2. WPROWADZENIE TEORETYCZNE DO SPEKTROSKOPII OSCYLACYJNEJ
2.4. Zalety i wady transmisyjno-odbicowej mikrospektroskopii FTIR
W mikrospektroskopii FTIR możliwe jest wykonywanie pomiarów przy zastosowaniu różnych trybów pracy. W trybie transmisyjnym badany preparat umieszczony zostaje między źródłem promieniowania IR a detektorem. Detektor rejestruje promieniowanie, które przeszło przez badany materiał. Podkład, na którym umieszcza się próbkę musi być przezroczysty dla wiązki IR w analizowanym zakresie liczby falowej. To założenie spełniają substancje takie jak np. BaF2, CaF2, ZnS, ZnSe [83]. W badaniach próbek tkanek, ze względu na ich relatywnie niewielką grubość, a co za tym idzie niewielką absorpcję, często stosuje się tryb transmisyjno-odbiciowy (ang. transflection). Podkłady stosowane w tym trybie pracy pokryte są warstwą metalu odbijającego dany zakres IR, wskutek czego wiązka promieniowania IR dwukrotnie przechodzi przez próbkę. W ten sposób zostają uwypuklone przestrzenne różnice absorbancji w preparacie. Inne zalety pracy w trybie transmisyjno-odbiciowewym to brak występowania aberracji chromatycznej oraz niewielki koszt szkieł (w porównaniu do podkładów stosowanych w transmisji). Nośniki użyte w eksperymentach opisanych w niniejszej pracy pokryte są warstwą Ag/SnO2. Jest to związek chemicznie obojętny i prawie całkowicie odbijający promieniowanie podczerwone średniego zakresu. Praca w trybie transmisyjno-odbiciowym obarczona jest jednak pewnymi wadami. Zjawiskami niekorzystnymi, istotnymi ze względu na ich wpływ na jakość uzyskiwanych wyników, są efekty rozproszeniowe, w szczególności rozproszenie Mie’go jak również tzw. efekt elektrycznej fali stojącej.
2.4.1 Rozproszenie Mie’go
W mikrospekroskopii FTIR materiałów biologicznych widma spektroskopowe z zakresu średniej podczerwieni, oprócz pasm absorpcji charakterystycznych dla konkretnych substancji chemicznych, mogą posiadać cechy wynikające z innych efektów fizycznych zachodzących w trakcie przejścia wiązki promieniowania elektromagnetycznego przez badane struktury. W trakcie badań zarówno pojedynczych komórek jak i wycinków tkanek zaobserwowano występowanie w widmach, pochodzących z heterogenicznych obszarów preparatów, nietypowych cech takich jak sinusoidalne falowanie linii bazowej, zaburzenia w relacji pasm amidu I i amidu II oraz przesunięcie maksimum pasma amidu I w kierunku niższych liczb falowych [100–102]. Dalsze analizy wykazały, iż przyczyną sinusoidalnych oscylacji linii bazowej jest rozproszenie Mie’go [100], a anomalia w obrębie pasma amidu I mogą wynikać z rezonansowej formy tego rozproszenia (RMieS – ang. resonant Mie scattering) [103].
Pod pojęciem rozproszenia Mie’go kryje się rozproszenie fal EM na dielektrycznych sferach. Określająca to zjawisko wydajność rozpraszania 𝑄 dana jest wzorem:
𝑄 = 2 −4 𝜌 𝑠𝑖𝑛𝜌 + 4 𝜌2(1 − 𝑐𝑜𝑠𝜌) , (31) przy czym: 𝜌 = 2𝜋𝑎𝑛 − 1 𝜆 , (32)
2. Wprowadzenie teoretyczne do spektroskopii oscylacyjnej
gdzie:
𝑎 - promień sfery [m].
𝑛 - stosunek współczynnika załamania światła wewnątrz i na zewnątrz sfery rozpraszającej [j.w.];
𝜆 - długość fali światła rozpraszanego [m].
Z powyższego równania widać, iż udział promieniowania rozproszonego w rejestrowanym widmie jest istotny, gdy długość fali promieniowania padającego jest zbliżona do rozmiaru cząstki rozpraszającej oraz gdy występują znaczne różnice gęstości optycznej między centrum rozpraszającym a jego otoczeniem. Biorąc pod uwagę długość fali promieniowania z zakresu średniej podczerwieni (2,5 - 25 μm) oraz rozmiary komórek i ich poszczególnych struktur, można przypuszczać, iż to głównie jądra komórkowe stanowią centra rozpraszające [100, 104].
Występowanie efektów rozproszeniowych może istotnie zaburzać wyniki analiz wielowymiarowych mających na celu wyodrębnienie grupy widm charakterystycznych np. dla danej jednostki chorobowej. Szczególnie niebezpieczne są zmiany w obrębie pasma amidu I, wykorzystywanego do określania zawartości protein w badanym materiale oraz ich konformacji. Jedną z metod, które można zastosować w celu zminimalizowania wpływu efektów rozproszeniowych na widma tkanek jest zatopienie badanych preparatów w parafinie. Związane jest to jednak z wykluczeniem z dalszych analiz pasm lipidowych (1350-1490 cm-1 i 2800–3000 cm-1) zafałszowanych przez absorpcję samej parafiny [105]. Grupa pod kierownictwem prof. Petera Gardnera z sukcesem podjęła się stworzenia algorytmu umożliwiającego eliminację efektów rozproszeniowych z widma IR zarówno dla pojedynczych komórek jak i dla tkanek [103, 106]. Rezulatatem tych prac jest algorytm multiplikatywnej korekcji sygnału (EMSC – ang. Extended Multiplicative Signal Correction). Algorytmy napisane przez inne grupy również wydają się być skuteczne [105, 107].
2.4.2 Efekt elektrycznej fali stojącej
Badania FTIR prowadzone w ostatnich latach dowiodły, iż jednym z najpoważniejszych problemów towarzyszących pomiarom prowadzonym w trybie transmisyjno-odbiciowym jest występowanie w rejestrowanym widmie MIR artefaktów związanych z tzw. efektem elektrycznej fali stojącej [108–114].
Pole elektryczne w pobliżu podkładu można opisać jako sumę dwóch fal sinusoidalnych, jednej reprezentującej promieniowanie padające a drugiej promieniowanie odbite. Ponieważ odbicie promieniowania od warstwy metalu wysokiej jakości (a z takim mamy do czynienia w przypadku podkładów w badaniach transmisyjno-odbiciowych) powoduje przesunięcie fazy wiązki odbitej względem padającej o π, zatem możliwe jest powstanie fali stojącej. Zjawisko to nazywane jest efektem elektrycznej fali stojącej (EFSW - ang. electric field standing wave effect). Efektywna intensywność tak powstałej fali zmienia się w funkcji odległości s w następujący sposób:
Z warunków brzegowych wynika, że na powierzchni odbijającej warstwy metalicznej jest węzeł fali, a kolejne węzły znajdują się w odległości równej:
𝑧 =𝑚𝜆
2𝑛 , (34)
gdzie:
𝑧 - odległość od powierzchni rozpraszającej (metalu) [m], m - nieujemna liczba całkowita,
λ - długość fali padającego promieniowania [m],
n - współczynnik rozpraszania ośrodka, w którym zachodzi interferencja [j.w.]. Przez wiele lat sądzono, że tak powstałe fale nie mają znaczącego wpływu na widmo rejestrowane w pomiarach transmisyjno-odbiciowych FTIR, jednak pojawiły się dowody temu przeczące. W 2008 r. Brooke i wsp. opublikowali wyniki eksperymentu, mającego na celu określenie zależności wielkości absorpcji MIR przez zarodniki bakteryjne od ich koncentracji (wyznaczanej jako gęstość powierzchniowa) [108]. Za pasma kalibracyjne przyjęto amid A (~3290 cm-1), amid I (~1655 cm-1) oraz amid II (~1540 cm-1). Otrzymane rezultaty były dość zaskakujące, gdyż powyżej pewnej wartości koncentracji zarodników4
zależność absorbancji w paśmie amidu A od gęstości powierzchniowej zarodników przestała rosnąć liniowo, czego należałoby oczekiwać na podstawie prawa Bouguera-Lamberta. Starając się wyjaśnić zaobserwowaną nieprawidłowość badacze przeprowadzili kolejny eksperyment, badający ponownie zależność absorbancji MIR od gęstości próbki [109]. Dowiedziono, że dla cząstek o rozmiarach znacznie mniejszych od długości fali padającego promieniowania, ułożonych jednorodnie w warstwach na tyle cienkich, by przypominać film, obecność pola elektromagnetycznego powstałego w wyniki interferencji fal zakłóca lub całkowicie maskuje absorbcję MIR przez te cząstki. W przypadku grubszych warstw preparatów EFSW jest przyczyną schodkowej zależności absorbancji od grubości próbki. Wpływ efektu fali stojącej na widmo jest zależny od długości fali promieniowania padającego [108, 109].
Powyższe obserwacje zostały potwierdzone w pracy Filika i wsp. [110]. W przytoczonym artykule pokazono również, iż w przypadku widm FTIR uzyskanych dla homogenicznego preparatu albuminowego BSA (BSA – ang. bovine serum albumine) w trybie transmisyjno-odbiciowym występują zakłócenia w relacji pasm CH (masyw 2830-3010 cm-1) oraz sumy pasm amidu I i II (1480-1760 cm-1). Stosunek absorbancji CH/amid (I+II) ma wartość najwyższą na krańcach preparatu, a najniższą w jego centrum. W analogicznych badaniach prowadzonych w modzie transmisyjnym stosunek ww. pasm pozostaje stały. Autorzy omawianej pracy przeprowadzili również porównanie wyników uzyskanych w technice transmisyjnej i transmisyjno-odbiciowej dla rzeczywistych prepratów komórkowych (komórki raka piersi MCF7). Również i te badania potwierdziły występowanie różnic w widmach FTIR pozyskanych w obydwu trybach pracy w kluczowych dla interpretacji wyników pasmach CH oraz amidu I. Absorbancja w zakresie pasma CH w trybie transmisyjno-odbiowym zdaje sie być najwyższa na brzegach komórki a najniższa w jej wnętrzu, podczas gdy grubość komórki jest największa w jej centrum. Co więcej, analiza
4 Koncentracja zarodników była dobierana tak, by nie przekroczyć wartości koncentracji odpowiadającej maksymalnemu, równomiernemu upakowaniu zarodników w pojedynczej warstwie.
2. Wprowadzenie teoretyczne do spektroskopii oscylacyjnej
składowych głównych (PCA – ang. principal component analysis) pozwala na różnicowanie widm pozyskanych dla porównywanych trybów pracy tylko na postawie absorbancji w paśmie amid I.
Znajomość podstaw fizycznych zjawiska będącego przyczyną opisanych zaburzeń w transmisyjno-odbiciowym widmie FTIR pozwala na opracownie odpowiedniego algorytmu korekcji rejestrowanego sygnału, co zostało uczynione zarówno w pracy Brooke [109] jak Filika [110]. W przeciwieństwie do zaproponowanego w pierwszej z przytoczonych prac, algorytm wyznaczania absorbancji A(λ) przy uwzględnieniu EFSW opracowany przez zespół Filika i wsp. uwzględnia odbicie promieniowania na granicy preparat/powietrze, dzięki czemu zdaje się skuteczniej niwelować wpływ EFSW na widmo. Zgodnie z założeniami przyjętymi przez Filika i wsp. zależność absorbancji od długości fali promieniowaniania absorbowanego (λ) opisuje zależność:
𝐴(𝜆) = 𝑎0(𝜆) (𝑙 2− 𝜆 8𝜋𝑛sin ( 4𝜋𝑛𝑙 𝑔𝜆 )) × [1 + 𝑅(𝜆)𝑠𝑖𝑛2(2𝜋𝑛𝑙 𝑔𝜆 )] , (35) gdzie:
𝑎0 - współczynnik skalowania dla absorpcji [AU], n - współczynnik rozpraszania [j.w.]
l - grubość preparatu [m] g - stała proporcjonalnośći [m2],
R(λ) - współczynnik interferencyjny dla poszczególnych wartości λ [AU], ściśle zależny od rozproszenia na granicy powietrze/preparat.
Powyższy algorytm może zostać skutecznie zastosowany jedynie w przypadku, gdy badany materiał jest homogeniczny, a zatem ma stałą i znaną wartość współczynnika załamania światła, oraz gdy znane są jego grubość oraz wartość współczynnika interferencyjnego R(λ). Dysponując tymi informacjami można wyznaczyć wartość współczynnika skalowania a0.