B ADANIA BIODEGRADACJI OKSYETYLENOWANYCH ALKOHOLI

W pierwszej fazie badań biodegradacyjnych przeprowadzono analizę LC-MS modelowego oksyetylenowanego dodekanolu zawierającego średnio 10 grup oksyetylenowych w cząsteczce (C₁₂EO₁₀).

Przygotowano serię roztworów wzorcowych i trzykrotnie nastrzyknięto na kolumnę chromatograficzną próbkę zawierającą 1 µg/mL wzorca. Próbkę zalano fazą początkową, którą stanowiło: 30% wodnego roztworu 5 mM octanu amonu i 70%

metanolu. Analizę prowadzono na kolumnie Hypersil Gold zgodnie z procedurą opisaną w punkcie 2.1 części doświadczalnej. Wyniki pozwoliły na identyfikację poszczególnych homologów wchodzących w skład polidyspersyjnego oksyetylenowanego alkoholu C₁₂EO₁₀ a co z tym się wiąże sprawdzenie jakości (czystości) wzorca użytego do badań.

6.1. B

Celem badań jakościowych w ściekach było sprawdzenie jakie związki powierzchniowo czynne są odprowadzane wraz ze ściekami bytowymi z gospodarstw domowych. Zbadanie ścieków oczyszczonych pomogło odpowiedzieć na pytanie jak oczyszczalnie ścieków (a mianowicie osad czynny) radzą sobie z rozkładem (biodegradacją) związków powierzchniowo czynnych.

W celu sprawdzenia zawartości oksyetylatów w środowisku zbadano ścieki surowe i oczyszczone w Poznaniu i Centralnej oczyszczalni ścieków w Błoniach pod Warszawą.

Próbki ścieków surowych pobrano za pomocą pompy zatapialnej z głównych rurach kanalizacyjnych w Błoniu i STP Poznaniu. Całkowite stężenie NS mierzone metodą pośredniej tensammetrii (ITM) wynosiło 6,9 mg/L dla Ścieków pobranych w Błoniach i 13,9 mg/L dla ścieków pobranych w Poznaniu. Próbki ścieków z oczyszczalni ścieków w Błoniach zostały pobrane z opóźnieniem w czasie dopasowanym do operacyjnej zmiany hydraulicznego czasu retencji. Całkowite stężenie NS w ściekach oczyszczonych wynosiło 0,36 mg/L. Próbki natychmiast zakonserwowano formaliną w ilości: 5%

w przypadku ścieków surowych i 1%, w przypadku oczyszczonych [152].

Niejonowe związki powierzchniowo czynne zostały wyekstrahowane do octanu etylu i chloroformu (ekstrakcja sekwencyjna) według następującej procedury: do 50 mL ścieków dodano 15 g chlorku sodu i 0,1 g wodorowęglanu sodu. Następnie próbki ekstrahowano w rozdzielaczu trzema porcjami octanu etylu (10 mL, 10 mL i 5 mL) po odebraniu porcji rozpuszczalnika procedurę powtórzono z chloroformem [5, 120, 153].

W celu przeprowadzenia analizy chromatograficznej 10 µL ekstraktu odparowano do suchej pozostałości na piecu, następnie zalano fazą ruchomą, którą stanowiło 30%

wodnego roztworu 5 mM octanu amonu i 70% metanolu. Analizę LC-MS/MS przeprowadzono procedurą opisaną w punkcie: 2.1 części doświadczalnej.

6.2. O

Testy biodegradacyjne pozwalają ocenić podatność na biodegradację analizowanego związku, w badanym przypadku modelowego niejonowego surfaktantu. W trakcie trwania testu obserwuje się zmiany stężenia związku wprowadzonego w cykl metaboliczny bakterii, a produkty jego transformacji analizuje się za pomocą określonej

techniki [154]. Testy stosowane do kontroli biodegradacji surfaktantów, mogą być wykonywane w różnych warunkach. Niektóre testy symulują warunki panujące w oczyszczaniach ścieków z osadem czynnym, w innych – stosowana jest mikrofauna ze środowiska wodnego lub z gleby [155]. Dobór odpowiedniego rodzaju testu dla analizowanych związków jest dokonywany tak, aby otrzymane wyniki można było odnieść do warunków panujących w środowisku naturalnym [156].

6.2.1. TESTY BIODEGRADACYJNY WODY RZECZNEJ MODELOWEGO POLIDYSPERSYJNEGO OKSYETYLENOWANEGO ALKOHOLU

Test biodegradacyjny z wykorzystaniem wody rzecznej jako konsorcjum bakteryjnego miał na celu określenie zaszczepka ta zdolna jest do biodegradacji oksyetylenowanych alkoholi. Czy w warunkach naturalnych jakimi jest naturalny bieg rzeki proces ten zachodzi i z jaką efektywnością. Możliwe też było określenie potencjalnych ścieżek biodegradacyjnych.

Każdy test biodegradacyjny polegał na przygotowaniu odpowiedniej ilości prób biodegradacyjnych na podstawie których określano stopień rozkładu surfaktantu C12EO10

i powstanie ewentualnych metabolitów procesu biodegradacji. Biodegradacji poddawano niejonowy polidyspersyjny surfaktant C12EO10 o stężeniu w każdej z prób 10 mg/L.

Przygotowano próby właściwe (test biodegradacyjny z użyciem wody rzecznej) o następującym składzie:

⇒ 10 mL wody rzecznej

⇒ 190 mL pożywki mineralnej

⇒ 200 µL surfaktantu C₁₂E₁₀

Wodę rzeczną pobrano w punkcie pomiarowo-kontrolnym na Moście świętego Rocha w Poznaniu (podrozdział: 5.6 części doświadczalnej) w dniu początku testu biodegradacyjnego i niezwłocznie rozpoczęto test biodegradacyjny, tak aby nie zaszczepić wody innymi mikroorganizmami.

Procedura pobrania wody rzecznej była zgodna z europejską normą pobierania próbek wody: PN-ISO 566-6:2003.

6.2.2. TESTY BIODEGRADACYJNE Z WYIZOLOWANYMI SZCZEPAMI BAKTERYJNYMI Po etapie testów z wykorzystaniem wody rzecznej, postanowiono sprawdzić czy szczepy bakteryjne wyizolowane z tej właśnie naturalnej zaczepki będą biodegradaowały polidyspersyjny oksyetylenowany dodekanol. Celem tego etapy poracy było znalezienie szczepu (bądź szczepów), które są odpowiedzialne za centralne rozszczepienie oksyetylenowanych alkoholi.

Każdy test biodegradacyjny polegał na przygotowaniu odpowiedniej ilości prób biodegradacyjnych na podstawie których określano stopień rozkładu surfaktantu C₁₂EO₁₀ i powstanie ewentualnych metabolitów procesu biodegradacji. Biodegradacji poddawano niejonowy polidyspersyjny surfaktant C₁₂EO₁₀ o stężeniu w każdej z prób 10 mg/L.

Szczep bakteryjny przegotowano przed testem biodegradacyjnym: odpowiednio namnażano aż do uzyskania pożądanej objętości zaszczepki o odpowiednim stężeniu bakterii (według punktu: 5.4. części doświadczalnej)

Przygotowano próby właściwe (test biodegradacyjny z użyciem wyizolowanego szczepu Enterobacter sp. strain Z3) o następującym składzie:

⇒ 10 mL zaszczepki bakteryjnej

⇒ 190 mL pożywki mineralnej

⇒ 200 µL surfaktantu C₁₂EO₁₀

6.2.3. TESTY BIODEGRADACJNE MODELOWYCH HOMOLOGÓW C12EO4 I C12EO9 PRZEZ BAKTERIE SZCZEPU ENTEROBACTER SP STRAIN Z3

Testy biodegradacyjne na homologicznych oksyetylenowanych alkoholach C₁₂EO₄ i C12EO9 z wykorzystaniem wyselekcjonowanego szczepu Enterobacter sp. strain Z3 miały na celu ilościowe oznaczenie ubytku dodawanego wzorca. Dodatkowym celem tego etapu badań było oznaczenie metabolitów procesu i sprawdzenie czy biodegradacja przebiega zgodnie z mechanizmem centralnego rozszczepienia.

Każdy test biodegradacyjny polegał na przygotowaniu odpowiedniej ilości prób biodegradacyjnych na podstawie których określano stopień rozkładu surfaktantu C₁₂EO₁₀ i powstanie ewentualnych metabolitów procesu biodegradacji. Biodegradacji poddawano niejonowy surfaktant C₁₂EO₉ i C₁₂EO₄ o stężeniu w każdej z prób 10 mg/L.

Szczep bakteryjny przegotowano przed testem biodegradacyjnym: odpowiednio namnażano aż do uzyskania pożądanej objętości zaszczepki o odpowiednim stężeniu bakterii (według punktu: 5.4. części doświadczalnej)

Przygotowano próby właściwe (test biodegradacyjny z użyciem wyizolowanego szczepu Enterobacter sp. strain Z3) o następującym składzie:

⇒ 10 mL zaszczepki bakteryjnej

⇒ 190 mL pożywki mineralnej

⇒200 µL surfaktantu C₁₂EO₉ lub C₁₂EO₄

Metodyka badawcza polegała na prowadzeniu testu statycznego z użyciem pożywki do testów dynamicznych jako źródła węgla i energii. Wykorzystywane do badań szklane kolby uprzednio umyto metanolem i woda destylowaną oraz wyjałowiono w świetle UV, następnie owinięto folią aluminiową, w celu uniknięcia dostępu światła do próbki

podczas trwania testu. Do każdej z kolb wprowadzono odpowiednie ilości odczynników, następnie każdą próbę przykryto jałową gazą w celu uniknięcia przedostania się zanieczyszczeń z powietrza do próbki. Przygotowane w ten sposób próby wytrząsano w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez godzinę dziennie. Testy prowadzono przez 30 dni w każdym dniu przeprowadzano ekstrakcję na świeżych próbkach. Bez dodatku formaldehydu (w celu uniknięcia zanieczyszczenia próbki).