Podstawowe elementy spektrometru IR

2.2.1. Źródła promieniowania IR

Źródłem promieniowania podczerwonego jest każde ciało posiadające energię cieplną. Promieniowanie emitowane przez taki obiekt przyjmuje plankowski rozkład temperatury, a jego całkowita zdolność emisyjna opisana jest prawem Stefana [78]:

𝑅_𝑇 = 𝜎𝑇4 , (28)

gdzie:

𝑅_𝑇 - całkowita zdolność emisyjna ciała [Wm-2];  - stała Stefana-Boltzmana [Wm-2K-4]; 𝑇 - temperatura emitera [K].

W warunkach laboratoryjnych zazwyczaj korzysta się ze spektrometrów IR ze źródłem globarowym lub włóknem Nernsta. W badaniach wymagających wysokiej rozdzielczości spektralnej i przestrzennej jako źródło IR wykorzystuje się promieniowanie synchrotronowe. W eksperymentach przedstawionych w niniejszej pracy głównymi narzędziami badawczymi były spektrometr ze źródłem globarowym (mapowanie rozkładu przestrzennego makromolekuł biologicznych) oraz spektrometr z synchrotronowym źródłem IR (identyfikacja agregatów w hipokampie), dlatego tylko te dwa źródła zostaną omówione poniżej.

Globar jest to cienki pręt o długości kilku centymetrów i średnicy kilku-kilkunastu milimetrów wykonany ze sproszkowanego węglika krzemu. Globar pracuje w temperaturze 1500 K. Jego zaletą jest brak ujemnej stałej termooporowej oraz większa wydajność emisyjna dla fal krótszych od 7 m, wadą natomiast relatywnie (w porównaniu do źródeł synchrotronowych) wysoka wartość rozdzielczości przestrzennej [13, 84].

Przez promieniowanie synchrotronowe rozumiemy fale elektromagnetyczne emitowane przez cząstki o niezerowym ładunku elektrycznym (zazwyczaj pozytony lub elektrony) poruszające się z prędkością bliską prędkości światła w zewnętrznym polu magnetycznym. Powstawanie promieniowania synchrotronowego zostało przewidziane w 1944 r. w pracy autorstwa Iwanenko i Pomeranchuka [85], a eksperymentalnie dowiedzione rok później przez Eldera i jego zespół [86, 87]. Wytwarzanie promieniowania synchrotronowego zostało schematycznie przedstawione na rysunku 7. W warunkach wysokiej próżni paczka cząstek naładowanych zostaje wprowadzona do akceleratora liniowego, gdzie przechodząc przez mikrofalowe wnęki rezonansowe ulega przyspieszeniu i osiąga energię kinetyczną rzędu MeV. Następnie po wejściu do akceleratora kołowego (tzw. booster) cząstki

naładowane są ponownie przyspieszane, a ich energia wzrasta do GeV. Z taką energią cząstki naładowane trafiają do pierścienia akumulacyjnego synchrotronu i tam, w wyniku oddziaływania z polem magnetycznym, emitują promieniowanie EM stycznie do krzywizny toru. W synchrotronach pierwszej generacji promieniowanie synchrotronowe uzyskiwano przez wprowadzenie paczki ładunków w jednorodne pole magnetyczne wytwarzane przez dipol magnetyczny, gdzie działająca na poruszające się ładunki siła Lorentza powoduje zakrzywienie toru ruchu tych cząstek, a tym samym pojawienie się przyspieszenia dośrodkowego. Intensywność tak uzyskiwanego promieniowania jest wprost proporcjonalna do liczby ładunków w poruszającej się paczce [87]. Z czasem w konstrukcji pierścieni synchrotronowych, obok dipoli magnetycznych pełniących rolę magnesów zakrzywiających, pojawiły się tak zwane urządzenia wstawkowe, tj. wigglery i undulatory, zbudowane z macierzy magnesów, w których tor ruchu paczki ładunków jest wielokrotnie zakrzywiany, dzięki czemu intensywność uzyskiwanego promieniowania SR jest większa o kilka rzędów wielkości niż w przypadku tradycyjnych dipoli [88]. Warto zaznaczyć, iż w przypadku undulatora emitowane fotony ulegają interferencji dając na wyjściu promieniowanie niemalże monochromatyczne o wysokiej intensywności. Przy zastosowaniu wigglerów otrzymuje się promieniowanie charakteryzujące się stosunkowo małą długością fali i, tak jak w przypadku magnesów zakrzywiających, ciągłym spektrum [iv, v].

Rysunek 7. Schemat ideowy powstawania promieniowania synchrotronowego.

Do głównych cech promieniowania synchrotronowego zalicza się [87, 88]:

a) wysoką kolimację: rozwartość stożka emisji promieniowania synchrotronowego zależy od energii poruszających się cząstek (~1/𝛾, gdzie 𝛾 jest czynnikiem Lorentza);

b) wysokie natężenie wiązki: dla wiązki promieniowania X powstałego w synchrotronach III generacji jasność wynosi co najmniej 1018

fotonów/(s*mm2*mrad2*0,1%BW), BW oznacza szerokość widmową3;

c) polaryzację liniową w płaszczyźnie pierścienia synchrotonowego a eliptyczną poza tą płaszczyzną;

2. Wprowadzenie teoretyczne do spektroskopii oscylacyjnej

d) możliwość uzyskania promieniowania EM w szerokim zakresie widmowym: od dalekiej podczerwieni (λ≌10-5 m) po promieniowanie X (λ<10-10 m) (przy zastosowaniu undulatorów uzyskuje się wiązkę quasi-monochromatyczną).

Dzięki powyższym cechom promieniowanie synchrotronowe jest powszechnie stosowanym narzędziem badawczym w różnych dziedzinach nauki np. w badaniach biologicznych [13, 89, 90], geologicznych [91, 92] czy nawet w badaniach dzieł sztuki [93– 95].

Moc promieniowania IR uzyskiwanego w synchrotronach nie jest wyższa niż promieniowania pochodzącego z tradycyjnych źródeł IR. Jednak mały naturalny rozmiar źródła oraz wąski kąt emisji promieniowaina IR powodują, iż jasność promieniowania IR uzyskiwanego z synchrotronu jest od 100 do 1000 razy większa niż w przypadku tradycyjnego źródła IR [96]. Dzięki temu przy synchrotronowej wiązce IR o rozmiarach rzędu kilku m, a więc porównywalnych z rozmiarami pojedynczych komórek, możliwe jest otrzymanie widma o znacznie lepszej jakości niż przy użyciu źródła globarowego. Jednak zwiększając rozmiar wiązki IR uzyskiwanej z synchrotronu i globaru możliwe jest uzyskanie widm o zbliżonej jakości. Z rysunku 8A wynika, iż by uzyskać wartość sygnału na detektorze przy zastosowaniu globarowego źródła promieniowania IR porównawalną do tej dla źródła synchrotronowego, należy zastosować aperturę ograniczającą przekrój poprzeczny wiązki nie bardziej niż do 70 µm. Na rysunku 8B porównano widma uzyskane przy użyciu synchrotronowego (widmo czerwone) oraz globarowego (widmo niebieskie) źródła IR przy aperturze wynoszącej 6 µm. Z rysunku wynika, że wartość stosunku sygnału do szumu jest wyższa dla promieniowania synchrotronowego niż dla globarowego. To przekłada się na niższą, a więc korzystniejszą, wartość rozdzielczości przestrzennej w przypadku mikrospektroskopii IR ze źródłem synchrotronowym w porównaniu do tej z tradycyjnym źródłem promieniowania IR [13, 16, 89].

Rysunek 8. (A) Porównanie zależności sygnału, rejestrowanego na detektorze MCT, od rozmiaru zastosowanej apertury dla wiązki promieniowania IR uzyskanej z synchrotronu i globaru. (B) Porównanie widm absorpcyjnych otrzymanych przy zastosowaniu promieniowania IR ze źródła synchrotronowego oraz z globarowego przy aperturze równej 6 µm, wg [13].

Dyfrakcja promieniowania elektromagnetycznego na elementach układu optycznego, zarówno w mikrospektroskopii FTIR jak i innych metodach spektroskopowych, powoduje iż fizycznie nie jest możliwe uzyskać wiązki promieniowania o przekroju poprzecznym na

próbce mniejszym od pewnej wartości. Wartość ta nazwana jest limitem dyfrakcyjnym. W przypadku układu z pojedynczą aperturą limit dyfrakcyjny wynosi 2λ/3 [13], co przy zakresie MIR od 4000 cm-1 do 500 cm-1 wynosi odpowiednio od 1,7 µm do 17 µm. W przypadku geometrii konfokalnej, a więc w sytuacji gdy rozmiar wiązki ograniczany jest aperturą zarówno przed próbką jak i przed detektorem, limit dyfrakcyjny jest równy λ/2 [13], co w przeliczeniu dla zakresu MIR daje rodzielczość przestrzenną od 1,25 µm do 12 µm.

2.2.2. Interferometr

Zarówno w spektroskopii IR jak i w spektroskopii Ramana kluczowym elementem aparatury jest interferometr, który pozwala na selektywne wzmacnianie intensywności promieniowania skierowanego na badaną próbkę. Ideowy schemat interferometru został przedstawiony na rysunku 9. Interferometr składa się z trzech zwierciadeł: stacjonarnego, ruchomego oraz półprzepuszczalnego. Wiązka promieniowania EM o ciągłym spektrum, emitowanego przez źródło, po przejściu przez układ soczewek (a w przypadku wiązki IR zwierciadeł) zostaje skierowana na zwierciadło półprzepuszczalne. W przypadku badań z użyciem średniej podczerwieni zwierciadło półprzepuszczalne zbudowane jest z transparentnego dla MIR bromku potasu (KBR) pokrytego warstwą germanu lub tlenku żelaza [77]. Zwierciadło półprzepuszczalne rozdziela wiązkę pierwotną (oznaczona na rysunku jako wiązka 1) na dwie wiązki o jednakowych intensywnościach (2 i 3), biegnące prostopadle do siebie. Jedna z nich (2) trafia na zwierciadło stacjonarne. Pozostała część wiązki pierwotnej (3) zostaje skierowana na zwierciadło ruchome, poruszające się ruchem jednostajnym, z prędkością rzędu 0,001-10 mm∙s-1,w kierunku równoległym do wiązki na nie padającej. Wiązki odbite od zwierciadeł stacjonarnego (2) i ruchomego (3’) wracają do separatora, gdzie ulegają interferencji. Powstała w ten sposób wiązka (4) zostaje skierowana na badany preparat. Zwierciadło ruchome zmienia swoje położenie o 𝛥𝑥, więc różnica dróg optycznych między falami 2 i 3’ wynosi = 2𝛥𝑥. Zatem wzmocnienie fal zachodzi dla wartości przesuwu zwierciadła 𝑥 równego parzystej wielokrotności długości fali padającego promieniowania, a wygaszenie dla 𝑥 równego nieparzystej wielokrotności . Zwykle do precyzyjnego pomiaru położenia zwierciadła ruchomego używa się wiązki lasera helowo-neonowego [83].

2. Wprowadzenie teoretyczne do spektroskopii oscylacyjnej

Rysunek 9. Schemat ideowy interferometru Michelsona.

Detektor, do którego dociera promieniowanie po przejściu przez badany preparat, rejestruje intensywność widma interferencyjnego w funkcji różnicy dróg optycznych promieniowania biegnącego w interferometrze [77, 79]:

𝑆() = ∫ 𝐼(𝜈) cos(2𝜋𝜈𝛿) 𝑑𝜈 +∞ 0 , (29) gdzie:  - różnica dróg optycznych;

𝐼(𝜈) - intensywność promieniowania o częstoliwości ν.

Za pomocą transformacji Fouriera można przekształcić podaną wyżej funkcję zależną od 

w funkcję opisującą inetnsywność promieniowania zależną od częstotliwości [77, 79]: 𝐼(𝜈) = ∫ 𝑆() cos(2𝜋𝜈𝛿) 𝑑

+∞

−∞

2.2.3. Detektory podczerwieni

Promieniowanie podczerwone może być rejestrowane przez detektory piroelektryczne, jak termopara, bolometr, komórka Golaya, lub fotoelektryczne. Detektory fotoelektryczne są dziś znacznie bardziej powszechne. Działanie detektorów fotoelektrycznych polega na pomiarze natężenia prądu elektrycznego powstałego wskutek wybicia elektronu z materiału fotodiody w wyniku absorpcji kwantu promieniowania elektromagnetycznego. W zależności od tego, w jakim zakresie podczerwieni prowadzone są badania, kryształ detektora fotoelektrycznego dobiera się tak, by przerwa energetyczna kryształu pokrywała się z energią analizowanego promieniowania IR [3, 97].

W mikrospektroskopii w podczerwieni zazwyczaj wykorzystuje się detektory zbudowane z tellurku kadmowo-rtęciowego zwane detektorami MCT (ang. mercury, cadmium, telluride). Ich zaletą jest bardzo dobry stosunek sygnału do szumu otrzymywanych widm, wadą natomiast niska temperatura pracy i wynikająca z tego konieczność chłodzenia ciekłym azotem [3, 77].

2.3. Charakterystyka spektroskopowa głównych makromolekuł