OKSYETYLENOWANEGO ALKOHOLU W TEŚCIE WODY RZECZNEJ
2.6. B ADANIA ZDOLNOŚCI DO CENTRALNEGO ROZSZCZEPIENIA WYIZOLOWANYCH SZCZEPÓW
Przeprowadzone badania wykazały, iż wśród bakterii wyselekcjonowanych z wody rzecznej jest jedna lub wszystkie, które powodują biodegradację modelowego oksyetylenowanego alkoholu według mechanizmu centralnego rozszczepienia.
Następnym etapem badań było sprawdzenie, która zaszczepka (lub które) powodują biodegradację polidyspersyjnego oksyetylenowanego alkoholu. W tym celu przeprowadzono szereg krótkich (7 dni) testów biodegradacyjnych mających na celu wyeliminowanie szczepu lub szczepów nie biodegradadujących oksyetylenowanego alkoholu.
Przeprowadzono trzy równoległe testy, które różniły się szczepem bakteryjnym:
pierwszy test prowadzono z użyciem szczepu Enterobacter sp. strain Z3 kolejny ze szczepem Citrobacter freundii i ostatni z zaszczepką Stenotrophomonas sp. strain Z5.
Próbki przygotowano według procedury opisanej w punkcie 6.2.2. części doświadczalnej. Testy prowadzono przez 7 dni próbki były ekstrahowane (na świeżo) octanem etylu według procedury opisanej w punkcie 4.3. części doświadczalnej . Po odpowiednim przygotowaniu próbek i zalaniu ich fazą ruchomą rejestrowano chromatogramy całkowitego prądu jonowego dla każdej z prób. Na podstawie widm masowych wyznaczono pola powierzchni homologów oksyetylenowanych alkoholi C12EO4-12.
Rysunek 59. Zależność pola powierzchni piku dla homologów oksyetylenowanych alkoholi i poli(etylenowanych glikoli) w teście biodegradacyjnym z zaszczepką Enterobacter sp. strain Z3
Rysunek 60. Zależność pola powierzchni piku dla homologów oksyetylenowanych alkoholi i poli(etylenowanych glikoli) w teście biodegradacyjnym z zaszczepką Citrobacter freundii
Rysunek 61. Zależność pola powierzchni piku dla homologów oksyetylenowanych alkoholi i poli(etylenowanych glikoli) w teście biodegradacyjnym z zaszczepką Stenotrophomonas sp. strain Z5
Do dalszych badań wybrano szczep Enterobacter sp. strain Z3 jako szczep, który zdolny jest do biodegradacji oksyetylenowanego alkoholu w warunkach laboratoryjnych
(rysunek 59), ponieważ po siedmiu dniach testu pole powierzchni pików chromatograficznych pochodzących od homologów oksyetylenowanych alkoholi maleje. Dodatkowo zaobserwowano zdolności wszystkich szczepów bakteryjnych do biodegradacji, potwierdza to większa ilość wolnych poli(etylenowanych glikoli) w porównaniu do ilości wprowadzonych ze wzorcem (dzień początku testu). Na rysunkach 59 – 61 widoczne jest podwyższenie sygnału analitycznego pochodzącego od poszczególnych homologów poli(etylenowanych glikoli) EG4-12 po siedmiu dniach testu. Możliwe jest, iż szczep Enterobacter sp. strain Z3 biodegraduje polidyspersyjny dodekanol zgodnie z mechanizmem centralnego rozszczepienia. Potwierdzenie tej hipotezy wymaga jednak szeregu dodatkowych badań, które przeprowadzono w dalszym toku pracy.
Szczep Citrobacter freundii również wykazuje podobne właściwości biodegradacyjne (rysunek 59). Szczep Stenotrpohomonas sp. strain Z5 nie biodegraduje oksyetylenowanego alkoholu o czym świadczy wykres przedstawiony na rysunku 61.
2.6.1. DOBÓR ODPOWIEDNIEGO STĘŻENIA ZASZCZEPKI BAKTERYJNEJ
Kolejnym etapem badań był wybór odpowiedniego stężenia zaszczepki bakteryjnej Enterobacter spp. w teście biodegradacyjnym. W tym celu przeprowadzono trzy równoległe testy biodegradacyjne, różniące się stężeniem zaszczepki bakteryjnej, którą przygotowano zgodnie z procedurą opisaną w punkcie 6.2.2. części doświadczalnej.
Przeprowadzono trzy 30 dniowe równoległe testy biodegradacyjne: w pierwszym dodano 1 mL zaszczepki, w drugim 5 mL i w trzecim 10 mL. Próbki pobierano w jednakowych odstępach czasowych, poddawano ekstrakcji ciecz-ciecz octanem etylu i oznaczano według procedur pisanych w punktach: 4.3. i 2.1.
Analiza chromatogramów przedstawionych na rysunkach (62-64) pozwala na postawienie hipotezy, iż w przypadku 1 mL zaszczepki stężenie mikroorganizmów jest zbyt małe aby mogły one biodegradować tak duże ilości (10 mg/L) oskyetylenowanych alkoholi.
Rysunek 62. Chromatogramy całkowitego prądu jonowego otrzymane dla ekstraktów octanu etylu: początek testu, 7, 14, 21 i 30 dzień testu biodegradacyjnego z 1 mL zaszczepki Enterobacter sp. strain Z3
Rysunek 63. Chromatogramy całkowitego prądu jonowego otrzymane dla ekstraktów octanu etylu: początek testu, 7, 14, 21 i 30 dzień testu biodegradacyjnego z 5 mL zaszczepki Enterobacter sp. strain Z3
Rysunek 64. Chromatogramy całkowitego prądu jonowego otrzymane dla ekstraktów octanu etylu: początek testu, 7, 14, 21 i 30 dzień testu biodegradacyjnego z 10 mL zaszczepki Enterobacter sp. strain Z3
Na chromatogramie z 14 dnia i dalszych dni testu biodegradacyjnego z 10 mL zaszczepki (rysunek 63) wyraźnie widać spadek intensywności pików pochodzących od homologów oksyetylenowanych alkoholi (piki o czasie retencji: 9,33 min – C12EOx, 10,38 min - C14EOx i 11,27 min - C16EOx) i wzrost intensywności piku o czasie retencji 1,53 min pochodzącego do metabolitów biodegradacji (PEG).
Z trzech przeprowadzonych testów najlepszym stężeniem zaszczepki było 10 mL, i taką właśnie objętość wybrano do dalszych badań. W celu potwierdzenia wyboru dokładnie przeanalizowano przebieg procesu biodegradacji. Na wykresach (rysunki 64-66) przedstawiono zależność obniżającego się sygnału analitycznego pochodzącego od homologów C12EO4, C12EO9, C12EO12, i C12EO17 oraz sumy oksyetylenowanych alkoholi i odpowiadających im łańcuchów poli(etylenowanych glikoli).
Z wyników przedstawionych na wykresach (Rysunki 65-67) można wywnioskować, że bakterie we wszystkich przeprowadzonych testach degradują polidyspersyjny dodekanol (C12EO10). Im wyższe stężenie zaszczepki tym wcześniej pole powierzchni pików pochodzących od oksyetylenowanych alkoholi maleje a pole powierzchni pików pochodzących od poli(etylenowanych glikoli) rośnie. W przypadku 10 mL zaszczepki wyraźna zmiana widoczna jest przed 5 dniem testu biodegradacyjnego (rysunek 67), natomiast w przypadku 1 mL zaszczepki czas ten wydłuża się niemal trzykrotnie (ponad 10 dni) – rysunek 67.
Zmiany stężeń poszczególnych szeregów homologicznych były oceniane półilościowo na podstawie powierzchni pików (sumy wszystkich homologów danej serii), podczas trwania testu biodegradacyjnego, z powodu braku wzorców homologów poszczególnych związków. Zmiany takie dla szeregu homologicznego PEG, C12EOX, C14EOX, C16EOX i C18EOX przedstawia rysunek 68. Z rysunku tego wynika iż następuje szybkie obniżenie stężenia homologów C12EOX, C14EOX, C16EOX oraz C18EOX już w początkowej fazie testu.
Podczas testu obserwuje się równocześnie ze spadkiem stężenia surfaktantu znaczący przyrost stężenia PEG obserwowany od 1 do 20 dnia testu, natomiast po 20 dniu testu następuje spadek stężenia tych metabolitów. Obserwacje te potwierdzają, że PEG są głównym produktem biodegradacji surfaktantu C12EO10 przez bakterie Enterobacter sp. strain Z3, oraz że szczep bakteryjny Enterobacter sp. strain Z3.
w warunkach degradowania surfaktantu C12EOX jako jedynego źródła węgla organicznego powoduje tylko centralne rozszczepienie C12EOX z utworzeniem poli(glikoli etylenowych).
Rysunek 65. Zmiana pola powierzchni pików na widmach masowych testu biodegradacyjnego z 1mL zaszczepki bakteryjnej
Rysunek 66. Zmiana pola powierzchni pików na widmach masowych testu biodegradacyjnego z 5mL zaszczepki bakteryjnej
Rysunek 67. Zmiana pola powierzchni pików na widmach masowych testu biodegradacyjnego z 10mL zaszczepki bakteryjnej
Rysunek 68. Zmiana powierzchni całkowitego prądu jonowego dla C12EOX C14EOX C16EOX
C18EOX i PEG podczas trwania testu biodegradacyjnego