Z AKRES PRAC PRZYGOTOWAWCZYCH DO TESTÓW BIODEGRADACYJNYCH Testy biodegradacyjne przeprowadzono dla wybranych szczepów bakterii

wyizolowanych z wody rzecznej w warunkach jałowych. Konieczne było zachowanie odpowiednich procedur przy przygotowaniu szkła laboratoryjnego oraz pożywek używanych w doświadczeniach, co opisano poniżej.

5.1. P

Wodę destylowaną poddawano dejonizacji w aparacie kwarcowym uzyskując wodę o oporności 18,2Ω i pH=7, zawierającą średnio 1 kulturę bakterii w 1 mL.

5.2. P

Szkło laboratoryjne używane podczas badań poddano jałowieniu w autoklawie w temperaturze 121°C przez 30 min Wszystkie badania przeprowadzono po wyjałowieniu otoczenia przy użyciu lampy UV (przez 30 min) przed każdym badaniem.

5.3. P

W 1000 mL wody dejonizowanej rozpuszczono 30 g podłoża (agaru wzbogaconego) biochemicznego i 20 g bezwodnej glukozy. Roztwór ogrzewano i mieszano do momentu powstania jednorodnej mieszaniny. Następnie korygowano pH do wartości 6,8 - 7,2 (20% roztworem wodorotlenku sodu. Otrzymane podłoże poddano sterylizacji w autoklawie pod ciśnieniem 1,2 atm. W temperaturze 121⁰C przez 20 min. Agar rozlano na wyjałowione płytki Petriego. W celu sprawdzenia sterylności pożywki płytki umieszczono w cieplarce na 24 godziny.

5.4. P

Wzbogaconą pożywkę o składzie wymienionym w tabeli 8 poddano jałowieniu w autoklawie pod ciśnieniem 1,2 atm w temperaturze 121°C w czasie 20 min.

Tabela 8. Skład wzbogaconej pożywki wg. Schöberla do wzrostu bakterii

Składnik Stężenie [mg/L]

Do każdego testu biodegradacyjnego sporządzono 500 mL roztworu inkubacyjnego (wzbogaconej pożywki według Schöberla [143, 144] tabela 8), który podzielono na trzy kolby w następujących proporcjach: 5 mL, 45 mL i 450 mL. Do pierwszej kolby wprowadzono bakterie wcześniej namnożone na płytkach agarowych. Tak przygotowany roztwór inkubowano w cieplarce w temperaturze 30°C przez 24 godziny w kolbie zamkniętej korkiem z bawełnianej włókniny (waty). Po upływie 24 godzin roztwór wyciągnięto z cieplarki i w warunkach jałowych przelano do kolby zawierającej 45 mL roztworu inkubacyjnego i inkubowano przez kolejne 24 godziny. Analogicznie po upływie 24 godzin przelano roztwór do kolby zawierającej 450 mL roztworu i inkubowano przez następne 24 godziny. Po upływie 72 godzin (3 x 24 h) roztwór bakteryjny użyto do testów biodegradacyjnych.

5.5. P

Pożywkę mineralną o składzie przedstawionym w tabeli 9 poddano jałowieniu w autoklawie pod ciśnieniem 1,2 atm. i w temperaturze 121°C przez 30 min.

Tabela 9. Skład pożywki mineralnej

5.6. W

W eksperymentach: zarówno w testach biodegradacyjnych wykorzystujących wodę rzeczną jako naturalną zaszczepkę mikroorganizmów jak również jako medium, z którego izolowano bakterie wykorzystano wodę rzeczną pochodzącą z rzeki Warty.

Warta jest trzecią co do wielkości rzeką w Polsce (po Odrze i Wiśle); największym prawobrzeżnym dopływem Odry o długości 808,2 km, z czego aż 369 km przypada na

teren województwa Wielkopolskiego. Największe dopływy to Noteć, Prosna, Drawa, Obra, Gwda, Ner i Wełna (rysunek 18). Źródłem zasilania powierzchniowego są przede wszystkim opady atmosferyczne i roztopy śnieżne.

Rysunek 18. Bieg rzeki Warty

Woda rzeczna jest bardzo niestabilną zaszczepką bakteryjną, gdyż skład gatunkowy mikroorganizmów jest zależny m.in. od pory roku oraz panujących chwilowych warunków atmosferycznych. Z drugiej strony jest najlepszym przykładem jak mikroorganizmy bytujące w środowisku naturalnym zdolne są do biodegradacji związków powierzchniowo czynnych, gdyż wody powierzchniowe są bezpośrednim odbiornikiem surfaktantów, tylko część ścieków komunalnych trafia do czyszczalni ścieków.

Mikroorganizmy w naturalny sposób przystosowują się do wykorzystania związków powierzchniowo czynnych jako źródła węgla i energii.

Monitoring prowadzony w latach 2007 – 2010 przez Wojewódzki Inspektorat Ochrony Środowiska w Poznaniu wskazuje na znaczne zanieczyszczenie wód rzeki Warty.

Czystość wód powierzchniowych zależy od wielu czynników wpływających w sposób bezpośredni, np. pobór wody, zrzuty ścieków, wprowadzenie zanieczyszczeń z wodami jej dopływów, jak również pośrednio: użytkowanie terenu, działalność gospodarczą, turystykę i rekreację na terenie zlewni.

Badania prowadzone przez Łukaszewskiego, i współpracowników w okresie 1990 – 2000 potwierdzają, że w rzece Warcie obecne są zarówno anionowe jak i niejonowe surfaktanty. Comiesięczne pomiary wykazują widoczną tendencję do wyższych stężeń w okresie jesień-zima (październik- marzec) niż w sezonie wiosna-lato (kwiecień-wrzesień) (rysunek 18). Badania wskazują na wyraźny wzrost stężenia (z upływem czasu) niejonowych surfaktantów w wodach rzeki Warty (od 25 µg/L do 150 µg/L) [84].

Dziesięć lat monitorowania stężenia surfaktantów w rzece pozwoliło wyciągnąć następujące wnioski: stopień biodegradacji zależy od temperatury wody i warunków życia mikroorganizmów odpowiedzialnych za degradację tych związków. Tendencje pokazane na rysunku 19 odzwierciedlają długoterminowe zmiany w wykorzystaniu związków powierzchniowo czynnych, jak również w produkcji tych związków [84].

Rysunek 19. Stężenie niejonowych surfaktantów w rzece Warcie w Poznaniu (średnie wartości dla A – okresu jesień-zima, B - okresu wiosna-lato) [84]

5.7. I

Izolacji zaszczepek bakteryjnych dokonano z wody rzecznej pobranej w Poznaniu (Most Świętego Rocha – rysunek 20) w styczniu 2011 roku.

Rysunek 20. Punkt pomiarowo-kontrolnym na Moście św. Rocha w Poznaniu

Po poborze wody dokonano zagęszczenia kultur bakterii przez sączenie pod ciśnieniem, 100 mL wody przez filtr mikrobiologiczny o średnicy porów 0,2 µm. Po tym etapie filtr inkubowano na płytce z podłożem agarowym przez 24 godziny w temperaturze 30˚C. Po tym czasie inkubacji otrzymane kultury przeniesiono do probówek i w ten sposób otrzymano czyste kultury bakterii metoda Lisnera.

Metoda Lisnera polega na stopniowym rozcieńczaniu materiału wyjściowego, z którego ma być wyizolowana czysta kultura, tak długo aż w 1 mL ostatniego rozcieńczenia znajdować się będzie jedna komórka. Objętość tą przenosi się na podłoże stałe w celu namnożenia drobnoustrojów [145].

Dla porównania do inkubacji poddano również 1 mL wody rzecznej (pomijając proces filtracji przez filtr mikrobiologiczny). Mnogość i różnorodność koloni, które widać na zdjęciu (rysunek 21) potwierdza jak bogata w kultury bakterii jest woda rzeczna.

Rysunek 21. Zdjęcie płytki z pożywką agarową po 24 inkubacji (30°C) 1 mL wody rzecznej Po całym procesie otrzymano 3 czyste kultury, które następnie zidentyfikowano (sekwencjonowanie i identyfikacja na podstawie drzewa filogenetycznego przeprowadzona w katedrze Biochemii, Uniwersytetu Śląskiego).

5.7.1. CHARAKTERYSTYKA SZCZEPU BAKTERYJNEGO UŻYTEGO DO BADAŃ

Szczepem wytypowanym do dalszych badań (na podstawie wstępnych badań biodegradacyjnych) był szczep Enterobacter sp. strain Z3.

Pałeczki rodzaju Enterobacter zaliczane są do rodziny Gram ujemnych Enterobacteriaceae. Bakterie z tej rodziny mogą tworzyć otoczki i mikrootoczki.

Posiadają rzęski, dzięki czemu są ruchome. Nie posiadają zdolności do wytwarzania przetrwalników. Żyją w warunkach tlenowych i beztlenowych. Posiadają metabolizm tlenowy oraz beztlenowy, są chemoorganotrofami (wykorzystują związki organiczne jako źródło węgla i energii). Bakterie te fermentują glukozę oraz inne węglowodany i alkohole [146].

Gram ujemne pałeczki rodzaju Enterobacter powszechnie występują w przyrodzie.

Miejsca ich bytowania to: woda, ścieki, gleba, a także przewód pokarmowy ludzi i zwierząt [147] . Enterobacter sp. występują w wodach tylko okresowo i ich obecność nie jest pożądana. Należą do mikroflory naniesionej, której źródłem może być gleba, bądź ścieki. Stanowią one zagrożenie sanitarno – higieniczne. Ich źródłem w dużej mierze są ścieki komunalne. Podstawowy wskaźnik mikrobiologiczny w ocenie czystości wód to miano coli typu fekalnego. Do grupy coli typu fekalnego zaliczane są bakterie z rodziny Enterobacteriaceae w tym Enterobacter sp. [146, 148].

Skażona woda stanowi ryzyko zachorowania. Kąpiel w takiej wodzie, spożywanie bądź zastosowanie do celów spożywczych niesie ze sobą ryzyko. Bakterie Enterobacter spp. mogą wywoływać zakażenia ran, posocznicę oraz zapalenie opon mózgowych, czy biegunki. W przypadku ludzi zdrowych rzadko powodują zakażenia, natomiast od początku lat 80 XX wieku obserwowany jest wzrost zakażeń Enterobacter sp. u ludzi hospitalizowanych, zwłaszcza na oddziałach intensywnej terapii [146, 148]. Enterobacter sp., zwłaszcza Enterobacter cloacae i Enterobacter aerogenes, to patogeny szpitalne odpowiedzialne za różne infekcje. Należą do nich między innymi: zakażenie układu moczowego, zakażenia dolnych dróg oddechowych, wsierdzia, zakażenia jamy brzusznej, septyczne zapalenie stawów, szpiku kostnego i infekcje oczu [149 -151].