B ADANIA BEZPOŚREDNIEGO OZNACZANIA OKSYETYLENOWANYCH ALKOHOLI I TECHNIKĄ LC-MS/MS

Do bezpośredniego oznaczania oksyetylenowanych alkoholi zawierających od 2 do 9 grup oksyetylenowych w cząsteczce użyto kolumny TSK-Gel Amide, co stanowi nowość w dziedzinie rozdzielania tego typu związków. Pozwala ona na rozdzielenie homologów o takiej samej długości łańcucha węglowodorowego i o różnej ilości grup oksyetylenowych. Optymalizacja takich parametrów jak stężenie octanu amonu czy temperatury kolumny pozwoliły na lepszy rozdział, skrócenie czasu analizy i podwyższenie sygnałów analitycznych – podwyższenie czułości.

1.1.1. DOBÓR WARUNKÓW PRACY KOLUMNY

Celem tego etapu pracy było rozdzielenie oksyetylenowanych alkoholi C₁₂EO_2-9 na pojedyncze homologi oraz dobranie odpowiedniego stężenia octanu amonu, jako składnika mieszaniny wymywającej, oraz ustalenie temperatury pracy kolumny, tak, aby uzyskać jak najwyższy sygnał analityczny każdego oksyetylenowanego alkoholu.

W tym celu przeprowadzono szereg doświadczeń na mieszaninach wzorcowych, zmieniając stężenie octanu amonu w fazie ruchomej oraz temperaturę kolumny.

Uzyskane wyniki przedstawiono na rysunku 24.

Analiza wykresów rysunek 22 umożliwiła dobranie optymalnej fazy ruchomej oraz określenie temperatury pracy kolumny. Parametry te pozwoliły ‘’podnieść’’ czułość metody analitycznej.

Rysunek 22. Wpływ temperatury i stężenia octanu amonu w fazie ruchomej na intensywność pików chromatograficznych dla poszczególnych oksyetylenowanych alkoholi

Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że najmniejsze sygnały analityczne pochodzące od oksyetylenowanych alkoholi otrzymano dla 2 mM wodnego roztworu octanu amonu (rysunek 22). Ponadto dla oksyetylenowanego dodekanolu zawierającego dwie i trzy grupy oksyetylenowe wzrost temperatury w zakresie od 20°C do 40°C dla 2 mM roztworu octanu amonu nie powodował zmian pól powierzchni otrzymywanych pików. Z kolei dla C₁₂EO₅ wzrost temperatury spowodował zwiększenie

pola powierzchni piku. Dla pozostałych badanych alkoholi wymywanych z kolumny acetonitrylem i 2 mM wodnym roztworem octanu amonu nie pozwalał jednoznacznie określić wpływu temperatury na wielkość pola powierzchni piku.

Przebieg pozostałych krzywych (rysunek 22),- tj. dla stężenia wodnego roztworu octanu amonu wynoszącego odpowiednio 5, 10, 20 mM jest podobny dla wszystkich homologów oksyetylenowanych alkoholi. Wyjątek stanowi oksyetylenowany dodekanol zawierający trzy grupy oksyetylenowe, dla którego zbliżone wartości powierzchni piku otrzymano w zakresie temperatur 15-35°C dla stężeń octanu amonu wynoszących 5, 10 i 20 mM.

Dla pozostałych alkoholi C12EO2, oraz C12EO4-9, otrzymano najwyższe pola powierzchni piku w temperaturze 35°C dla fazy ruchomej, w której stężenie octanu amonu wynosiło 5 mM. Z tego względu w dalszych badaniach zastosowano mieszaninę 5 mM octanu amonu i acetonitryl, jako fazę ruchomą. Proces rozdzielania chromatograficznego prowadzono w temperaturze 35°C.

1.1.2. DOBÓR WARUNKÓW DETEKCJI

Zastosowanie octanu amonu jako jednego ze składników fazy ruchomej daje możliwość powstawania w źródle jonów zarówno protonowanych jak i amonowanych jonów pseudomolekularnych. Dlatego też kolejnym etapem pracy było porównanie sygnałów analitycznych uzyskanych dla par MRM poszczególnych składników mieszaniny, w których jako jon pseudomolekularny zastosowano jon protonowany lub amonowany. W tym celu przeprowadzono szereg równoległych analiz na mieszaninie wzorcowej o stężeniu każdego składnika wynoszącym 1 µg/mL. Podczas badań określono odpowiedź detektora dla protonowanych i amonowanych jonów pseudomolekularnych. Rysunek 23. przedstawia porównanie wysokości pików chromatograficznych, przejść protonowany/amonowany jon pseudomolekularny → jon fragmentacyjny oksyetylenowanych alkoholi (C12EOx; x=2-9).

Rysunek 23. Chromatogramy masowe par MRM oksyetylenowanych alkoholi o stężeniu 1 µg/mL dla jonów:protonowanych [M+H]⁺ i amonowanych[M+NH4]⁺

Analiza poszczególnych chromatogramów par MRM pozwala stwierdzić, że w przypadku C₁₂EO₄, C₁₂EO₅, amonowane jony pseudomolekularne pochodnych dają wyższą odpowiedź detektora w porównaniu z jonami protonowanymi. Odwrotna tendencja występuje natomiast w przypadku pochodnych homologów oksyetylenowanych alkoholi zawierających trzy, sześć, siedem, osiem i dziewięć grup etylenowych w cząsteczce. Dla C₁₂EO₂ uzyskano sygnał analityczny jedynie dla protonowanego jonu pseudomolekularnego (rysunek 23).

Dla zoptymalizowanych warunków pracy uzyskano chromatogram mieszaniny oksyetylenowanych alkoholi C₁₂EO_2-9, który zaprezentowano na rysunku 24.

Dodatkowo w celach potwierdzenia identyfikacji jednocześnie z chromatografem MRM zbierano widma fragmentacyjne badanych związków (rysunek 24).

1.1.3. ANALIZA JAKOŚCIOWO-ILOŚCIOWA

Dla zoptymalizowanych warunków rozdzielania chromatograficznego oraz pracy spektrometru masowego (rozdział 2.2.1.1. części doświadczalnej) wykonano szereg analiz mieszanin homologów C₁₂EO_x, gdzie x=2-9, w celu określenia parametrów służących do analizy jakościowo-ilościowej (otrzymany chromatogram umieszczono w załączniku I), tj. czasów retencji poszczególnych oksyetylenowanych alkoholi oraz ich widm fragmentacyjnych. Przykładowe chromatogramy oraz widma fragmentacyjne mieszaniny oksyetylenowanych alkoholi o stężeniu każdego składnika wynoszącym 1 µg/mL zaprezentowano na rysunku 24.

Rysunek 24. Chromatogramy masowe par MRM oraz widma fragmentacyjne oksyetylenowanych alkoholi: C12EO2, C12EO3, C12EO4, C12EO5, C12EO6, C12EO7, C12EO8, C12EO9 o stężeniu każdego 1 µg/mL

Uzyskane sygnały m/z obecne na tych widmach fragmentacyjnych wynikają z rozpadów typu A i B cząsteczek oksyetylenowanych alkoholi opisanych na rysunku 25. Fragmenty typu B są wynikiem rozpadu grupy oksyetylenowej, zaś typu A utraty kolejnych grup oksyetylenowych przez cząsteczkę oksyetylenowanego alkoholu.

Ponadto na widmach (rysunek 24) można zaobserwować serię sygnałów m/z wynikającą z fragmentacji łańcucha alkilowego (rysunek 25).

Rozpad typu A Rozpad typu B

X [m/z] X [m/z]

2 89 1 213

3 133 2 257

4 177 3 301

5 221 4 345

6 265 5 389

7 309 6 433

8 353 7 477

9 397 8 521

9 565

Rysunek 25. Jony obecne na widmach fragmentacyjnych oksyetylenowanych alkoholi C12EOX (x

= 2-9)

1.1.4. WALIDACJA METODY

Dla ustalonych warunków analizy chromatograficznej z detekcją masową ustalono liniowość oraz granice wykrywalności i oznaczalności dla homologów dodekanolu zawierających od 2 do 9 grup oksyetylenowych w cząsteczce. Sposób wyznaczania tych wielkości opisano w punkcie 4.3. i 4.4 części literaturowej. W tabeli 10 zebrano wyznaczone LOD, LOQ oraz zakres liniowości dla wszystkich oksyetylenowanych alkoholi.

Tabela 10. Granica wykrywalności i oznaczalności oraz zakres liniowości oksyetylenowanych

Opracowana metoda cechuje się szerokim zakresem liniowości sygnału analitycznego dla poszczególnych homologów, o czym świadczą wysokie wartości współczynników korelacji (tabela 10). Granice wykrywalności i oznaczalności wyznaczono na podstawie zależności opisanych w punkcie 4.3. i 4.4. części literaturowej.

1.2. B