Analiza danych pod kątem występowania efektów zakłócających

Mimo niekwestionowalnych korzyści wynikających z wprowadzenia algorytmu multiplikatywnej korekcji sygnału w przypadku występowania w widmie cech rozproszenia Mie`go lub algorytmu korygującego efekt elektrycznej fali stojącej, w niniejszej pracy nie zdecydowano się na modyfikację analizowanych widm. Za podjęciem takiej decyzji przemawiają następujące argumenty. Po pierwsze nie jest rekomendowane stosowanie jednoczesnej korekcji widm pod względem efektów rozproszeniowych i efektu fali stojącej [110]. Należy zatem realnie ocenić, które z omawianych zjawisk zakłócających widmo FTIR ma większy wpływ na rejestrowane w badaniach widma. Po drugie, by móc zastosować wybrany algorytm potrzebne są szczegółowe informacje charakterystyczne dla każdego rodzaju komórek budujących badanę tkankę. W przypadku algorytmu eliminacji wpływu rozproszenia Mie’go wymagane jest podania rozmiarów elementów rozpraszających [103, 106]. Z kolei zastosowanie algorytmu niwelujacego wpływ EFSW na widmo wymaga m.in. znajomości współczynnika załamania światła dla poszczególnych warstw komórkowych [109, 110]. Tkanka hipokampa, będącego obiektem badań w omawianej pracy, charakteryzuje się złożoną budową komórkową. Występujące warstwy komórkowe różnią się między sobą pod względem rozmiaru komórek oraz jąder komórkowych. Co więcej, w obrębie hipokampa występuje warstwa składająca się z kilkunastu rodzajów komórek (warstwa komórek wielokształtnych) chaotycznie rozmieszczonych. Tym samym nie ma możliwości wyodrębnienia fragmentów tkanki, dla których można by zastosować algorytm z danymi wejściowymi odpowiadającymi rzeczywistości. Istotnym jest również, iż wprowadzony algorytm modyfikuje również widma nie mające cech efektów rozproszeniowych lub EFSW, zatem istnieje prawdopodobieństwo zafałszowania wyników analiz dotyczących udziału i konformacji protein (opartych o analizę pasma amid I) przez sam algorytm.

Licząc się z możliwymi negatywnymi skutkami podjętej decyzji postanowiono dołożyć wszelkich starań, aby uzyskane rezultaty analiz jak najwierniej odtwarzały rzeczywiste informacje zapisane w widmach spektroskopowych. By zminimalizować wpływ efektów rozproszeniowych na uzyskane wyniki poczyniono następujące kroki:

1) każde z rozpatrywanych widm zostało wyselekcjonowane tak, by pochodziło z wnętrza warstwy komórkowej (wpływ efektów rozproszeniowych jest znacząco większy na granicy warstw komórkowych, gdzie należy się spodziewać różnic w wartościach współczynnika załamania światła [101]) i nie posiadało widocznych cech rozproszenia promieniowania;

2) widma pochodzące z okolic inkluzji, pojawiających się w niektórych preparatach, również zostały wykluczone z dalszej analizy.

Jak już wspomniano w rozdziałe 2.4, rezonansowe rozproszenie Mie’go może powodować zafałszowanie wyników dotyczących zawartości protein oraz ich struktury drugorzędowej. Mając to na uwadze sprawdzono, czy widma pochodzące z badanych preparatów wykazują cechy RMieS. Na rysunkach 13.-15. przedstawiono widma pochodzące z przekrojów liniowych przez wszystkie warstwy komórkowe wybranego obszaru (CA1, CA3 oraz zakrętu zębatego). W części B rysunku zaprezentowano mapy chemiczne obrazujące stosunek wysokości pasm amidu II i amidu I. Zestawienie tych map z obrazem mikroskopowym (w części C rysunku) wskazuje, że różnice wartości stosunku intensywności odzwierciedlają warstwową strukturę obszarów CA1, CA3 i DG hipokampa.

Zaznaczony czerwoną ramką fragment widma (część D rysunku), obejmujący pasma amid I i amid II, pozwala zauważyć, iż w widmach z poszczególnych warstw komórkowych nie występują zaburzenia w relacji tychże pasm jak również przesunięcie maksimum pasma amidu I.

Rysunek 13. Obraz mikroskopowy skanowanego obszaru CA1 hipokampa kontrolnego (A). Mapa chemiczna obrazująca stosunek intensywności pasm amid II i amid I (B) oraz jej nałożenie na obraz mikroskopowy (C). Widma IR zarejestrowane wzdłuż przekroju liniowego przez wszystkie warstwy obszaru CA1 (D). Czerwoną ramką zaznaczono zakres liczby falowej, w którym mogą uwidaczniać się efekty rozproszeniowe. Widma rejestrowane były wzdluż czerwonej linii przedstawionej w części A rysunku.

6. Przygotowanie danych do analizy

Rysunek 14. Obraz mikroskopowy skanowanego obszaru CA3 hipokampa kontrolnego (A). Mapa chemiczna obrazująca stosunek intensywności pasm amid II i amid I (B) oraz jej nałożenie na obraz mikroskopowy (C). Widma IR zarejestrowane wzdłuż przekroju liniowego przez wszystkie warstwy obszaru CA3 (D). Czerwoną ramką zaznaczono zakres liczby falowej, w którym mogą uwidaczniać się efekty rozproszeniowe. Widma rejestrowane były wzdluż czerwonej linii przedstawionej w części A rysunku.

Rysunek 15. Obraz mikroskopowy skanowanego obszaru DG hipokampa kontrolnego (A). Mapa chemiczna obrazująca stosunek intensywności pasm amid II i amid I (B) oraz jej nałożenie na obraz mikroskopowy (C). Widma IR zarejestrowane wzdłuż przekroju liniowego przez wszystkie warstwy obszaru DG (D). Czerwoną ramką zaznaczono zakres liczby falowej, w którym mogą uwidaczniać się efekty rozproszeniowe. Widma rejestrowane były wzdluż czerwonej linii przedstawionej w części A rysunku.

Bardziej problematycznym wydaje sie być eliminacja wpływu efektu elektrycznej fali stojącej na analizowane widma bez wprowadzenia odpowiedniego algorytmu korekcji. Nie dyspnujemy też żadnym dowodem występowania zakłóceń w widmie wynikających z EFSW. Obecności tego typu artefaktów można dowieść jedynie porównując widma z poszczególnych warstw komórkowych w próbkach o różnej, znanej grubości lub też porównując widma preparatów uzyskanych w wyniku badań FTIR przeprowadzonych w trybie transmisyjno-odbiciowym z widmami pozyskanymi w trybie transmisyjnym. Na etapie zakończonych eksperymentów wywoływania drgawek u zwierząt żaden z wymienionych sposobów nie jest możliwy. Jednak można sądzić, iż nawet jeżeli efekt fali stojącej miał miejsce w prezentowanych badaniach, to nie miał on wpływu na uzyskane rezultaty. Przemawia za tym fakt, iz porównywano widma uzyskane z poszczególnych warstw komórkowych w preparatach od zwierząt, u których wywołano drgawki z widmami z analogicznych warstw komórkowych z prepratów od zwierząt kontrolnych. Zachowana została zatem zbliżona grubość preparatów oraz co najmniej zbliżona wartość współczynnika załamania światła w badanych wartwach komórkowych.

6. Przygotowanie danych do analizy