Materiał eksperymentalny został pobrany od osobników płci męskiej szczurów szczepu Wistar. Hodowla zwierząt i preparatyka próbek prowadzona była w Zakładzie Neuroanatomii w Instytucie Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie zgodnie z wytycznymi Komisji Bioetycznej UJ oraz międzynarodowymi standardami. Zwierzęta przebywały w ściśle kontrolowanych warunkach, tj. w stałej temperaturze (20±2 °C), z nieograniczonym dostępem do wody oraz karmy Labofeed. Ich cykl dobowy był podzielony na trwające po 12 h fazy jasną i ciemną. Badania prowadzono na osobnikach dorosłych rozpoczynając eksperymenty w 60-tej dobie ich życia. W obydwu eksperymentach, tj. w eksperymencie dotyczącym pilokarpinowego modelu drgawek oraz w eksperymencie dotyczącym modelu drgawek rozniecanych elektrycznie, z badanej populacji losowo wyodrębniono grupę eksperymentalną i kontrolną. W zależności od badanego modelu procedury postępowania przedstawiały się następująco:
a) Pilokarpinowy model drgawek: Zwierzęta eksperymentalne otrzymały dootrzewnowo skopolaminę w postaci bromku metylu (Sigma S8502) w dawce 1 mg/kg masy ciała, a po 30 minutach pilokarpinę (Sigma P6503) w dawce 300 mg/kg masy ciała. Skopolamina została podana w celu zredukowania obwodowych efektów działania pilokarpiny. Szczurom z grupy kontrolnej wstrzyknięto w tym czasie sól fizjologiczną, aby wyeliminować wpływ samej iniekcji na uzyskane wyniki. Od podania pilokarpiny lub soli fizjologicznej zwierzęta przez 6 godzin były poddawane obserwacjom, w trakcie których rejestrowano następujące parametry: czas wystąpienia pierwszego napadu drgawkowego (T1), maksymalną intensywność drgawek (MAKS) oraz czas trwanie aktywności napadowej (T). Intensywność drgawek oceniana była wg sześciostopniowej zmodyfikowanej skali Racine’a, gdzie: 0-brak symptomów; 0,5-znieruchomienie, ślinienie, zwężenie oczu, drżenie pyska, pocieranie uszu; 1-kiwanie głową i ruchy żujące; 1,5-drgawki kloniczne przedramion i umiarkowane drgawki całego ciała, agresywne zachowania, wytrzeszcz oczu; 2,0– wstawanie i bieganie, silne ruchy toniczno-klonicznyme obejmujące kończyny tylnie i ogon, szczękościsk i nadciśnienie; 2,5–wstawanie i upadanie, przekrwienie oczu; 3,0–utrata postawy ze sztywnością całego ciała [118]. Po 6h (faza ostra) lub 72h (faza latencji) od podania pilokarpiny zwierzęta ze wszystkich grup perfundowano roztworem soli fizjologicznej o wysokim stopniu czystości analitycznej. Do analiz spektroskopowych pobrano preparaty od 10 szczurów w fazie ostrej modelu, od 5 osobników w fazie latencji oraz 6 kontrolnych.
b) Model drgawek rozniecanych elektrycznie: Od 60-tego dnia życia szczury z grupy drażnionej codziennie przez 21 dni były poddawane przez 1 sekundę działaniu sinusoidalnego prądu elektrycznego o natężeniu 10 mA i częstotliwości 60 Hz. Prąd był podawany raz dziennie o stałej porze przez parę usznych elektrod Rodent Shocker RS typu 221 (Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH, Niemcy). Po każdej stymulacji przez 1 godzinę szczury obserwowano pod kątem występowania następczych drgawek tonicznych i klonicznych. Do rejestrowanych codziennie parametrów behawioralnych należały intensywność drgawek tonicznych i klonicznych oraz czas trwania drgawek. Intensywność drgawek tonicznych, objawiających się silnym skurczem mięśni całego ciała, była oceniana wg skali
czterostopniowej od 0 do 3 (0-brak drgawek, 1-skurcze mięśni kończyn przednich, 2-pełne skurcze mięśni kończyn przednich z częściowymi skurczami mięśni kończyn tylnych, 3-pełne skurcze mięśni kończyn tylnych oraz ogona). Intensywność drgawek klonicznych, a więc uogólnionych drgawek całego ciała, była oceniana, tak jak w przypadku pilokarpinowego modelu drgawek, wg zmodyfikowanej skali Racine’a, opisanej powyżej. Po 21 dniach stymulacji wyznaczono sumaryczne wartości obserwowanych parametrów, a więc skumulowaną intensywność drgawek tonicznych i klonicznych (odpowiednio CITS i CICS), skumulowany czas trwania drgawek obu typów (CTTS i CTCS) oraz liczbę drgawek o maksymalnej intensywności (MAKSTS i MAKSCS). Po zakończeniu eksperymentu szczury zostały uśpione, a następnie poddano je perfuzji roztworem soli fizjologicznej. Przebadano 19 zwierząt z grupy eksperymentalnej oraz 5 z grupy kontrolnej.
Protokół przygotowania preparatów do badań spektroskopowych wyglądał podobnie dla obydwu rozpatrywanych eksperymentów. Wyjęte z czaszek mózgi zamrażono w ciekłym azocie, by następnie przy użyciu mikrotomu mrożeniowego pociąć je na skrawki o grubości 10 µm (w badaniach modelu pilokarpinowego) lub 12 µm (w badaniach modelu drgawek rozniecanych). W omawianych eksperymentach wykorzystano skrawki zawierające grzbietową część hipokampa. Z każdego mózgu pobrano jeden skrawek do badań FTIR, a sąsiadujące z nim skrawki przeznaczono do badań histologicznych oraz do badań pierwiastkowych przy użyciu fluorescencji rentgenowskiej (nie stanowiących przedmiotu prezentowanej rozprawy). Preparaty przeznaczone do mikrospektroskopii w podczerwieni umieszczono na szklanych slajdach MirrIR firmy Kevley, pokrytych warstwą metalu Ag/SnO2, dedykowanych do pracy w trybie transmisyjno-odbiciowym. Tak przygotowane próbki przechowywano do czasu pomiarów w temperaturze -70°C.
Ograniczenia oprogramowania Atlus Omnic, którym dysponowano w trakcie wykonywania badań spektroskopowych, nie pozwalały na wykonanie dla pojedynczego preparatu jednej dużej mapy punktowej pokrywającej całą powierzchnię hipokampa w próbce. W badaniach mających na celu identyfikację i ocenę liczności agregatów występujących w hipokampie w eksperymencie z pilokarpinowym modelem drgawek, na każdym badanym hipokampie wyznaczono 4 prostokątne sektory. Umownie przypisano im nazwy związane z obszarami anatomicznymi hipokampa właściwego lub zakrętu zębatego zajmującymi największą powierzchnię w danym sektorze, to jest CA1-CA2, CA3, CA4-H, DG (rysunek 11). W badaniach z modelem drgawek rozniecanych, wyodrębniono 5 sektorów: CA1-CA2, CA3, CA4, H (linie przerywane na rysunku 11.) oraz DG.
4. Materiał badawczy
Rysunek 11. Obraz mikroskopowy hipokampa szczura. Białe prostokątne ramki określają obszary, dla których wykonano mapy punktowe. Nazwy map (CA1-CA2, CA3, CA4-H, DG) pochodzą od nazw anatomicznych regionów hipokampa, które dominują na danej mapie. Przerywanymi liniami oznaczono obszary map CA4 i H, które badano oddzielnie w eksperymencie dotyczącym modelu drgawek rozniecanych. Na rysunku zaznaczono także warstwy komórkowe hipokampa: piramidową (pir.), ziarnistą (ziar.), drobinową (drob.) i warstwę komórek wielokształtnych (wiel.). Czerwonymi strzałkami zaznaczono niektóre z badanych inkluzji.
W badaniach zmian biochemicznych zachodzących w hipokampie szczura na skutek drgawek wywołanych drażnieniem elektrycznym, ze względu na ograniczenia czasowe i sprzętowe, nie było możliwości wykonania map sumarycznie pokrywających cały obszar hipokampa. Z tego względu dla każdego z badanych preparatów zebrano po 3 mapy dwuwymiarowe reprezentujące obszary CA1 i CA3 hipokampa właściwego oraz zakręt zębaty.