S PEKTROMETRIA MAS

Dzięki szybkiemu rozwojowi technik spektrometrii mas, w tym opracowaniu nowych metod jonizacji próbki, technika ta umożliwia badanie związków polarnych, jak również skomplikowanych mieszanin związków z dużą czułością. Nowe metody spektrometrii mas wykorzystuje się w badaniu sekwencji kwasów nukleinowych, struktury i funkcji białek, kompleksów eterów, kompleksów białek [104].

3.3.2.2. BUDOWA APARATU

Spektrometr masowy niezależnie od konstrukcji i przeznaczenia jest urządzeniem mierzącym stosunek masy jonów do ładunku (m/z). Należy więc zwrócić szczególną uwagę przy interpretacji widm masowych, że zależność m/z nie zawsze musi być kojarzona z masą danego związku [105].

Spektrometr masowy składa się z kilku podstawowych elementów przedstawionych schematycznie na rysunku 6 [105].

Próbki do spektrometru można wprowadzać przy pomocy urządzeń do bezpośredniego wstrzykiwania np. strzykawkowe pompy dozujące, obecnie jednak coraz częściej stosuje się połączenie MS z różnymi typami chromatografów (chromatografu cieczowego, gazowego lub instrumentu do elektroforezy kapilarnej).

Rozwiązanie takie umożliwia przeprowadzenie analiz większej liczby składników [106].

Spektrometria mas umożliwia analizę jedynie zjonizowanych cząsteczek w fazie gazowej, dlatego funkcją źródła jonów jest przeprowadzenie analizowanych roztworów z niezjonizowanych postaci do stanu zjonizowanego. Do metod jonizacji zalicza się:

jonizację elektorami, chemiczną, pod ciśnieniem atmosferycznym i jonizację plazmą sprzężoną indukcyjnie. [105, 106], ESI, APCI.

Rysunek.

Analizatory służą do rozdziału czą ź

masy do ładunku. Istnieje wiele typów analizatorów dobieranych w zależ ś badań, należą do nich: analizator czasu przelotu, ruchliwoś

pułapka jonowa i analizator cyklotronowy

3.3.2.2.1. ELEKTROROZPY

Elektrorozpylanie (ang.

techniką jonizacji w badaniu materiałów pochodzenia biologicznego. Zasada działania (Rysunek 7) polega na wprowadzeniu cieczy do komory jonizacyjnej przez kapilarę

której przyłożone jest napię ę ń

(najczęściej azot). Na wylocie z kapilary odrywają ę

dostarczeniu kolejnej porcji podgrzanego gazu zmniejszają ą ę ść odparowanie rozpuszczalnika.

metanol, acetonitryl, woda i ich mieszaniny. Po przekroczeniu krytycznej wielkoś tracą stabilność i rozpadają

kumulację ładunku elektrycznego na ich powierzchni. Proces ten w konsekwencji prowadzi do powstania jonów, które są

powstałe przy użyciu techniki ESI mają

zastosowanie jej do oznaczania indywiduów chemicznych mają oddziaływania niekowalencyjne

Rejestracja i opracowanie danych (komputer)

Rysunek. 6. Schemat budowy spektrometru masowego [105]

do rozdziału cząsteczek powstałych w źródle jonów, w funkcji ich . Istnieje wiele typów analizatorów dobieranych w zależ ś

ń żą do nich: analizator czasu przelotu, ruchliwości jonów, kwadrupolowy, pułapka jonowa i analizator cyklotronowy [105, 106].

LEKTROROZPYLANIE

Elektrorozpylanie (ang. – Electrospray- ESI) jest najbardziej rozpowszechnioną ą jonizacji w badaniu materiałów pochodzenia biologicznego. Zasada działania

polega na wprowadzeniu cieczy do komory jonizacyjnej przez kapilarę żone jest napięcie rzędu kilku kV, na końcu której doprowadzony jest gaz ęściej azot). Na wylocie z kapilary odrywają się drobne kropelki, które po

ejnej porcji podgrzanego gazu zmniejszają swoją ę ść odparowanie rozpuszczalnika. Do najczęściej używanych rozpuszczalników należą metanol, acetonitryl, woda i ich mieszaniny. Po przekroczeniu krytycznej wielkoś

ą ść i rozpadają się, co powoduje zmniejszenie ich iloś ż ę ładunku elektrycznego na ich powierzchni. Proces ten w konsekwencji prowadzi do powstania jonów, które są dalej analizowane w spektrometrze mas. Jony życiu techniki ESI mają nadmiar energii wewnętrznej, co wpływa na zastosowanie jej do oznaczania indywiduów chemicznych mających w swojej budowie oddziaływania niekowalencyjne [104, 105, 107, 108].

Układ wprowadzania próbki . Istnieje wiele typów analizatorów dobieranych w zależności od celu

ń żą ści jonów, kwadrupolowy,

jest najbardziej rozpowszechnioną ą jonizacji w badaniu materiałów pochodzenia biologicznego. Zasada działania polega na wprowadzeniu cieczy do komory jonizacyjnej przez kapilarę, do

ż ę ę ńcu której doprowadzony jest gaz

ęś ą ę drobne kropelki, które po

ą swoją objętość, przez ęś żywanych rozpuszczalników należą:

metanol, acetonitryl, woda i ich mieszaniny. Po przekroczeniu krytycznej wielkości ę, co powoduje zmniejszenie ich ilości, jak również ę ładunku elektrycznego na ich powierzchni. Proces ten w konsekwencji ą dalej analizowane w spektrometrze mas. Jony ętrznej, co wpływa na ących w swojej budowie

Widma masowe ESI przedstawiają najczęściej serię pików odpowiadających kolejnym, protonowanym widmom atomowym, natomiast nie zawierają praktycznie pików powstałych na skutek dysocjacji i fragmentacji jonów [107].

Do otrzymywania widm ESI złożonych mieszanin należy połączyć spektrometr mas z chromatografią cieczową [107].

Rysunek 7. Schemat procesów zachodzących w źródle jonów [104, 108]

Do podstawowych zalet elektrorozpylania należą [105]:

⇒ jonizacja w warunkach ciśnienia atmosferycznego,

⇒ jonizacja bez fragmentacji,

⇒ otrzymywanie jonów wielokrotnie naładowanych.

3.3.2.2.2. ANALIZATOR KWADRUPOLOWY

Analizator kwadrupolowy zbudowany jest z czterech prętów, mających przekrój hiperboliczny. Jony poruszające się wzdłuż osi podlegają działaniu pola elektrycznego, składającego się z pola zmiennego nałożonego na pole stałe. Spowodowane to jest przyłożeniem do prętów odpowiednich potencjałów. Pary prętów działają jak filtry dla mas wyższych i niższych od masy wybranej, natomiast cząsteczka o wybranym stosunku m/z uzyskuje stabilną drogę lotu i przechodzi do detektora [105, 107]. Na rysunku 8 przedstawiono schemat analizatora kwadrupolowego.

Rysunek 8. Analizator kwadrupolowy [107]

Kwadrupole wykorzystuje się także w spektrometrach, gdzie używa się wielu szeregowo połączonych analizatorów. Rysunek 9 przedstawia schemat takiego analizatora. Potrójny kwadrupol składa się z dwóch analizatorów kwadrupolowych (Q1, Q3) rozdzielonych komorą kolizyjną (Q2). Jony, które są generowane przez źródło jonów trafiają do animatora Q1, w którym następuje „selekcja” dalej przepuszczane są tylko jony o wybranej wartości m/z. Następnie trafiają one do komory kolizyjnej (Q2), do której wprowadzane są cząsteczki gazu obojętnego, które po kolizji z jonami powodują ich rozpad. Fragmenty trafiają do analizatora Q3, gdzie są rozdzielane za względu na ich wartość m/z, co pozwala na zapisanie widma fragmentacyjnego [105, 107].

Rysunek 9. Schemat aparatu z tzw. „potrójnym kwadrupolem”. Pierwszy i środkowy są spektrometrami mas; środkowy jest komorą kolizyjną zbudowaną z kwadrupola [105]

Zaletami analizatora kwadrupolowego są [105]:

⇒ niewielkie wymiary,

⇒ możliwość szybkiego skanowania,

⇒ wysoka transmitancja,

⇒ relatywnie niska cena.

Kwadrupol ma dość wąski zakres pomiarowy, można go jednak poszerzyć przez połączenie ze źródłem jonów typu ESI. Wielokrotna jonizacja analizowanej substancji pozwala na analizę większych cząstek mimo ograniczonego zakresu mas [105].

3.3.2.3. ANALIZA ILOŚCIOWA I JAKOŚCIOWA W TANDEMOWEJ SPEKTROMETRII MAS Potrójny kwadrupol jest jedną z najpopularniejszych konfiguracji spektrometrów masowych. Może on zostać wykorzystany w kilku trybach, które pozwalają na analizę jakościową i ilościową substancji [105].

3.3.2.3.1. SKANOWANIE JONÓW POTOMNYCH

Tryb skanowania jonów potomnych (ang. – daughter product ion scan) polega na ustawieniu analizatora Q1 tak, aby przepuszczał jony o ustalonej wartości m/z i odczycie otrzymanych mas w analizatorze Q3 (komora kolizyjna jest wówczas pozbawiona dopływu gazu kolizyjnego [105].

3.3.2.3.2. SKANOWANIE JONÓW MACIERZYSTYCH

Skanowanie jonów macierzystych (ang. – parent scan) polega na takiej konfiguracji analizatora Q3, aby przepuszczał wyłącznie fragmenty o wybranej masie, wówczas analizator Q1 może skanować jony i wykryć wszystkie jony macierzyste, z których powstaje wybrany fragment. Taki tryb pracy przydatny jest w analizie i porównywaniu związków o zbliżonej strukturze dających takie same fragmenty [105].

3.3.2.3.3. MONITOROWANIE WIELU REAKCJI

Monitorowanie wielu reakcji (ang. – Multiple Reaction Monitoring - MRM) polega na ustawieniu analizatorów Q1 i Q3 na transmisję wybranych mas. Do detektora docierają wówczas wyłącznie jony fragmentacyjne o wybranej wartości m/z powstałe z konkretnego prekursora. Przebieg chromatogramu MRM dla wybranej pary prekursor – fragment jest odzwierciedleniem rzeczywistego zachowania się obserwowanego składnika na kolumnie chromatograficznej. Tryb MRM pozwala na weryfikację i właściwą identyfikację analizowanej cząsteczki (w analizach prowadzonych dla sądownictwa tryb MRM przy obecności jonu macierzystego i jednego lub dwóch jonów potomnych jest wymagany do jednoznacznej identyfikacji analitu) Tryb tenpozwala również na analizę ilościową analitów. [105].

3.3.2.4. ZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ DO OZNACZANIA ZWIĄZKÓW POWIERZCHNIOWO CZYNNYCH

Wysokosprawna chromatografia cieczowa jest obecnie najczęściej używaną techniką do rozdziału i analizy mieszanin surfaktantów w próbkach środowiskowych, głównie z powodu możliwości analizy związków w dużym zakresie mas bez konieczności wcześniejszej derywatyzacji. Kolumny do odwróconej fazy głównie RP-18 [59, 66, 77] i RP-8 [42, 65], są często używane do rozdzielania anionowych i niejonowych związków powierzchniowo czynnych według długości łańcucha alkilowego. Fazą ruchomą są zazwyczaj mieszaniny zawierające wodę, acetonitryl i metanol. Rozdzielczość można poprawić przez dodatek np. octanu amonu, kwasu octowego, kwasu mrówkowego) [41, 51, 68]. Kilka prac ukazuje doskonały rozdział oksyetylenowanych nonylofenoli i ich metabolitów [109] na kolumnach amino krzemionkowych lub cyjanowych w normalnym układzie faz, gdze rozdział dokonywany jest według długości części hydrofilowej. Elucja składników jest wówczas odwrócona (hydrofobowe związki takie jak nanylofenole eluują na początku, natomiast oksyetylenowane nonylofenole na końcu) w tym przypadku preferowane są niepolarne rozpuszczalniki (np. heksan, chloroform czy izopropanol).

Zespół Lee Fergusona [56, 110] przetestował kolumnę pakowaną polimerem C8 przeznaczoną do rozdziału oksyetylenowanych surfaktantów (oksyetylenowanych nonylofenoli i nonylofenoli) przy zastosowaniu odwróconego układu faz. Inni badacze także zastosowani tą technikę do oznaczania oktynofenoli i oksyetylenowanych oktylofenoli w próbkach środowiskowych [57]. Do rozdziału kationowych i niejonowych związków powierzchniowo czynnych zastosowano również wypełnienie zawierające grupy hydrofobowe (łańcuch węglowy) i hydrofilowe grupy funkcyjne (amidowe) [111].

Alkilo sulfoniany i oksyetylenwoane nonylofenole) i ich metabolity są odpowiednimi związkami do zastosowania techniki HPLC połączonej z detektorem UV lub fluorescencyjnym. Powodem tego jest występowanie w ich strukturze pierścienia aromatycznego umożliwiającego detekcję wyżej wymienionymi detektorami [112, 113, 109, 114, 115].

Chromatografia cieczowa połączona z detektorem fluorescencyjnym została użyta jako narzędzie do rozdzielenia izomerów i układu łańcucha alkilowego w alkilosulfonianach w próbkach wody rzecznej [116]. Oksyetylenowane alkohole i oksyetylenowane alkilosulfoniany nie mogą zostać bezpośrednio oznaczone z wykorzystaniem detektora UV ze względu na brak grupy aromatycznej, dopiero po przeprowadzeniu reakcji derywatyzacji z izocyjanianem fenylu [117], izocyjanianem naftylu lub chlorkiem naftylu [50, 118], możliwa jest ich detekcja UV.

Obecnie narzędziem najczęściej używanym do oznaczania oksyetylenowanych alkoholi i oksyetylenowanych alkilosulfonianów, jak również oksyetylenowanych nonylofenoli jest wysokosprawna chromatografia cieczowa połączona z detektorem MS. Detektor ten ma wiele zalet w porównaniu z innymi detektorami np. większa czułość, rozdzielczość. Pozwala na identyfikację wielu grup analitów przez pomiar m/z i czas retencji. Przez ostatnie dziesięć lat nastąpił postęp w analizach środowiskowych surfaktantów, przyczynił się do tego rozwój technik jonizacji: jonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym (ang. Atmospheric Pressure Ionization - APCI) czy elektrorozpraszanie (ang. Electrospray Ionization - ESI), które umożliwiły połączenie HPLC z MS. Wcześniej spektrometria mas służyła tylko do identyfikacji szerokiej gamy związków powierzchniowo czynnych [119, 120].

Mimo różnych typów analizatorów mas używanych do identyfikacji i ilościowego oznaczania surfaktantów, często stosowany jest pojedynczy kwadrupol. Pozwala on na wykorzystanie oznaczeń ilościowych przy zastosowaniu trybu pracy zwanego śledzeniem wybranego jonu (ang. Selected Ion Monitoring - SIM) [49, 60], niestety ten sposób aktywizacji nie jest selektywny i wystarczająco czuły. Wszystkie interferencje powstające podczas analizy mogą zostać wyeliminowane poprzez zastosowanie potrójnego kwadrupola [70, 77, 121] lub pułapki jonowej [59, 64]. W ostatnich latach obie techniki były wykorzystywane, w szczególności pierwsza okazała się doskonałym narzędziem do analizy surfaktantów i innych organicznych związków ze względu na możliwości skanowania jonów potomnych podwyższających czułość i selektywność [68], czyli pracę w trybie zwanym monitorowanie wielu reakcji.

Oksyetylenowane alkohole i oksyetylnowane nonylofenole nie posiadają grupy kwasowej czy zasadowej w cząsteczce, w większości przypadków jonizowana jest grupa oksyetylenowa w łańcuchu oksyetylenowym [122]. Aby poprawić jonizację jako dodatek do fazy ruchomej dodaje się: octan sodu [56, 123], octan amonu [51, 124, 120]

lub inne kwasy organiczne [53]. Dodatki te powodują pojawienie się w widmach masowych poza protonowanym jonem [M+H]⁺ pseudomolekularnych jonów takich jak:

[M+Na]⁺, [M+NH4]⁺ [63]. Przy zastosowaniu detektora MS możliwe jest analizowanie różnych typów surfaktantów podczas jednej analizy (np. oksyetylenowane nonylofenole i oksyetylenowane alkohole można rozdzielić i oznaczyć przy użyciu odpowiedniego gradientu [53, 122]. Ostatnie badania pokazują że możliwe jest ilościowe oznaczanie anionowych i niejonowych surfaktantów i ich metabolitów w próbkach środowiskowych [59, 60].