B ADANIA OZNACZANIA OKSYETYLENOWANYCH ALKOHOLI I POLI ( ETYLENOWANYCH GLIKOLI ) TECHNIKĄ LC-MS/MS

ZZASTOSOWANIEM DERYWATYZACJI ANALITÓW 1.2.1. DOBÓR FAZY RUCHOMEJ

W celu rozdzielenia mieszaniny pochodnych C₁₂EO_1-9, wolnego alkoholu oraz pochodnych poli(glikoli etylenowanych) zawierających od jednej do pięciu grup oksyetylenowych w cząsteczce wybrano fazę C18 jako wypełnienie kolumny chromatograficznej. Dla tej kolumny przebadano stopień rozdzielenia mieszaniny przy zastosowaniu dwóch eluentów: metanol/octan amonu i metanol/kwas mrówkowy.

Zadowalające rozdzielenie mieszaniny uzyskano stosując obie fazy ruchome (rysunek 26 i 27). Ze względu na intensywność sygnałów analitycznych (wysokość pików) do dalszych badań zdecydowano się zastosować fazę metanol/octan amonu.

Szczegółowy opis warunków rozdzielenia i detekcji dla tego eluentu zamieszczono w punkcie: 2.2.2.1.1. i 2.2.2.2. części doświadczalnej.

Rysunek 26. Chromatogramy par MRM pochodnych oksyetylenowanych alkoholi C12OH i C12EOX (x=1-9) uzyskane dla 5 mM octanu amon i 10 mM kwasu mrówkowego

Rysunek 27. Chromatogramy masowe par MRM pochodnych glikoli etylenowych EG + 2 PIC – EG5 + 2 PIC wykonane przy użyciu 5 mM octanu amonu i 10 mM kwasu mrówkowego

1.2.2. DOBÓR WARUNKÓW DETEKCJI

Zastosowanie octanu amonu jako jednego ze składników fazy ruchomej daje możliwość powstawania w źródle jonów zarówno protonowanych jak i amonowanych jonów pseudomolekularnych. Dlatego też kolejnym etapem pracy było porównanie sygnałów analitycznych uzyskanych dla par MRM poszczególnych składników mieszaniny, w których jako jon pseudomolekularny zastosowano jon protonowany lub amonowany. W tym celu przeprowadzono szereg równoległych analiz na mieszaninie wzorcowej o stężeniu każdego składnika wynoszącym 1 µg/mL. Podczas badań określono odpowiedź detektora dla protonowanych i amonowanych jonów pseudomolekularnych. Rysunek 28. przedstawia porównanie wysokości pików

chromatograficznych, przejść protonowany/amonowany jon pseudomolekularny → jon fragmentacyjny oksyetylenowanych alkoholi (C₁₂EO_x; x=1-9).

Rysunek 28. Chromatogramy masowe par MRM oksyetylenowanych alkoholi o stężeniu 1 µg/mL dla jonów:protonowanych [M+H]⁺ i amonowanych[M+NH4]⁺

Analiza poszczególnych chromatogramów par MRM pozwala stwierdzić, że w przypadku C₁₂EO₄, C₁₂EO₆, C₁₂EO₇ amonowane jony pseudomolekularne pochodnych dają wyższą odpowiedź detektora w porównaniu z jonami protonowanymi.

Odwrotna tendencja występuje natomiast w przypadku pochodnych homologów oksyetylenowanych alkoholi zawierających dwie, trzy, pięć, osiem i dziewięć grup etylenowych w cząsteczce. Dla pochodnej wolnego alkoholu i C₁₂EO₁ uzyskano sygnał analityczny jedynie dla protonowanego jonu pseudomolekularnego (rysunek 28).

1.2.3. ANALIZA JAKOŚCIOWO-ILOŚCIOWA OKSYETYLENOWANYCH ALKOHOLI

Uwzględniając powyższe wyniki w dalszych pracach zastosowano protonowane jony pseudomolekularne dla C₁₂OH, C₁₂EO_1-3 oraz C₁₂EO₈ i C₁₂EO₉, zaś amonowane jony pseudomolekularne dla C₁₂EO_4-7. Szczegółowy opis warunków detekcji zamieszczono w punkcie 2.2.2.2 części doświadczalnej. Na rysunkach 29 i 30 poza pikami chromatograficznymi charakterystycznymi dla przejść jon pseudomolekularny → jon fragmentacyjny zamieszczono widma fragmentacyjne pochodnych oksyetylenowanych alkoholi zawierających w cząsteczce od 1 do 9 grup oksyetylenowych oraz wolnego alkoholu

Rysunek 29. Chromatogramy par MRM oraz widma fragmentacyjne oksyetylenowanych alkoholi dla jonów protonowanych [M+H]⁺(stężenie każdego składnika 2 µg/mL)

Rysunek 30. Chromatogramy par MRM oraz widma fragmentacyjne oksyetylenowanych alkoholi dla jonów amonowanych [M+NH4]⁺(stężenie każdego składnika 2 µg/mL)

Widma fragmentacyjne jonów amonowanych różnią się od widm jonów protonowanych jednym dodatkowym fragmentem, tj. powstaniem jonu protonowanego.

Najintensywniejsze sygnały widoczne na widmach fragmentacyjnych pochodzą od protonowanego jonu pochodnych PIC oksyetylenowanych alkoholi [M+H]⁺, np.

(rysunek 29) dla C12EO5 – m/z=526; zaś kolejne intensywne sygnały powstały przez utratę fragmentu A lub B (rysunek 31), czyli w wyniku odczepienia grupy izocyjanianu fenylu (A) lub utraty kolejnych grup etylenowych z cząsteczki oksyetylenowanych alkoholi – izocyjanian fenylu (B). Występujący na każdym z widm z rysunku 29 i 30.

sygnał o wartości m/z=164 powstaje w wyniku utraty fragmentu cząsteczki izocyjanianu fenylu –OCH₂CH₂–, np. dla C₁₂EO₅ jest to przejście m/z 526→164 (utrata cząstki o m/z=362). Natomiast powtarzający się sygnał o m/z=77, pochodzi z rozpadu pierścienia benzenowego, a sygnał o m/z=45 od grup oksyetylenowych w postaci HOCH2CH2O^•.

Rysunek 31. Jony obecne na widmach fragmentacyjnych pochodnych PIC oksyetylenowanych alkoholi C₁₂OH i C₁₂EO_x (x=1-9)

1.2.4. ANALIZA JAKOŚCIOWO-ILOŚCIOWA POLI(GLIKOLI ETYLENOWYCH)

W celu oznaczenia glikolu etylenowego i rozdzieleniu poli(etylenowanych glikoli) zawierających w cząsteczce 2 do 5 grup oksyetylenowych przy wykorzystaniu kolumny C18 niezbędny jest etap przeprowadzenia w pochodne w reakcji derywatyzacji z izocyjanianem fenylu. Dodatkowo oznaczanie wraz z oksyetyenowanymi alkoholami pozwala na śledzenie zarówno ubytku stężenia AE, jak również śledzenie zmian stężenia metabolitów biodegradacji (PEG) podczas jednej analizy chromatograficznej.

Dla zoptymalizowanych warunków rozdzielenia chromatograficznego oraz pracy spektrometru masowego wykonano szereg analiz mieszanin pochodnych homologów glikoli etylenowych zawierających od jednej do pięciu grup etylenowych w cząsteczce.

Analizy miały na celu wyznaczenie parametrów służących do analizy jakościowo – ilościowej (otrzymany chromatogram umieszczono w załączniku II), tj. czasów retencji poszczególnych pochodnych poli(glikoli etylenowych) oraz widma fragmentacyjne homologów o stężeniu 1 µg/mL każdego składnika (rysunek 32).

Rysunek 32. Chromatogramy masowe par MRM oraz widma fragmentacyjne pochodnych PIC glikoli etylenowych o stężeniu 1 µg/mL

Najintensywniejsze sygnały widoczne na widmach fragmentacyjnych pochodzą od protonowanego jonu pochodnych PIC glikoli etylenowych [M+H]⁺, np. dla EG₅ + 2 PIC–

m/z=478; zaś kolejne intensywne sygnały powstały przez utratę fragmentu A lub B (rysunek 33), czyli w wyniku odczepienia jednej z grup izocyjanianu fenylu (A) lub utraty kolejnych grup etylenowych z cząsteczki pochodnej glikolu etylenowego – z izocyjanianem fenylu (B). Występujący w każdym z widm z rysunek 32. sygnał o wartości m/z=164 powstaje w wyniku utraty fragmentu cząsteczki izocyjanian fenylu – OCH₂CH₂ -, np. dla EG₂ jest to przejście m/z 345→164 (utrata cząstki o m/z=181).

Powtarzające się sygnały o wartościach m/z=77, m/z=71 i m/z=65 pochodzą z rozpadu

pierścienia benzenowego, a sygnał o m/z=45 pochodzi od grup oksyetylenowych w postaci HCOCH2CH2O^•.

Rysunek 33. Jony obecne na widmach fragmentacyjnych pochodnych PIC glikoli etylenowych EG +2 PIC – EG5 + PIC

1.2.5. DOBÓR WARUNKÓW DERYWATYZACJI

Etap ten miał na celu wyznaczenie optymalnych warunków reakcji przekształcenia w pochodne homologów oksyetylenowanych alkoholi i glikoli etylenowych z izocyjanianem fenylu, które pozwolą na otrzymanie sygnału analitycznego wolnego alkoholu oraz oksyetylenowanych alkoholi zawierających w cząsteczce od 1 do 9 grup oksyetylenowych oraz glikolu etylenowego i poli(glikoli etylenowych) zawierających od 2 do 5 grup etylenowych. Optymalizowanymi czynnikami były: temperatura, czas reakcji derywatyzacji oraz ilość izocyjanianu fenylu (środka derywatyzującego). W tym celu przeprowadzono szereg doświadczeń na mieszaninach wzorcowych, zmieniając czas reakcji, temperaturę reakcji i na końcu ilość dodawanego PIC. Uzyskane wyniki przedstawiono na rysunkach 34 – 36.

1.2.5.1. WPŁYW CZASU REAKCJI DERYWATYZACJI

Na podstawie otrzymanych wyników (rysunek 34) stwierdzono, że dla alkoholu C₁₂OH najwyższy sygnał analityczny otrzymano przy czasie 30 min, natomiast dla oksyetylenowanych alkoholi C₁₂EO₁ i C₁₂EO₈ było to 50 min. Dla glikolu etylenowego EG + 2 PIC najwyższy sygnał analityczny otrzymano przy czasie 60 min, dla EG₂ + 2 PIC – 20 min, natomiast dla glikoli etylenowych EG₃ + 2 PIC – EG₅ + 2 PIC było to 10 min. Zaobserwowano, że wydłużenie czasu reakcji nie powodowało znacznego wzrostu sygnału analitycznego, wyjątek stanowi oksyetylenowany alkohol zawierający osiem grup oksyetylenowych w cząsteczce i glikol dietylenowy (EG₂ + 2 PIC). Dokonano uśrednienia uzyskanych czasów reakcji derywatyzacji i stąd w dalszych badaniach zastosowano jako najbardziej optymalny dla całej grupy badanych związków czas 30 min.

Rysunek 34. Wpływ czasu reakcji derywatyzacji na pole powierzchni piku dla pochodnych homologów oksyetylenowanych alkoholi i glikoli etylenowych

1.2.5.2. WPŁYW TEMPERATURY REAKCJI DERYWATYZACJI

Dla alkoholi C₁₂EO_x (x=1-9) wzrost temperatury nie powodował wzrostu odpowiedzi detektora. W całym zakresie badanych temperatur dla tych związków sygnały kształtują się na jednakowym poziomie (rysunek. 35). Zaobserwowano również, że w przypadku oksyetylenowanych alkoholi zawierających w cząsteczce 6, 8 i 9 grup oksyetylenowych wraz ze wzrostem temperatury powyżej 70^⁰C sygnał analityczny znacząco maleje (rysunek 35). Dla tetraetylenowego i pentaetylenowego glikolu wzrost temperatury nie powodował wzrostu odpowiedzi detektora. W całym zakresie badanych temperatur dla tych związków sygnały kształtują się na jednakowym poziomie (rysunek 35). Zaobserwowano również, że w przypadku glikoli od EG do EG3

wraz ze wzrostem temperatury powyżej 70^⁰C sygnał analityczny znacząco maleje (rysunek 35). Z tych powodów jako najbardziej optymalną przyjęto temperaturę 70^⁰C.

Rysunek 35. Wpływ temperatury reakcji derywatyzacji na pole powierzchni piku dla pochodnych homologów oksyetylenowanych alkoholi i glikoli etylenowych

1.2.5.3. WPŁYW ILOŚCI ŚRODKA DERYWATYZUJĄCEGO

Po zoptymalizowaniu czasu i temperatury prowadzenia przekształcania analitów w pochodne, sprawdzono jaki wpływ na ten proces ma ilość czynnika derywatyzującego. W tym celu przeprowadzono proces bez nadmiaru PIC z 25 , 50 i 100 procentowym nadmiarem. Na podstawie otrzymanych sygnałów analitycznych stwierdzono że, nadmiar czynnika derywatyzującego dla wszystkich badanych homologów nie ma wpływu na odpowiedź detektora (rysunek 36). 100% nadmiar powoduje, we wszystkich przypadkach niewielkie obniżenie sygnału analitycznego.

Z tego względu do dalszych badań stosowano 50% nadmiar PIC jako optymalny.

Rysunek 36. Wpływ nadmiaru środka derywatyzującego na pole powierzchni piku dla pochodnych homologów oksyetylenowanych alkoholi i poli(glikoli etylenowych)

Zoptymalizowanie parametrów takich jak czas, temperatura i dodatek środka derywatyzującego pozwoliło podnieść czułość metody analitycznej.

Podsumowując, w dalszych pracach badawczych proces derywatyzacji prowadzono w 70^⁰C, przez okres 30 min z 50% nadmiarem środka derywatyzującego dla jednoczesnego oznaczania oksyetylenowanych alkoholi i poli(etylenowanych glikoli).

1.2.6. WALIDACJA METODY ANALITYCZNEJ

Dla opracowanej metody oznaczania pochodnych oksyetylnowanych alkoholi i wolnego alkoholu oraz poli(etylenowanych glikoli) wyznaczono zakres liniowości oraz granice wykrywalności i oznaczalności Sposób wyznaczenia tych wielkości opisano w punkcie 4.2 i 4.3 części literaturowej. W tabeli 11 oraz w załączniku III zebrano

wyznaczone LOD i LOQ oraz zakres liniowości dla wszystkich pochodnych oksyetylenowanych alkoholi i glikoli etylenowych.

Tabela 11. Granica wykrywalności i oznaczalności oraz zakres liniowości dla pochodnych homologów oksyetylenowanych alkoholi i poli(glikoli etylenowych)

Związek

Opracowana metoda cechuje się szerokim zakresem liniowości sygnału analitycznego dla pochodnych homologów, o czym świadczą wysokie wartości współczynników korelacji (tabela 11). Dla pochodnych protonowanych: C₁₂EOH PIC, C₁₂EO₁ PIC, C₁₂EO₃ PIC, C₁₂EO₅ PIC, dla EG + 2 PIC i EG₄ + 2PIC wyznaczono dwa zakresy liniowości w badanym przedziale stężeń. W przypadku pochodnych amonowanych oksyetylenowanych alkoholi tylko C12EO3 PIC i C12EO9 PIC wyznaczono jeden zakres liniowości.

1.3. B