W ramach prezentowanej rozprawy doktorskiej analizowano zmiany biochemiczne zachodzące w hipokampie w dwóch zwierzęcych modelach drgawek epileptycznych, a mianowicie w modelu pilokarpinowym oraz w modelu drgawek rozniecanych elektrycznie. Badania dotyczące modelu pilokarpinowego stanowią kontynuację prac mających na celu ocenę zmian w akumulacji głównych makromolekuł biologicznych oraz względnej drugorzędowej strukturze protein, jakie zachodzą na skutek drgawek epileptycznych. Wyniki tych badań zostały opublikowane w czasopiśmie Journal of Chemical Neuroanatomy [122].
Celem eksperymentów z użyciem pilokarpinowego modelu drgawek, opisanych w niniejszej pracy, była identyfikacja i analiza liczby inkluzji widocznych w obrazie mikroskopowym hipokampa szczura. W widmach IR badanych inkluzji, uzyskanych za pomocą mikrospektroskopii FTIR z synchrotronowym źródłem promieniowania, uwagę zwracały pasma występujące przy liczbach falowych ~2800 cm-1, 1621 cm-1, 1398 cm-1 oraz 1304 cm-1, które są charakterystyczne dla kreatyny. Rezultaty uzyskane zarówno za pomocą µSRFTIR jak i mikrospektroskopii Ramana pozwoliły jednoznacznie zidentyfikować agregaty obecne w badanych rejonach hipokampa jako kreatynowe. Co więcej, mapy rozkładu przestrzennego pasm ~1080 cm-1 i 1225 cm-1 związanych z drganiami rozciągająymi fosfodiestrowej grupy 𝑃𝑂2−, dowodzą, iż związek lub związki budujące obserwowane agregaty nie wykazują zwiększonej obecności grup fosforanowych. Na tej podstawie można wnioskować, iż w depozytach nie występuje ufosforylowana forma kreatyny (fosfokreatyna). Ramanowskie profile głębokościowe potwierdzają wewnątrztkankową lokalizację inkluzji, wykluczając tym samym możliwość naniesienia kreatyny na powierzchnię preparatów lub zanieczyszczenia szkieł mikroskopowych. Analiza liczby agregatów kreatynowych pokazuje, iż statystycznie częściej pojawiają się one w preparatach pobranych od szczurów, u których wywołano drgawki przez iniekcję pilokarpiny niż u zwierząt kontrolnych. Obserwacja ta dotyczy zarówno preparatów pobranych w czasie trwania stanu padaczkowego (6h po iniekcji pilokarpiny), jak i pobranych po ustąpieniu drgawek w tzw. fazie latencji (72h po iniekcji konwulsanta). Statystycznie istotnie więcej agregatów kreatynowych występuje w zakręcie zębatym hipokampa u zwierząt poddanych działaniu pilokarpiny (zarówno w fazie ostrej jak i w fazie latencji) niż w tym samym obszarze hipokampa populacji kontrolnej. W sektorze 3 rogu Amona (CA3) oraz we wnęce zakrętu zębatego wraz z sektorem CA4 (obszar określony w pracy jako CA4-H) odnotowano statystycznie istotnie więcej inkluzji w fazie latencji w porównaniu do fazy ostej modelu pilokarpinowego. Taki rezultat świadczy o tym, iż mechanizmy zapoczątkowane wraz z pojawieniem się stanu padaczkowego, prowadzące do nadmiernego gromadzenia się kreatyny, nie ustępują wraz z zakończeniem aktywności drgawkowej. Wyniki analizy korelacji liczby obserwowanych inkluzji z parametrami behawioralnymi, charakteryzującymi stopień nasilenia i czas trwania drgawek dowodzą, że ani intensywność drgawek, ani czas ich pierwszego wystąpienia nie mają wpływu na liczbę inkluzji kreatynowych. Istotny natomiast pod tym względem jest całkowity czas trwania aktywności drgawkowej.
Kreatyna (kwas β-metyloguanidynooctowy) jest jednym z kluczowych związków biorących udział w buforowaniu oraz transporcie energii, szczególnie w komórkach charakteryzujących się dużymi fluktuacjami zapotrzebowania energetycznego, tak jak ma to miejsce w komórkach mięśniowych czy w komórkach budujących struktury mózgu [131– 134]. Przykładem patologicznej sytuacji zwiększonego zapotrzebowania mózgu na energię jest generacja i rozprzestrzenianie się drgawek epileptycznych. Energia potrzebna do rozprzestrzeniania się aktywności drgawkowej pochodzi z miejscowego zużycia glukozy oraz z defosforylacji cząsteczek adenozynotrójfosforanu (ATP) [135, 136]. Mimo iż zużycie ATP wzrasta w czasie drgawek, to jego zawartość w rejonach mózgu objętych drgawkami nie ulega zmianie [137]. Kluczową rolę w utrzymaniu stałego poziomu ATP może odgrywać proces defosforylacji fosfokreatyny do kreatyny w obecności enzymu kinazy kreatynowej. Zidentyfikowano dwie izoformy kinazy kreatynowej występujące w mózgu: mitochondrialną, której rolą jest fosforylacja kreatyny, oraz cytozolową, wykorzystującą fosfokreatynę jako źródło energii do konwersji ADP w ATP w rejonach o zwiększonym zapotrzebowaniu energetycznym [138, 139].
Poszczególne obszary mózgu mogą się różnić pod względem aktywności kinazy kreatynowej. W obrębie hipokampa immunoreaktywność mitochondrialnej kinazy kreatynowej jest obserwowana głównie w komórkach piramidowych sektorów 1-3 rogu Amona, komórkach ziarnistych oraz neuronach wnęki DG. Z kolei cytozolowa forma kinazy kreatynowej wykazuje zwiększoną immunoreaktywność w astrocytach oraz w niewielkich subpopulacjach neuronów wnęki [140]. Kim i wsp. [141] pokazali, że w czasie stanu padaczkowego wywołanego przez podanie pilokarpiny, immunoreaktywność cytozolowej kinazy kreatynowej w hipokampie spada do 70% poziomu kontrolnego, a poziom aktywności mitochondrialnej kinazy kreatynowej nie ulega zmianie. W fazie chronicznej modelu pilokarpinowego autorzy artykułu uzyskali odwrotną relację. Zauważalnie zmniejszona immunoreaktywność mitochondrialnej CK była tłumaczona utratą neuronów w rogu Amona i wnęce zakrętu zębatego. Z tego względu zwiększona akumulacja kreatyny w fazie ostrej, jaka została zaobserwowana w prezentowanych w niniejszej pracy eksperymentach, może wynikać ze zmniejszonej aktywności enzymatycznej jednej bądź obu form kinazy kreatynowej. Teza ta znajduje potwierdzenie w badaniach przeprowadzonych na myszach, u których ograniczono ekspresję cytozolowej kinazy kreatynowej [142] lub zarówno cytoplazmatycznej mózgowej jak i mitochondrialnej wszechobecnej (ang. ubiquintous) kinazy kreatynowej [143]. W obu badaniach zauważono, że u zwierząt ze zmniejszoną aktywnością kinazy kreatynowej występują anomalie w formowaniu i utrzymaniu hipokampalnych połączeń włókien mszystych. U myszy o obniżonej aktywności mózgowej cytoplazmatycznej CK zaobserwowano zwiększenie intra-infrapiramidalnego obszaru włókien mszystych. U zwierząt o obniżonej aktywności obu form kinazy kreatynowej odnotowano również zwiększenie obszaru supra-piramidalnego. Jak zostało pokazane w badaniach, nieprawidłowości w kiełkowaniu włókien mszystych aksonów komórek ziarnistych w warstwie drobinowej i wnęce DG, jak również w warstwie zewnętrznej CA3 [144] mogą znacząco wpływać na pobudliwość oraz na występowanie drgawek epileptycznych zarówno w modelach zwierzęcych epilepsji jak i u ludzi [145–148].
Kreatyna może również pełnić rolę neuromodulatora, co zostało dowiedzione przez Almeidę i wsp. [149]. Autorzy przytoczonej pracy pokazali, że kreatyna może być uwalniana z komórek nerwowych w sposób typowy dla neurotransmiterów, w trakcie depolaryzacji
9. Dyskusja wyników
w tkankach mózgu zależnie od poziomu pozakomórkowych jonów Ca2+ i przy aktywacji kanałów sodowo-potasowych. Uwalnianie kreatyny było znikome przy braku pozakomórkowych jonów Ca2+[149]. Biorąc pod uwagę wyniki Almeidy i wsp. oraz warunki towarzyszące wzmożonym wyładowaniom można sądzić, iż pojawianie się agregatów kreatynowych może być także powiązane z neuromodulacyjną rolą tego związku.
Przez wiele lat sądzono, że kreatyna występująca w układzie nerwowym jest pochodzenia głównie egzogennego [150]. Wyniki badań opublikowanych w pracach Braissanta i wsp. dowodzą jednak obecności w mózgu enzymów niezbędnych zarówno do syntezy kreatyny jak i jej funkcjonowania, a mianowicie glicynoaminotransferazy i metylotrasferazy guanidynooctowej (ang. guanidinoacetate methyltransferase GAMT) [151, 152]. W oparciu o te wyniki autorzy wspomnianych prac wnioskują, iż kreatyna może być syntetyzowana w mózgu. Mimo to, zmiany przepuszczalności bariery krew-mózg pojawiające się w efekcie pojedynczych lub powtarzających się drgawek [150] mogą mieć wpływ na poziom związków guanidyny, w tym kreatyny i fosfokreatyny, w mózgu [153].
Drugim z przebadanych w ramach niniejszej pracy modeli drgawek był model drgawek rozniecanych elektrycznie. Podobnie jak poprzednio, badania przeprowadzono na szczurach szczepu Wistar. Zachowano tę samą, jak w przypadku modelu pilokarpinowego, procedurę przygotowania preparatów oraz wykonywania pomiarów. Badania przy użyciu ultraszybkiej mikrospektroskopii FTIR dowodzą zachodzenia zmian w strukturze oraz dystrybucji zarówno lipidów jak i protein w preparatach pobranych od zwierząt, u których występowały drgawki rozniecane, w porównianiu do uzyskanych od zwierząt kontrolnych. Odnotowano statystycznie istotny wzrost udziału grup lipidowych ˗CH2 względem ˗CH3
mierzony za pomocą stosunku intensywności pasm odpowiednio ~2925 cm-1 i ~2958 cm-1. Zmiany te wystąpiły w obszarze CA1 w warstwach drobinowej oraz komórek wielokształtnych, w obszarze CA3 w warstwie piramidowej jak również w warstwie drobinowej zakrętu zębatego. Biorąc pod uwagę, iż pasmo ~2925 cm-1 jest najbardziej intensywne w widmie IR fosfolipidów [154], to powyższy paramatr można interpretować jako wskaźnik zmiany długości lub stopnia rozgałęzienia łańcuchów fosfolipidów [123, 124]. Statystycznie istotne okazały się być również różnice w stosunku absorpcji promieniowania IR przez grupy olefinowe =CH (~3012 cm-1) względem grup CH3 (~2958 cm-1). W preparatach pobranych od zwierząt poddanych stymulacji elektrycznej odnotowano statystycznie istotnie mniejszą wartość stosunku absorbancji dla pasm ~3012 cm-1 i ~2958 cm-1 w porównianiu do preparatów kontrolnych w warstwie drobinowej obszaru CA1 i DG jak również w warstwie piramidowej CA3. Co więcej, dla wspomnianych warstw komórkowych w danych obszarach odnotowano również statystycznie istotny spadek absorpcji IR przez wiązania olefinowe =CH w stosunku do absorpcji przez grupy amidowe (3012 cm-1/1660 cm-1). Powyższe rezultaty pozwalają wnioskować, iż przyczyną spadku wartości obydwu analizowanych parametrów (3012 cm-1/2958 cm-1 oraz 3012 cm-1/1660 cm-1) jest spadek intensywności samego pasma olefinowego. Intensywność pasma olefinowego ~3012 cm-1 jest wprost proporcjonalna do zawartości lipidów nienasyconych w tkance [155, 156]. Spadek udziału lipidów nienasyconych może oznaczać zaburzenia w przyswajaniu kluczowych kwasów tłuszczowych: linolowego i linolenowego, z których każdy jest niezbędny do biosyntezy długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (ang. polyunsaturated fatty acids - PUFAs) [157]. Kwasy linolowy i linolenowy nie są syntetyzowane w organizmach ssaków, jedynym ich źródłem jest dieta. Ponieważ zwierzęta z obydwu grup miały tę samą
standaryzowaną dietę, to przyczyny różnej zawartości nienasyconych kwasów tłuszczowych w badanych tkankach należy szukać gdzie indziej. Możliwe jest, że patomechanizmy towarzyszące drgawkom rozniecanym wpłynęły na proces syntezy PUFAs z nienasyconych kwasów tłuszczowych pochodzących z diety lub na proces ich transportu do komórek budujących hipokamp. Przykładem takiej sytuacji jest redukcja aktywności enzymatycznej desaturazy, enzymu budującego wiązanie podwójne między atomami węgla w łańcuchu lipidowym, w chorobie Alzheimera [158].
Niższy niż w kontroli poziom lipidów nienasyconych może być również efektem peroksydacji lipidów, a więc utleniania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Lipidy nienasycone, ze względu na zawartość wiązań podwójnych między atomami węgla, są bardziej narażone na działanie wolnych rodników niż lipidy nasycone. Dowiedziono, że w następstwie drgawek epileptycznych wzrasta w mitochondriach produkcja H2O2, stężenie dialdehydu malonowego i kwasu tiobarbiturowego świądczące o występowaniu peroksydacji lipidów oraz uszkodzeniach mitochondrialnego DNA [159–162]. W artykule autorstwa Sillsa i wsp. [163] dowiedziono, iż zachodzi liniowa zależność między intensywnością pasma olefinowego a stopniem nienasycenia fosfolipidów. W tej samej pracy powiązano rónież spadek intensywności pasma 3012 cm-1 z peroksydacją w błonach komórkowych erytroców. Można zatem przypuszczać, iż w prezentowanym w tej pracy doktorskiej eksperymencie, u zwierząt poddanych procedurze rozniecania drgawek występuje zwiększona, w porównaniu do kontroli, peroksydacja lipidów, głównie w warstwie piramidowej obszaru CA3 oraz drobinowej zakrętu zębatego. Wyniki te korespondują z rezultami przedstawionymi w pracy Mladenovića i wsp. [164], gdzie dla szczurzego modelu drgwek wywołanych przez iniekcję lindanu wykazano istnienie korelacji między intensywnością drgawek a stężeniem dialdehydu malonowego, będącego jednym z produktów peroksydacji lipidów. Spadek absorpcji promieniowania MIR przez związki zawierające wiązania olefinowe odnotowano także w badaniach nad mysim modelem choroby Alzheimera, z tym że porównywano tam wyniki dla obszaru otaczającego hipokamp, utworzonego głównie przez aksony komórek nerwowych [155]. Jednym z mechanizmów obrony przed reaktywnymi formami tlenu (ang. reactive oxygen species ROS) jest reakcja z dysmutazą ponadtlentkową (ang. superoxide dismutase SOD), w wyniku której ROS zostają zneutralizowane do postaci wody lub tlenu cząsteczkowego. W pracy Chen i wsp. [165] wykazano obniżenie stężenia cytoplazmatycznej dysmutazy ponadtlenkowej (SOD-1) w płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów epileptycznych. Co więcej, inne badania dowiodły, że myszy o obniżonym poziomie mitochondrialnej dysmutazy ponadtlenkowej (SOD-2) są bardziej podatne na występowanie neurodegeneracji i śmierci neuronów spowodowanej podaniem kwasu kainowego [166]. Z kolei badania Liang i wsp. [167] wykazały, że dożylne podawanie SOD-1 zwiększa próg podatności na drgawki w szczurzym modelu drgawek wywołanych drażnieniem ciała migdałowatego.
Peroksydacja lipidów jest procesem niepożądanym również dlatego, iż jej produkty prowadzą do modyfikacji struktury protein, która może powodować zaburzenia ich aktywności enzymatycznej [168]. Wyniki omawianego w prezentowanej pracy eksperymentu pokazują, iż w warstwie drobinowej zakrętu zębatego zwierząt poddanych drażnieniu elektrycznemu dochodzi do zmian konformacyjnych protein: zwiększa się udział białek o strukturze β-kartki względem białek o strukturze α-helisy (mierzony jako stosunek absorbancji przy liczbie falowej 1631 cm-1 do absorbancji przy 1657 cm-1). Podobny rezultat uzyskano również w przypadku badań nad pilokarpinowym modelem
9. Dyskusja wyników
drgawek [122]. Patologiczny charakter tego typu zmian w strukturze protein został potwierdzony wieloma badaniami. Wzrost udziału protein o strukturze β-kartki został powiązany z procesami towarzyszącymi chorobom nowotworowym [169, 170] oraz neurodegeneracyjnym [39, 90, 171, 172].
Innym wyjaśnieniem dla spadku zawartości lipidów nienasyconych w hipokampie zwierząt poddanych drażnieniu elektrycznemu może być glejowacenie, a więc nadmierne namnażanie komórek glejowych. Błony komórkowe komórek glejowych zawierają relatywnie mniej lipidów nienasyconych w porównaniu do błon komórkowych neuronów [173]. Co więcej, mogą one produkować wolne rodniki [174, 175]. Jednym z rodzajów komórek glejowych są astrocyty. Ponieważ reaktywne astrocyty były znajdowane w zwiększonej liczbie w ogniskach epileptycznych, to łączono ich obecność z występowaniem drgawek [176, 177]. W badaniach na myszach, u których przez modyfikacje genetyczne wywołano rozpowszechnioną astrogliozę (przerost astrogleju), za pomocą badań elektroencefalograficznych dowiedziono pojawianie się aktywności drgawkowej, czego nie odnotowano u zwierząt kontrolnych [178]. Warto wspomnieć, że w chorobie Alzheimera astrocyty typowo stają się bardziej reaktywne wokół płytek amyloidowych [179]. Z kolei glejowacenie, towarzyszące degeneracji tkanki, zostało zaobserwowane w zakręcie zębatym oraz podkładce u pacjentów cierpiących na tę chorobę [180].
W przeciwieństwie do modelu pilokarpinowego, w preparatach pobranych od zwierząt poddanych rozniecaniu elektrycznemu nie stwierdzono obecności inkluzji kreatynowych. Badania µSRFTIR dowiodły natomiast, iż w hipokampach szczurów drażnionych występuje statystycznie więcej inkluzji zawierających cholesterol w porównaniu do zwierząt kontrolnych. Rozpatrując poszczególne warstwy komórkowe hipokampa zauważyć można, iż różnice w liczbie inkluzji cholesterolowych są istotne dla warstwy komórek drobinowych, a przy podziale hipokampa na obszary – dla sektora 3 rogu Amona. Uzyskane rezultaty ponadto wskazują, iż im dłuższy sumaryczny czas trwania drgawek tonicznych, tym większa liczba inkluzji cholesterolowych w obszarze CA3 jako całości oraz w całej warstwie komórek wielokształtnych. Z kolei skumulowany czas trwania drgawek klonicznych jest skorelowany z liczbą inkluzji cholesterolowych w warstwie drobinowej jak również w całym hipokampie.
Znaczenie cholesterolu w procesach towarzyszących chorobom układu nerwowego jest szeroko badanym tematem. Prace zespołu Alexieia i Natalii Koudinov pokazują, iż cholesterol pełni istotną rolę zarówno w funkcjonowaniu synaps jak i w ich plastyczności [181, 182]. Zaburzenia w homeostazie cholesterolu w mózgu powodują zmiany w funkcjonowaniu receptorów cholinergicznych, jonotropowych i metabotropowych, wzmożoną fosforylację białek tau, zmiany amyloidowe jak również wpływają na reakcje stresu oksydacyjnego w komórkach nerwowych. Autorzy cytowanych prac podejrzewają, że zaburzenia homeostazy cholesterolu są pierwotną przyczyną choroby Alzheimera, chorób nerwowo-mięśniowych, choroby Niemana-Picka jak również zespołu Downa. Pozwala to wyjaśnieć pojawianie się tych samych symptomów neurodegeneracji w różnych schorzeniach neurodegeneracyjnych [182]. Cholesterol ma wpływ również na różne funkcje neuronalne, w tym synaptogenezę oraz uwalnianie neurotransmiterów [183, 184]. Drgawki towarzyszą różnym chorobom związanym z zaburzeniami metabolizmu cholesterolu. Nie ma jednak dowodu wprost wiążącego epilepsję z zaburzeniami metabolizmu cholesterolu. W szczurzym modelu uszkodzeń neuronalnych wywołanych podaniem kwasu kainowego zauważono zwiększony poziom cholesterolu i niektórych
oksysteroli w hipokampie [185]. Badania przedstwione w pracy autorstwa Heverin i wsp. [186], na przykładzie mysiego modelu drgawek wywołanych kwasem kainowym, pokazują, że poziom cholesterolu i 24S-hydroksycholesterolu (24S-OHC) w hipokampie zwierząt eksperymentalnych nie zmienia się do 24h od status epilepticus, a 48h i 336h po SE jest znacząco niższy w porównaniu do zwierząt kontrolnych (poziom 27-OHC był niższy 4h po SE). Cholesterol jest głównym budulcem struktur mózgowych. Aż 25-30% całkowitego cholesterolu znajduje się w mózgu. Cholesterol zawarty w mózgu pochodzi wyłącznie z lokalnej syntezy. Bariera krew-mózg uniemożliwia transport egzogennego cholesterolu do struktur mózgu [187]. Usuwanie nadmiarowego cholesterolu w mózgu odbywa się poprzez jego transport przez lipoproteiny APOE (apolipotroteina E) do płynu mózgowo-rdzeniowego [188] lub konwersję do 24S-hydroksycholesterolu, który jest przepuszczany przez barierę krew-mózg [189]. Taka konwersja zachodzi przy udziale enzymu cytochrom P450 (cholesterol 24-hydroxylase), dlatego ten enzym jest kluczowym czynnikiem determinującym ilość cholesterolu usuwanego z mózgu [190]. Enzym ten występuje wyłącznie w neuronach, w szczególności w komórkach piramidowych oraz interneuronach hipokampa [189, 191]. Prowadzono badania na myszach, gdzie jedną z grup stanowiły osobniki z genetycznie obniżonym poziomem APOE [192]. Porównywano poziom steroli w neuronach, w których występowały włókna neurofibrylarne z ich poziomem w sąsiednich neuronach, w których nie wytworzyły się neurofibryle. Komórkowy niezestryfikowany cholesterol był wyższy w neuronach, w których występowała patologia białek tau, niezależnie od poziomu APOE. Taka relacja występowała niezależnie od obszaru hipokampa czy rodzaju komórek nerwowych. Anomalie w metabolizmie cholesterolu w chorobie Niemana-Picka sugerują, że akumulacja niezestryfikowanego cholesterolu wewnątrz neuronów jest pierwotnym wydarzeniem, które wpływa na formowanie włókien neurofibrylarnych. W neuronach, w których mają miejsce zwłóknienia, występuje wyższy poziom niezestryfikowanego cholesterolu w porównaniu do neuronów bez włókien neurofibrylarnych w chorobie Niemana-Picka [193] i w mózgu pacjentów z chorobą Alzheimera [194]. Co więcej włókna neurofibrylarne pozyskane z mózgów pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera zawierają cholesterol [195], ale proces łączący obecność cholesterolu z tworzeniem włókien neurofibrylarnych jest nieznany.