Identyfikacja i analiza depozytów występujących w hipokampie

Celem tej części pracy doktorskiej było sprawdzenie, czy podobnie jak w przypadku drgawek wywołanych pilokarpiną, również na skutek wielokrotnej stymulacji elektrycznej w hipokampie szczurów pojawiają się depozyty kreatynowe. Badania przeprowadzono na populacji zwierząt drażnionych liczącej 19 osobników i populacji 5-ciu zwierząt kontrolnych. Szczegółowy opis warunków pomiarowych znajduje się w rozdziale 5. Ponownie zdecydowano się na wykonanie map punktowych absorpcji synchrotronowego promieniowania IR z zakresu średniej podczerwieni. Metodologia wyboru punktów pomiarowych oraz ich identyfikacji była taka sama jak w przypadku analogicznych badań nad pilokarpinowym modelem drgawek. Jej opis znajduje się w podrozdziale 7.1.

Na podstawie wyników zaprezentowanych w tabeli 9. można stwierdzić, iż inkluzje kreatynowe nie występują w hipokampie szczurów poddanych stymulacji elektrycznej. Zaobserwowano je natomiast w skrawkach mózgu pobranych od zwierząt kontrolnych. Należy tu jednak podkreślić, iż w większości przypadków agregaty nie występują licznie (od 0 do 4 na cały obszar hipokampa). Tylko w jednym z preparatów odnotowano 111 takich inkluzji. Przyczyny tej anomalii nie są znane.

Tabela 9. Liczba inkluzji kreatynowych w poszczególnych warstwach i obszarach hipokampa przedstawiona za pomocą mediany (z wartościami minimalnymi i maksymalnymi). Przez n oznaczono liczbę preparatów w grupie.

Warstwy komórkowe Obszary hipokampa

Hipokamp wiel. pir. drob. ziar. CA1-CA2 CA3 CA4 H DG

NPS (n=19) Mediana 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Min. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Maks. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 NN (n=5) Mediana 0 0 1 0 0 1 0 1 0 3 Min. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Maks. 41 26 44 0 0 2 31 63 15 111

* NPS – grupa zwierząt poddanych wielokrotnej stymulacji elektrycznej; ** NN - grupa zwierząt kontrolnych.

Widma z zaobserwowanych depozytów nie wykazywały cech widm specyficznych dla kreatyny. Jednak w większości przypadków widma depozytów odznaczały się charakterystycznym kształtem masywu lipidowego 2800–3000 cm-1 oraz pasm występujących przy zakresach liczb falowych 1400-1500 cm-1 i 1300-1400 cm-1. Porównanie uśrednionego widma depozytów z widmami związków chemicznych zawartymi w bibliotekach wbudowanych do programu Omnic 8.0 pozwoliło na zidentyfikowanie głównego związku wchodzącego w skład rozważanych agregatów jako cholesterolu (Rysunek 26).

Rysunek 26. Porównanie widma inkluzji hipokampalnej z próbki NPS z widmem cholesterolu (z bazy widm Sigma Library) oraz z widmem czystej tkanki. Zaznaczono występujące w widmie cholesterolu pasma 1300-1400 cm-1, 1400–1500 cm-1 oraz masyw 2800–3000 cm-1 z charakterystycznym dla cholesterolu kształtem. Porównanie liczby depozytów cholesterolowych obserwowanych dla grup drażnionej i kontrolnej w poszczególnych warstwach komórkowych, obszarach jak i całym hipokampie zostało przedstawione w tabeli 10. oraz na rysunkach 29. i 30., gdzie zaznaczono statystycznie istotne (p<0,05) różnice między badanymi grupami zwierząt.

8. Wyniki badań nad zmianami biochemicznymi i inkluzjami występującymi w hipokampie w modelu drgawek rozniecanych

Tabela 10. Liczba inkluzji cholesterolowych w poszczególnych warstwach i obszarach hipokampa przedstawiona za pomocą mediany (z wartościami minimalnymi i maksymalnymi). Przez n oznaczono liczbę preparatów w grupie.

Warstwy komórkowe Obszary hipokampa

Hipokamp wiel. pir. drob. ziar. CA1-CA2 CA3 CA4 H DG

NPS (n=19) Mediana 1 0 5 0 0 1 0 2 2 8 Min. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Maks. 7 2 35 2 4 12 8 18 12 44 NN (n=5) Mediana 1 0 1 0 0 0 1 0 0 2 Min. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Maks. 1 0 4 0 0 2 2 1 0 5

* NPS – grupa zwierząt poddanych wielokrotnej stymulacji elektrycznej; ** NN - grupa zwierząt kontrolnych;

Wyniki testu U Manna-Whitneya pokazują, iż różnice w liczbie inkluzji cholesterolowych między grupą drażnioną a kontrolną są statystycznie istotne (przy poziomie istotności p<0,05) dla warstwy komórek drobinowych (p=0,02) oraz dla całego hipokampa (p=0,03). Na granicy istotności statystycznej jest wynik uzyskany dla sektora CA3, dla którego poziom istotności miał wartość p=0,048. Wynik ten również został uznany za istotny statystycznie.

Rysunek 27. Porównanie mediany liczby inkluzji cholesterolowych w badanych warstwach komórkowych hipokampa między grupą drażnioną (NPS) i kontrolną (NN). Statystycznie istotne różnice oznaczono strzałkami oraz zamieszczono dla nich wartości obserwowalnego poziomu istotności statystyki U.

Rysunek 28. Porównanie wartości medialnych, minimalnych i maksymalnych liczby inkluzji cholesterolowych w badanych regionach hipokampa między grupą NPS i kontrolną. Statystycznie istotne różnice oznaczono strzałkami oraz zamieszczono dla nich wartości obserwowalnego poziomu istotności statystyki U.

Podobnie jak w przypadku inkluzji kreatynowych pojawiających się w hipokampie zwierząt po podaniu pilokarpiny, również dla zwierząt poddanych wielokrotnej stymulacji elektrycznej sprawdzono, czy występują statystycznie istotne korelacje między liczbą inkluzji zawierających cholesterol a parametrami charakteryzującymi następczą aktywność drgawkową. W tym celu wykonano nieparametryczny test korelacji – test rang Spearmana. Z grupy NPS wyselekcjonowano najpierw osobniki, u których wystąpiły drgawki toniczne i dla nich wykonano analizę korelacji. Badano zależność między liczbą inkluzji cholesterolowych a parametrami opisującymi następcze drgawki toniczne (skumulowana intensywność drgawek tonicznych – CITS, skumulowany czas trwania drgawek tonicznych – CTTS oraz liczba drgawek tonicznych o maksymalnej intensywności występujących w ciągu 21-dniowej obserwacji – MAKSTS). Analogicznie wyodrębniono osobniki, u których wystąpiły następcze drgawki kloniczne i skorelowano liczbę inkluzji cholesterolowych z parametrami opisujacymi ten rodzaj następczej aktywności drgawkowej. Wyniki

8. Wyniki badań nad zmianami biochemicznymi i inkluzjami występującymi w hipokampie w modelu drgawek rozniecanych

uzyskane przy użyciu testu korelacji rang Spearmana wskazują na istnienie zależności pomiędzy liczbą inkluzji a parametrami behawioralnymi, co przedstawiono w tabeli 11. Tabela 11. Współczynniki korelacji rang Spearmana dla poszczególnych warstw komórkowych, regionów oraz całej powierzchni hipokampa dla populacji NPS. Wyniki istotne statystycznie dla p<0,05 zostały zaznaczone przez pogrubienie.

Warstwy komórkowe Obszary hipokampa

Hipokamp wiel. pir. drob. ziar.

CA1-CA2 ^{CA3 CA4 H DG}

CICS 0,18 0,15 0,48 0,23 0,22 0,44 0,08 0,43 0,17 0,44 MAKSCS 0,03 -0,12 0,11 -0,04 0,05 0,08 -0,14 0,28 -0,11 0,08 CTCS 0,33 0,28 0,62 0,33 0,43 0,48 0,12 0,48 0,40 0,60 CITS 0,41 0,07 -0,01 0,10 0,00 0,37 0,35 -0,08 0,21 0,24 MAKSTS 0,26 -0,03 -0,21 0,00 -0,15 0,19 0,26 -0,18 0,00 0,03 CTTS 0,67 0,31 0,33 0,32 0,28 0,61 0,23 0,18 0,52 0,54 * CICS, CITS – skumulowana intensywność drgawek następczych odpowiednio klonicznych lub tonicznych; ** MAKSCS, MAKSTS – liczba drgawek klonicznych lub tonicznych o maksymalnej intensywności w 21-dniowym

okresie obserwacji;

*** CTCS, CTTS, – skumulowany czas trwania drgawek następczych odpowiednio klonicznych lub tonicznych.

Jak wynika z tabeli 11., wraz ze wzrostem sumarycznego czasu trwania drgawek klonicznych rośnie liczba inkluzji w warstwie komórek drobinowych hipokampa. Obserwacja ta występuje również dla całego hipokampa. Z kolei skumulowany czas trwania dragawek tonicznych jest skorelowany z liczbą inkluzji cholesterolowych w warstwie komórek wielokształtnych hipokampa jak również w całym obszarze CA3.