowego,...).

Spektroskopia molekularna – materię stanowią cząsteczki.

Skupimy się na cząsteczkach:

a) biologicznych,

b) w roztworach wodnych lub organicznych.

Definicje

Spektroskopia optyczna

EPR

~1 cm

NMR

~10 m

spektroskopia optyczna

~1 µm

Spektroskopia optyczna – badanie materii za

pomocą światła

(włączając bliski nadfiolet

i podczerwień)

Zalety technik spektroskopii optycznej

1) Czułość

- fotopowielacze, fotodiody rejestrują pojedyncze fotony emitowane przez wzbudzone cząsteczki, 2) Szybkość

- impulsy światła <10

s – zachowanie cząsteczek w skali czasu ruchu jąder atomowych.

milisekundy, ms – 10^-3 s mikrosekundy, µs – 10^-6 s nanosekundy, ns – 10^-9 s pikosekundy, ps – 10^-12 s femtosekundy, fs – 10^-15 s

Informacje uzyskiwane za pomocą technik spektroskopii optycznej

Absorpcja, fluorescencja, liniowy i kołowy dichroizm:

identyfikacja cząsteczek,

stęŜenie,

energie,

konformacja,

dynamika,

wpływ otoczenia na ww.,

wyznaczanie odległości między cząsteczkami,

umiejscowienie i dynamika cząsteczek w Ŝywych komórkach (w

powiązaniu z inŜynierią genetyczną i mikroskopią).

Jak cząsteczki reagują na światło?

Cząsteczki istnieją w dobrze określonych stanach i przechodzą z jednych stanów do innych.

Opisu tych stanów i przejść dostarcza mechanika kwantowa.

Ale!

Cząsteczki biologiczne są zbyt duŜe, Ŝeby mogły być opisane ściśle metodami kwantowo-mechanicznymi.

Jednak!

Kwantowo-mechaniczne zasady sformułowane na podstawie

prostszych układów pomagają zrozumieć duŜe cząsteczki.

Stan podstawowy

RóŜne stany cząsteczek wynikają z róŜnego obsadzenia orbitali molekularnych przez elektrony.

KaŜdy orbital ma ściśle określoną energię.

Stan podstawowy 2n-elektronowej cząsteczki:

- kaŜdy z n orbitali o najniŜszej energii jest obsadzony przez 2 elektrony o przeciwnych spinach,

- orbitale o wyŜszych energiach są puste.

W nieobecności zaburzeń zewnętrznych cząsteczka pozostaje w stanie

podstawowym nieskończenie długo.

Światło (klasycznie) = oscylujące pole elektromagnetyczne

Oscylacja elektronów w cząsteczce

Przemieszczenie elektronu z jednego z zajętych orbitali na wolny orbital o wyŜszej energii

Ekspozycja cząsteczki na światło

Dwa warunki przejścia elektronu na wyŜszy orbital

1) Pole elektromagnetyczne musi drgać z odpowiednią częstotliwością:

- ∆E róŜnica energii pomiędzy stanami podstawowym i wzbudzonym

- h – stała Plancka.

Kolory cząsteczek!

(Nie ma konieczności odwoływania się tutaj do kwantowej natury światła! Wystarczy kwantowa natura stanów energetycznych

cząsteczki!)

ν = ∆E/h

Kolory cząsteczek!

Pasmo Q_y – w czerwieni (Chl)

Pasmo Soreta – w obszarze niebieskim lub uv

Zielony kolor chlorofili

Dwa warunki przejścia elektronu na wyŜszy orbital – c.d.

2) Orbitale, pomiędzy którymi przechodzi elektron muszą mieć róŜną symetrię geometryczną i muszą być odpowiednio zorientowane względem kierunku oscylacji pola EM

pasma absorpcji róŜnych cząsteczek róŜnią się,

absorpcja światła przez próbki anizotropowe zaleŜy od kierunku polaryzacji światła względem próbek.

Moment przejścia

Moment przejścia (transition dipole)

– wektor określający siłę pasma absorpcji i optymalny kierunek polaryzacji światła dla danej cząsteczki,

– moŜe być obliczony ze znajomości orbitali molekularnych w stanie podstawowym i wzbudzonym,

– podniesiony do kwadratu – siła dipola (dipole strength) – proporcjonalna do siły absorpcji (pole powierzchni pod pasmem absorpcji).

Fluorescencja

Emisja światła przez wzbudzoną cząsteczkę podczas jej powrotu do stanu podstawowego

Podobnie jak przy absorpcji:

Ale zazwyczaj

1) v’ ≠ v i ∆E’ ≠ ∆E

2) kierunki polaryzacji światła zaabsorbowanego i wyemitowanego są róŜne

ν ’ = ∆E’/h

Prawo Lamberta-Beera

dIIdx = −ε’ I C

dI – zmiana natęŜenia światła przy przechodzeniu przez cienką warstwę próbki o grubości dx

dx – grubość warstwy próbki I – natęŜenie światła

C – stęŜenie cząsteczek aborbujących ε’ – stała proporcjonalności zaleŜna od:

- długości fali światła,

- struktury i orientacji cząsteczek, - środowiska.

Prawo Lamberta-Beera – c.d.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Transmisja, I/I 0

Grubosc warstwy absorbujacej [j.u.]

T = I/I₀ = 10^-εCl

dIII = −ε’ C dx

I = I₀ exp(−ε’Cl) = I₀ 10^{−ε C l} ≡ I₀ 10^-A

I₀ I

l

A – absorbancja, gęstość optyczna (A=εCl), (bezwymiarowa)

ε – molowy współczynnik ekstynkcji

(absorpcji), ε = ε’/ln 10 = ε’/2.303, (M^-1 cm^-1) C – stęŜenie cząsteczek aborbujących (1 M

= 1 mol/litr)

l – grubość absorbujacej próbki, (cm) I₀, I – natęŜenie światła padającego i przechodzącego, (J s^-1 cm^-2, W cm^-2)

Metody spektroskopii molekularnej

Spektroskopia optyczna Spektroskopia magnetyczna

podstawowe zjawiska optyczne

(absorpcja, fluorescencja, rozpraszanie światła) i techniki eksp. z nimi

związanych

światło

– opis klasyczny i kwantowo- mechaniczny

mechanika kwantowa

- podstawa rozumienia

zjawisk optycznych

absorpcja i fluorescencja

w ujęciu kwantowo- mechanicznym

NMR

jądrowy rezonans magnetyczny

EPR

elektronowy rezonans

para- magnetyczny

Przypomnienie

Światło monochromatyczne

- światło o jednej długości fali lub (w rzeczywistości) – o wąskim przedziale długości fali

ν = c/nλ

v – częstotliwość fali EM

c – prędkość światła w próŜni

n – współczynnik załamania światła w danym ośrodku λ – długość fali

Widmo absorpcji

- zaleŜność absorbancji (A=εcl=log(I

/I)) lub molowego współczynnika ekstynkcji (ε) od częstotliwości światła (v), długości fali światła (λ) lub liczby falowej (v = 1/λ = v/c; cm

)

ν = c/nλ ν = ∆E/h

400 500 600 700 800

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

A

λ [nm]

12000 14000 16000 18000 20000 22000 24000 26000 0.0

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

A

liczba falowa [cm

]

Fotosystem I

(Chlamydomonas reinhardtii)

Widma absorpcji - rotacyjne, oscylacyjne i elektronowe cząsteczek biologicznych

1) Widma elektronowe – 300 do 800 nm

2) Widma oscylacyjne – podczerwień

3) Widma rotacyjne – daleka podczerwień

A

λ

zakres widzialny

(uv-vis)

pod- czerwień

(IR)

daleka pod- czerwień

(far IR)

260-280 nm – aminokwasy aromatyczne (elektrony na orbitalach π w łańcuchu bocznym odpowiadają za aborpcję)

(mostki dwusiarczkowe –S –S– pomiędzy dwoma cysteinami)

Elektronowe widma absorpcji aminokwasów i białek

Przejście z orbitalu π (wiąŜącego) na π* (niewiąŜący)

W – tryptofan Y – tyrozyna F – fenyloalanina

190-215 nm – wiązania peptydowe, – C(O) –N(H) –

ε_190nm = 7000 M^-1 cm^-1

Elektronowe widma absorpcji zasad azotowych i kwasów nukleinowych

~260 nm – nukleozydy DNA (znów elektrony na orbitalach π odpowiadają za aborpcję) dA – deoksyadenozyna

dG – deoksyguanozyna (rys.) dU – deoksyurydyna

dC – deoksytymidyna

Widma zasad azotowych, nukleozydów (zasada + cukier) i nukleotydów

(nukleozyd + gr fosforan.) są podobne!

deoksyguanozyna guanina

adenina

Widmo DNA

Podwójna nić 25 st. C

Efekt hipochromowy – 30-40%

spadek absorbancji po utworzeniu podwójnej nici DNA przez nukleotydy - oddziaływanie elektronów

naleŜących do róŜnych nukleotydów Poj. nić,

82 st. C Trawienie enzymatyczne

Maksima absorpcji i współczynniki ekstynkcji aminokwasów i zasad

azotowych w wodzie

aminokwasy

zasady azotowe

„silne”

barwniki (np. chlorofil)

> 100,000 M^-1 cm^-1

Widma absorpcji mieszanin

Absorbancja mieszaniny nieoddziałujących ze sobą cząstek jest sumą absorbancji poszczególnych składników k

Prawo Lamberta Beera dla mieszaniny kilku typów cząsteczek o stęŜeniach C_i:

Z ww. układu równań moŜna wyliczyć stęŜenia C_i (liczba róŜnych długości fal ≥ liczba składników).

Punkt izozbestyczny

- długość fali, λ_i, przy której dwie róŜne cząsteczki mają jednakowe współczynniki ekstynkcji

- zmiana proporcji stęŜeń tych dwóch typów cząsteczek – brak zmian absorbancji w λ_i

- obserwacja punktu izozbestycznego sugeruje Ŝe mieszanina składa się tylko z dwóch składników

Składniki A i B

Mieszanina A i B o róŜnych proporcjach

A

B

Wyznaczanie stęŜenia białka

- z prawa Lamberta-Beera na podstawie pomiaru A przy 280 nm:

C = A

/(ε

l )

i wyliczonego współczynnika ekstynkcji dla białka przy 280 nm:

ε

= (5500 x W + 1490 x Y + 125 x CC) M

cm

W, Y, CC – ilość tryptofanów, tyrozyn i mostków dwusiarczkowych

w badanym białku

Metody pomiaru absorbancji

A = log(I ₀ /I)

Pomiar absorbancji sprowadza się do pomiaru natęŜenia światła

Pomiar natęŜenia światła

1) Fotopowielacze – efekt fotoelektryczny 2) Fotodiody – zjawisko fotoelektryczne

wewnętrzne

Efekt fotoelektryczny (Einstein, 1905)

- podstawa działania fotopowielacza

- wybicie elektronu przez światło padające na stałą powierzchnię

1) Światło musi mieć częstotliwość większą od progowej, v > v₀

2) Energia kinetyczna wybitego elektronu jest proporcjonalna do (v-v₀)

3) Wybicie następuje natychmiast nawet przy bardzo słabym natęŜeniu światła

=> światło ma naturę korposkularną

=> kaŜda cząstka światła (nazwana fotonem w 1926 r.) ma określoną ilość energii proporcjonalną do v

=> natęŜenie światła jest miarą ilości fotonów przechodzących przez 1 cm² w czasie 1 s (a nie miarą energii fotonów)

1, 2 – dwa róŜne materiały

Fotopowielacz

- 6 do 14 elektrod przyspieszających elektrony

- fotokatoda, dynody, anoda, napięcie przyłoŜone między tymi elektrodami - wzmocnienie prądu 10⁶ – 10⁸

- za anodą sygnał wzmacniany na wzmacniaczu i rejestrowany jako ciągły sygnał lub pojedynczy impuls rejestrowany cyfrowo (praca w trybie zliczania

pojedynczych fotonów)

- wysoka czułość – wydajność kwantowa 25%

- rozdzielczość czasowa 10^-9 – 10^-8 s <= rozrzut czasów przelotu elektronów

Fotopowielacz

Fotopowielacz mikrokanalikowy (MCP)

- zasada działania jw.

- mniejsze rozmiary – kapilary, na ściankach których następuje wzmacnianie prądu

=> impuls na anodzie (rozdzielczość czasowa) ~2 x 10

s (20 ps)

Fotodiody

- światło generuje pary elektron-dziura w półprzewodnikach =>

powstaje impuls prądu

- wydajność kwantowa do 80%

- typowa rozdzielczość czasowa – 10

– 10

s

- fotodiody o małych powierzchniach czynnych - rozdzielczość czasowa 10

s

rozmiary < 1 mm

Spektrofotometr absorpcyjny

- lampa – światło białe, ciągłe

- monochromator – zamiana światła białego na monochromatyczne - rozszczepienie światła białego (na siatce dyfrakcyjnej)

- selekcja wąskiego pasma długości fali (przez obrót siatki dyfrakcyjnej)

- dobieranie rozdzielczości spektralnej (przez regulację szerokości szczelin) - wirujące lustro – obszary odbijające i przepuszczające światło – dwie wiązki - fotodetektor (PD) – fotopowielacz lub fotodioda

wirujące lustro

I_r I_s I₀

I₀

A = log (I₀/ I_s) − log(I₀/ I_r) = log(I_r/ I_s)

Siatka dyfrakcyjna

Spektrofotometr absorpcyjny - ograniczenia

wirujące lustro

I_r I_s I₀

I₀

- długi czas pomiaru – skanowanie długości fali przez obrót siatki dyfrakcyjnej (rozwiązanie – linijka diodowa w niektórych instrumentach)

- zwiększanie rozdzielczości spektralnej (zmniejszanie szczeliny) => zwiększenie szumu (mniej światła)

Spektrofotometr FTIR

FTIR = Fourier Transform Infra Red – do pomiarów w podczerwieni - dwie wiązki monochromatycznego spójnego światła interferują za

półprzepuszcalnym lustrem pozytywnie lub negatywnie zaleŜnie od połoŜenia ruchomego lustra => powstaje interferogram (wykres zaleŜności rejestrowanego natęŜenia światła od połoŜenia L ruchomego lustra) w postaci sinusoidy (okres = długość fali), jej transformata – delta Diraca

półprzepuszczalne lustro

v

transformacja Fouriera L, t

interferogram I I

I – natęŜenie światła na detektorze L – połoŜenie ruchomego lustra t – czas

Spektrofotometr FTIR

FTIR = Fourier Transform Infra Red

- dwie wiązki monochromatycznego spójnego światła interferują za

półprzepuszcalnym lustrem pozytywnie lub negatywnie zaleŜnie od połoŜenia ruchomego lustra => powstaje interferogram (wykres zaleŜności rejestrowanego natęŜenia światła od połoŜenia L ruchomego lustra) w postaci sinusoidy (okres = długość fali), jej transformata – delta Diraca

półprzepuszczalne lustro

v

transformacja Fouriera

interferogram

Spektrofotometr FTIR

FTIR = Fourier Transform Infra Red

- dwie wiązki monochromatycznego spójnego światła interferują za

półprzepuszcalnym lustrem pozytywnie lub negatywnie zaleŜnie od połoŜenia ruchomego lustra => powstaje interferogram (wykres zaleŜności rejestrowanego natęŜenia światła od połoŜenia L ruchomego lustra) w postaci sinusoidy (okres = długość fali), jej transformata – delta Diraca

- wiązki niemonochromatyczne => interferogram - złoŜeniem oscylacji o wielu okresach; jego transformata – „widmo” promieniawania ze źródła IR

półprzepuszczalne lustro

v

transformacja Fouriera L

interferogram

Spektrofotometr FTIR

FTIR = Fourier Transform Infra Red

- dwie wiązki monochromatycznego spójnego światła interferują za

półprzepuszcalnym lustrem pozytywnie lub negatywnie zaleŜnie od połoŜenia ruchomego lustra => powstaje interferogram (wykres zaleŜności rejestrowanego natęŜenia światła od połoŜenia L ruchomego lustra) w postaci sinusoidy (okres = długość fali), jej transformata – delta Diraca

- wiązki niemonochromatyczne => interferogram - złoŜeniem oscylacji o wielu okresach; jego transformata – „widmo” promieniawania ze źródła IR

półprzepuszczalne lustro

v

transformacja Fouriera L

interferogram

Spektrofotometr FTIR

FTIR = Fourier Transform Infra Red

- dwie wiązki monochromatycznego spójnego światła interferują za

półprzepuszcalnym lustrem pozytywnie lub negatywnie zaleŜnie od połoŜenia ruchomego lustra => powstaje interferogram (wykres zaleŜności rejestrowanego natęŜenia światła od połoŜenia L ruchomego lustra) w postaci sinusoidy (okres = długość fali), jej transformata – delta Diraca

- wiązki niemonochromatyczne => interferogram - złoŜeniem oscylacji o wielu okresach; jego transformata – „widmo” promieniawania ze źródła IR

- po włoŜeniu próbki - interferogram zawiera obniŜony udział absorbowanych oscylacji

półprzepuszczalne lustro

v

transformacja Fouriera L

interferogram

po włoŜeniu próbki

Spektrofotometr FTIR – widmo absorpcji

A(ν) = log [S

(ν)/S

(ν)]

S

(v), S

(v) – transformaty Fouriera interferogramów

otrzymanych bez próbki i z próbką

Spektrofotometr FTIR – zalety

1) Lepszy, w stosunku do klasycznych

spektrofotometrów, stosunek sygnału do szumu (mniejszy szum)

2) Szybszy pomiar

3) Precyzyjna kalibracja długości fali

4) Wysoka czułość (światło zewnętrzne, które nie

przechodzi przez interferometr nie wprowadza błędu,

bo nie jest skorelowane z L)

Czasowo-rozdzielcze pomiary zmian absorpcji

Układ typu pompa-sonda (demonstracja) – wzbudzenie przez krótki impuls pompujący inicjuje zmiany absorpcji próbki, które ewoluują w czasie, aŜ do zaniku stanu wzudzonego i powrotu cząsteczek do stanu podstawowego.

Chwilowe róŜnicowe widma absorpcji – pomiar impulsami sondującymi dla róŜnych chwil czasu (linia opóźniająca).

∆A = A_exc – A = log(I₀/I_exc) – log(I₀/I) = log (I/I_exc)

I₀

I, I_exc

„pompa” (światło wzbudzające;

monochromatyczne)

„sonda” (światło próbkujące; białe lub monochromatyczne)

ruchoma linia opóźniająca – pomiary zmian absorpcji w funkcji czasu

Czasowo-rozdzielcze pomiary (zmian) absorpcji

Wybielanie – spadek A

Stan podst.

A

λ

A

λ

λ

∆A 0

1 E

∆A

λ λ

∆A A

λ Stopniowa odbudowa

pasma absorpcji w czasie

Stan wzbudz.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Absorbancja

Czas [j.u.]

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

-1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0

Zmiana absorbancji

Czas [j.u.]

Czasowo-rozdzielcze pomiary zmian absorpcji c.d.

Układ pompa-sonda

- rozdzielczość czasowa do 10^-14 s (10 fs)

- c = s/t, c = 3 x 10⁸ m/s, s = 1 cm => t = 0,33 x 10^-10 s (3,3 ps) - okno czasowe do t = 5 x 10^-9 s (5 ns) => l = 1,5 m

- detektor – linijka diodowa lub kamera CCD – całe widmo róŜnicowe jednocześnie

- konieczność wielokrotnego uśredniania

Pomiary zmian absorpcji w wolniejszej skali czasu – w czasie rzeczywistym (demonstracja).

Polaryzacja liniowa

Dichroizm liniowy

- zjawisko zaleŜności siły absorpcji wiązki światła spolaryzowanego liniowo od kierunku polaryzacji

A ~ cos

θ

- zaleŜność między kątem θ a absorbancją

θ

kierunek polaryzacji

dipolowy moment przejścia

Dichroizm liniowy c.d.

Próbka anizotropowa (nieuporządkowana) – brak dichroizmu liniowego

Próbka izotropowa – uporządkowanie cząsteczek wymuszone przez

- przepływ,

- ściskanie lub rozciąganie Ŝelu, w którym są cząsteczki,

- pole magnetyczne (porządkuje błony)

- pomiar za pomocą klasycznego spektrometru absorpcyjnego wyposaŜonego dodatkowo w polaryzator

Dichroizm liniowy indukowany

-dichroizm liniowy jest spowodowany uprzednim wzbudzeniem wybranych cząsteczek światłem spolaryzowanym liniowo

liniowo

spolaryzowane światło próbkujące

impuls światła wzbudzającego (liniowo spolaryzowanego)

Dichroizm liniowy indukowany

Dichroizm liniowy indukowany

- zanik indukowanego dichroizmu w czasie niesie informację o dynamice obrotu cząsteczki, szybkości zaniku wzbudzenia lub jest efektem obu procesów

Dichrozim kołowy

- zajwisko róŜnej absorbancji światła spolaryzowanego kołowo prawo- i lewoskrętnie

- polaryzacja kołowa – składowe x i y wektora pola elektrycznego fali EM mają jednakowe amplitudy i są przesunięte w fazie względem siebie o 90 stopni

Polaryzacja kołowa

- częstotliwość rotacji wektora pola elektrycznego jest taka sama

częstotliowść drgań wektora

elektrycznego fali spolaryzowanej liniowo

Polaryzacja lewostronna

Dichrozim kołowy (circular dichroizm, CD) c.d.

- zazwyczaj bardzo mały 10^-4, ale mierzalny dzięki szybkiemu naprzemiennemu włączaniu światła spolaryzowanego prawo- i lewostronnie => mała oscylująca składowa światła przechodzącego

- wyraŜony w róŜnicy molowych współczynników absorpcji światła spolaryzowanego prawo- i lewostronnie (∆ε = ε_p – ε_l , M^-1cm^-1) lub,

częściej (z powodów historycznych) jednostkach eliptyczności (w stopniach x M^-1cm^-1)

Przed próbką Za próbką

światło próbkujące spolaryzowane eliptycznie światło próbkujące spolaryzowane liniowo

Dichrozim kołowy białek i kwasów nukleinowych

- warunek: cząsteczka musi być odróŜnialna od swojego obrazu lustrzanego, np.

prawo- i lewoskrętne helisy α;

- CD zaleŜy od oddziaływania zarówno pola magnetycznego jak i elektrycznego z cząsteczkami i od geometrii układu molekularnego

- CD – dobra metoda do określania struktury drugorzędowej białek, kwasów nukleinowych i wielocząsteczkowych kompleksów

- np. α-helisa: dodatnie pasmo @ 195 nm, ujemne pasma @ 210 i 220 nm, - β-kartka: dodatnie pasmo @ <200 nm, ujemne pasmo @ 215 nm.

Zniekształcanie absorbancji przez rozpraszanie

I₀ I I₀ I

A = log (I₀ / I) A ≠ log (I₀ / I)

- rozpraszanie jest tym większe im

- rozmiary cząsteczek zbliŜają się lub przekraczają długość fali światła - im krótsza jest długość fali światła

Wpływ rozpraszania na widmo absorpcji

Centra reakcji bakterii purpurowych A) wyizolowanych z błony, B) w błonach lipidowych

A) B)

małe obiekty – słabo rozpraszają duŜe obiekty – silnie rozpraszają

Pomiar absorpcji w próbkach rozpraszających

1) Fragmentacja próbek (np. ultradźwiękami)

2) Sfera całkująca – ścianki białe (lub wyłoŜone fotodiodami) – światło rozproszone nie „ucieka”, teŜ jest mierzone

3) Spektroskopia fotoakustyczna – do próbek bardzo mętnych lub nawet prawie nieprzepuszczalnych dla światła

- pomiar ciepła dysypowanego przez próbkę podczas jej powrotu ze stanu wzbudzonego do podstawowego (ciepło powoduje rozszerzenie płynu lub gazu otaczającego próbkę – to rozszerzenie jest rejestrowane przez

mikrofon) (Politechnika Poznańska)

Widma fluorescencji aminokwasów

Absorpcja

Fluorescencja w r-rze wodnym (w białkach „świeci” głównie tryptofan)

Pole pod krzywymi proporcjonalne do

wydajności kwantowej: W – 0,12; Y – 0,13;

F – 0,022

Green Fluorescent Protein (GFP)

"for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP"

The Nobel Prize in Chemistry 2008

Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien

- GFP silnie „świeci” w zakresie widzialnym i moŜe być genetycznie przyłączane do innych białek

GFP

Widma fluorescencji GFP i

podobnych białek

Spektrofluorymetr

2 typy widm:

- widma emisji: wzbudzenie dla jednej długości fali, pomiar fluorescencji – kolejno dla całego zakresu fal;

przesunięte w stronę fal dłuŜszych względem widm A i (1-T)

Wybór koloru światła wzbudzającego

Wybór koloru światła emitowanego

Widma absorpcji i fluorescencji –

przesunięcie Stokesa

Spektrofluorymetr

- widma emisji: wzbudzenie dla jednej długości fali, pomiar fluorescencji – kolejno dla całego zakresu fal;

przesunięte w stronę fal dłuŜszych względem widm A i (1-T)

-widma wzbudzenia: pomiar dla jednej długości fali, wzbudzanie – kolejno dla całego zakresu fal;

dla cząsteczek z jednym chromoforem widmo wzbudzenia przypomina kształtem widmo (1-T), T = I/I₀, 1-T = 1 - I/I₀ = (I₀ – I)/I₀

Pomiar widm fluorescencji wymaga korekty ze względu na widmo lampy i zaleŜność czułości miernika od długości fali światła

Wybór koloru światła wzbudzającego

Wybór koloru światła emitowanego

2 typy widm:

Widma emisji i wzbudzenia

λ A, Fl

A Fl

A, Fl

A Fl

λ

Wydajność fluorescencji

- odsetek wzbudzonych cząsteczek powracających do stanu podstawowego na drodze emisji fluorescencji

Procesy konkurujące z emisją fluorescencji

- wygaszanie przez inne cząsteczki (podczas zderzeń)

- przejście interkombinacyjne ze stanu singletowego do tripletowego - konwersja wewnętrzna

abs fl

Czasowo-rozdzielcze pomiary fluorescencji

τ – czas Ŝycia fluorescencji (średni czas jaki cząsteczka pozostaje w stanie

wzbudzonym)

k

k

k

k k

- natęŜnie fluorescencji, F(t), zanika w czasie (jedno- lub wielowykładniczo):

F(t) = F(0) exp(−t/τ) F(t) =ΣFi(0) exp(−t/τi)

[M*(t)] – stęŜenie cząsteczek wzbudzonych F(t) ~ [M *(t)]

dM*/dt = -kM (dM*/M)/dt = -k

k – prawdopodobieństwo, zaniku wzbudzenia w jednostce czasu

M*(t) = M*(0) exp(−kt/) M*(t) = M*(0) exp(−t/τ), τ = 1/k - wzbudzenie krótkim impulsem światła

fluorescencja

Techniki czasowo-rozdzielczych pomiarów fluorescencji

1) Zliczanie pojedynczych fotonów (demonstracja) 2) Metoda modulacyjna

3) Up-konwersja fluorescencji

Cel: wyznaczenie czasu (czasów) Ŝycia fluorescencji

Zliczanie pojedynczych fotonów

1) wzbudzenie b. słabymi impulsami światła – kaŜdy impuls światła

powoduje rejestrację tylko jednego fotonu;

2) mierzone są czasy od wzbudzenia do zarejstrowania fotonu

fluorescencji, a następnie liczone fotony, które wpadają do

odpowiednich kanałów czasowych 3) budowany jest histogram: liczba

zliczeń w funkcji nru kanału czasowego

4) 10⁵ zarejestrowanych fotonów – gładki histogram

5) Rozdzielczość czasowa ~10 ps Kanał czasowy

Liczba fotonów

F

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ...

Metoda modulacyjna

1) Wzbudzenie próbki światłem ciągłym o modulowanym sinusoidalnie natęŜeniu światła z częstotliwością ω

2) Fluorescencja oscyluje sinusoidalnie z tą samą częstotliwością ω, ale

amplituda i faza (φ) tych oscylacji względem oscylacji światła wzbudzającego zaleŜy od iloczynu ω i τ (czas Ŝycia fluorescencji)

3) Im dłuŜszy czas Ŝycia fluorescencji – tym większe przesunięcie fazowe, najlepiej gdy ω = 1/τ . τ wyznacza się ze znajomości ω i φ

4) Zaniki wieloeksponencjalne – kilka częstotliwości ω_i

wzbudzanie emisja fluorescencji

amplituda sygnału fluorescencji

przesunięcie fazowe

Metoda modulacyjna

1) Wzbudzenie próbki światłem ciągłym o modulowanym sinusoidalnie natęŜeniu światła z częstotliwością ω

2) Fluorescencja oscyluje sinusoidalnie z tą samą częstotliwością ω, ale

amplituda i faza (φ) tych oscylacji względem oscylacji światła wzbudzającego zaleŜy od iloczynu ω i τ (czas Ŝycia fluorescencji)

3) Im dłuŜszy czas Ŝycia fluorescencji – tym większe przesunięcie fazowe, najlepiej gdy ω = 1/τ . τ wyznacza się ze znajomości ω i φ

4) Zaniki wieloeksponencjalne – kilka częstotliwości ω_i

wzbudzanie emisja fluorescencji

amplituda sygnału fluorescencji

przesunięcie fazowe 5)Rozdzielczość

czasowa

~100 ps

Up-konwersja fluorescencji

1) Zasada uzyskiwania rozdzielczości czasowej (10^-14 s) i układ

eksperymentalny podobne jak w czasowo-rozdzielczych pomiarach typu pompa-sonda.

2) Światło fluorescencji jest ogniskowane na nieliniowym krysztale wraz krótkim impulsem swiatła próbkujacego

3) W momencie gdy światło fluorescencji dotrze do kryształu w tym samym

czasie co impuls światła

próbkujacego, kryształ emituje światło o nowej częstotliwości będącej sumą częstotliwości światła fluorescencji i światła próbkującego.

4) ZaleŜność natęŜenia fluorescencji od czasu – zmiana opóźnienia impulsu próbkującego względem impuslu pompującego

Laser

femtosekundowy

próbka kryształ

5) Rozdzielczość czasowa ~0.1 ps

impuls pompujący impuls próbkujący

fluor.

Anizotropia fluorescencji

- jeśli fluorescencja następuje z tego samego stanu, który został wzbudzony

(momenty przejścia absorpcji i fluorescencji są wzajemnie równoległe) i cząsteczka nie obraca się pomiędzy tymi dwoma zdarzeniami wówczas fluorescencja

spolaryzowana równolegle do wzbudzenia jest ok. 3 razy większa niŜ fluorescencja spolaryzowana prostopadle

- informacje o ruchach cząsteczek i przekazywaniu wzbudzenia innym cząsteczkom P1, P2 – polaryzatory

S - próbka

Spektroskopia podczerwieni

1) Klasycznie, częstotliwość (

) drgań dwuatomowej cząsteczki rośnie ze wzrostem stałej siłowej (k’) a maleje ze wzrostem masy

zredukowanej (m

, wstęp do biofizyki II):

ν ~ (k’/m_r)^1/2 m_r = m₁m₂/(m₁ + m₂)

2) Kwantowo-mechanicznie, dwuatomowa

cząsteczka ma serię jądrowych funkcji falowych, których energie są skwantowane (nie maja

dowlnych wartości) oddzielone między sobą o stałą (w przybliŜeniu) wartość.

RóŜnice te odpowiadają kwantom

promieniowania z zakresu podczerwieni.

m_r = <0.5m, m)

m – masa lŜejszego składnika E = ½ k’x² + ½ m_rv²

E ~ k’m_rA²

E-energia (o dowolnych wartościach) A-amplituda max.

x – wychylenie v - predkość

Cząsteczki wieloatomowe

Twisting Wagging

Rocking Scissoring

Antisymmetrical stretching Symmetrical

stretching

Ale!

- drgania nie dotyczą pojedynczych wiązań, lecz angaŜują całą cząsteczkę!

Jednak!

- często specyficzne drganie moŜe być głównie związane z pewną grupą atomów.

Mają wiele modów drgań;

kaŜdy z nich ma dyskretne poziomy energetyczne związane z drganiami

=> widmo absorpcji w IR moŜe być bardzo skomplikowane!

Widmo absorpcji IR - przykład

5.5 µm długość fali 7.7 µm

Widma IR (infrared) białek

Widma IR białek – 3 charakterysytyczne pasma absorpcji od grupy peptydowej 1) rozciąganie wiązania N-H, (3 280 - 3 300 cm⁻¹)

2) rozciąganie wiązania C=O (I pasmo amidowe, 1 620 –1 660 cm⁻¹)

3 ) wahania noŜycowe kąta C-N-H (II pasmo amidowe, 1 520 – 1 550 cm⁻¹),

Częstotliwości ww. pasm są róŜne dla α-helis i β-kartek
pomiary konformacji białek.

Pomiary stacjonarne (FTIR) i czasowo-rozdzielcze.

Spektroskopia Ramana

- podobnie jak spektroskopia IR pozwala obserwować przejścia

pomiędzy róŜnymi stanami jądrowymi (oscylacyjnymi) cząsteczki

podstawowy stan

elektronowy!

Spektrometry Ramana

- podobne do spektrofluorymetrów

Ale!

- waŜna jest wysoka rozdzielczość spektralna Dlatego

- wzbudzanie laserem o bardzo wąskim spektralnie pasmie wzbudzenia - dwa monochromatory w torze detekcji

Rezonansowa spektroskopia Ramana

- bardzo uŜyteczna w biofizyce molekularnej

- wzbudzenie światłem o długości fali pasującej do pasm absorpcji elektronowej

- korzyści:

1) zwiększenie siły rozpraszania ramanowskiego

2) duŜa selektywność: rozpraszanie tylko od chromoforów o

przejściu elektronowym pasującym do długości fali światła

Rezonansowa spektroskopia Ramana

wzbudzony stan

elektronowy!

podstawowy stan

elektronowy!