Index of /rozprawy2/11600

Pełen tekst

(1)Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej Akademia Górniczo-Hutnicza im. Stanisława Staszica w Krakowie. ROZPRAWA DOKTORSKA. mgr inż. Justyna Kutorasińska Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. Promotor:. dr hab. inż. Joanna Chwiej, prof. AGH. Praca zrealizowana w Katedrze Fizyki Medycznej i Biofizyki, WFiIS, AGH. Kraków 2019 r..

(2) 2.

(3) Oświadczenie autora rozprawy: Oświadczam, świadoma odpowiedzialności karnej za poświadczenie nieprawdy, że niniejszą pracę doktorską wykonałam osobiście i samodzielnie oraz że nie korzystałam ze źródeł innych niż wymienione w pracy.. …………………………………………………………… data, podpis autora. Oświadczenie promotora rozprawy: Niniejsza rozprawa jest gotowa do oceny przez recenzentów.. …………………………………………………………… data, podpis promotora. 3.

(4) Podziękowania Pragnę serdecznie podziękować dr hab. inż. Joannie Chwiej, prof. AGH, oraz prof. dr hab. inż. Wojciechowi Łużnemu za stworzenie warunków do realizacji niniejszej pracy doktorskiej, kierownictwo naukowe, poświęcony czas oraz okazaną życzliwość. Dziękuję pracownikom i doktorantom Zakładu Neuroanatomii Instytutu Zoologii i Badań Biomedycznych Uniwersytetu Jagiellońskiego za przygotowanie i udzielenie preparatów do badań oraz pracownikom linii pomiarowej SMIS synchrotronu SOLEIL (Gif-sur-Yvette, Francja) za nieodzowną pomoc i rady przy wykonywaniu pomiarów. Prof. dr hab. Henrykowi Figlowi dziękuję za ciepłe przyjęcie w Zespole Obrazowania i Modelowania Katedry Fizyki Medycznej i Biofizyki, WFiIS AGH w Krakowie. Mężowi - za czas i cierpliwość. Przedstawiona praca doktorska została zrealizowana jako część projektu IUVENTUS PLUS nr JP2010005370 finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego oraz projektu nr 2921/B/T02/2011/40 finansowanego przez Narodowe Centrum Nauki.. 4.

(5) SPIS TREŚCI. INDEKS SKRÓTÓW................................................................................................................................................7 STRESZCZENIE .......................................................................................................................................................9 ABSTRACT ............................................................................................................................................................. 11 1.. WPROWADZENIE DO EPILEPSJI...................................................................................................... 13. 1.1.. Epilepsja i epileptogeneza ............................................................................................................ 13. 1.2.. Wybrane zwierzęce modele drgawek ..................................................................................... 14. 1.3.. Hipokamp – budowa i funkcje .................................................................................................... 16. 2.. WPROWADZENIE TEORETYCZNE DO SPEKTROSKOPII OSCYLACYJNEJ ....................... 19. 2.1.. Podstawy fizyczne spektroskopii oscylacyjnej .................................................................... 19. 2.2.. Podstawowe elementy spektrometru IR ............................................................................... 29. 2.3.. Charakterystyka spektroskopowa głównych makromolekuł biologicznych .......... 34. 2.4.. Zalety i wady transmisyjno-odbicowej mikrospektroskopii FTIR .............................. 36. 3.. MOTYWACJA I CEL PRACY ................................................................................................................. 41. 4.. MATERIAŁ BADAWCZY ....................................................................................................................... 43. 5.. APARATURA I WARUNKI POMIAROWE ....................................................................................... 47. 6.. PRZYGOTOWANIE DANYCH DO ANALIZY ................................................................................... 49. 6.1.. Sprawdzenie grubości preparatów .......................................................................................... 49. 6.2.. Analiza danych pod kątem występowania efektów zakłócających ............................. 51. 6.3.. Opis analizowanych parametrów spektroskopowych ..................................................... 55. 7.. WYNIKI BADAŃ NAD INKLUZJAMI WYSTĘPUJĄCYMI W HIPOKAMPIE W PILOKARPINOWYM MODELU DRGAWEK .............................................................................. 57. 7.1.. Identyfikacja inkluzji występujących w hipokampie ........................................................ 57. 7.2.. Porównanie liczby inkluzji kreatynowych w hipokampie w badanych grupach zwierząt................................................................................................................................................ 60. 7.3.. Korelacja liczby inkluzji kreatynowych z parametrami behawioralnymi................ 64. 8.. WYNIKI BADAŃ NAD ZMIANAMI BIOCHEMICZNYMI I INKLUZJAMI WYSTĘPUJĄCYMI W HIPOKAMPIE W MODELU DRGAWEK ROZNIECANYCH .................................................. 67. 8.1.. Ocena zmian w dystrybucji i strukturze biomolekuł ........................................................ 67. 8.2.. Korelacje zmian biochemicznych z parametrami behawioralnymi ............................ 70. 8.3.. Identyfikacja i analiza depozytów występujących w hipokampie............................... 73. 9.. DYSKUSJA WYNIKÓW .......................................................................................................................... 79. 10.. WNIOSKI .................................................................................................................................................... 85. ANEKS ………………………………………………………………………………………………………………………..87 BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................................................... 98. 5.

(6) Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. 6.

(7) INDEKS SKRÓTÓW µRS µSRFTIR. -. µUFFTIR. -. CA1-CA4 CICS CITS CS CTCS CTTS DG drob. EFSW. -. EM EMSC. -. H ILAE. -. IR j.w. MAKS MAKSCS MAKSTS MIR. -. NN NPS OUN p pir. PUFAs. -. RMieS SE SE6H SE72H SUB T T1. -. mikrospektroskopia Ramana (ang. Raman microspectroscopy); synchrotronowa mikrospektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (ang. synchrotron radiation Fourier transform infrared microspectroscopy); ultraszybka mikrospektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (ang. ultra-fast Fourier transform infrared microspectroscopy); sektory 1-4 rogu Amona (łac. Cornu Ammonis); skumulowana intensywność drgawek klonicznych [j.w.]; skumulowana intensywność drgawek tonicznych [j.w.]; drgawki kloniczne (ang. clonic seizures); skumulowany czas trwania drgawek klonicznych [s]; skumulowany czas trwania drgawek tonicznych [s]; zakręt zębaty (ang. dentate gyrus); warstwa drobinowa; efekt elektrycznej fali stojącej (ang. electric field standing wave effect); promieniowanie elektromagnetyczne; multiplikatywna korekcja sygnału (ang. Extended Multiplicative Signal Correction); wnęka zakrętu zębatego (ang. hilus of DG); Międzynarodowa Liga ds. Walki z Padaczką (ang. International League Against Epilepsy); promieniowanie podczerwone (ang. infrared radiation); jednostki względne; maksymalna intensywność drgawek [j.w.]; liczba drgawek klonicznych o maksymalnej intensywności; liczba drgawek tonicznych o maksymalnej intensywności; promieniowanie podczerwone z zakresu średniej podczerwieni (ang. middle infrared radiation); populacja kontrolna; populacja modelu drgawek rozniecanych; ośrodkowy układ nerwowy; obserwowalny poziom istotności; warstwa piramidowa; wielonienasycone kwasy tłuszczowe (ang. polyunsaturated fatty acids); rezonansowe rozproszenie Mie’go (ang. resonant Mie scattering); stan padaczkowy (ang. status epilepticus); populacja fazy ostrej modelu pilokarpinowego; populacja fazy latencji modelu pilokarpinowego; podkładka (ang. subiculum) całkowity czas trwanie aktywności napadowej [s]; czas wystąpienia pierwszego napadu drgawkowego [s]; 7.

(8) Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. TLE TS wiel. ziar.. 8. -. epilepsja płata skroniowego (ang. temporal lobe epilepsy); drgawki toniczne (ang. tonic seizures); warstwa komórek wielokształtnych; warstwa ziarnista..

(9) STRESZCZENIE Już od lat 40-tych XX wieku w analizach próbek biologicznych stosuje się spektroskopię w podczerwieni, należącą do grupy metod spektroskopii wibracyjnej [1, 2]. Pierwsze badania przy użyciu tej techniki polegały na rozpoznawaniu widm wyizolowanych związków organicznych. Dzięki ich wynikom dziś dysponujemy bogatą biblioteką widm umożliwiającą identyfikację biomolekuł oraz rozpoznanie zmian w nich zachodzących. Dynamiczny rozwój instrumentów badawczych, a w szczególności zastosowanie interferometru oraz transformacji Fouriera w analizie rejestrowanego sygnału, pozwolił na znaczne skrócenie czasu pomiaru pojedynczego widma [3]. Skrócenie czasu pomiaru natomiast umożliwiło opracowanie mikrospektroskopii FTIR (ang. Fourier transform infrared mictrospectroscopy), będącej techniką obrazowania chemicznego, łączącą cechy mikroskopii optycznej oraz spektroskopii wibracyjnej. Główną zaletą mikrospektroskopii FTIR jest to, iż zarówno morfologiczne jak i molekularne cechy badanych tkanek mogą być obserwowane bez użycia barwników, znaczników czy utrwalaczy [4]. Dlatego też mikrospektroskopia FTIR znajduje szerokie zastosowanie zarówno w badaniach podstawowych [5–8] jak i jako narzędzie diagnostyczne [9–12]. Rozwój mikrospektroskopi FTIR przebiegał dwutorowo. Celem pierwszego z podejść było umożliwienie obrazowania struktur biologicznych na poziomie subkomórkowym. Konieczna tu była poprawa jakości widm uzyskiwanych przy niewielkim, rzędu mikromerów, przekroju poprzecznym wiązki promieniowania podczerwonego. Ten cel udało się osiągnąć dzięki zastosowaniu synchrotronowego źródła IR (metoda µSRFTIR – ang. Synchrotron Radiation Fourier Transform Infrared Microspectroscopy). Wysoka jasność synchrotonowej wiązki IR przyczynia się do uzyskania wyższej, w porównaniu do tradycyjnych źródeł IR, wartości stosunku sygnału do szumu dla rejestrowanych widm. Jest to niezwykle istotne w badaniach subtelnych zmian w strukturze związków biochemicznych [13, 14]. Z kolei tam, gdzie obrazowanie FTIR tkanek ma ułatwić pracę histopatologów i przyspieszyć postawienie diagnozy, nacisk kładzie się na szybkie obrazowanie możliwie dużych fragmentów tkanek. Zastosowanie detektorów FPA (ang. focal plane array) umożliwiło rozwój ultraszybkiej mikrospektroskopii FTIR (µUFFTIR ang. Ultrafast Fourier Transform Infrared Microspectroscopy) z konwencjonalnym źródłem promieniowania IR, pozwalającej na obrazowanie dużych obszarów tkanki w relatywnie krótkim czasie przy zachowaniu zadowalającej rozdzielczości przestrzennej (5-20 µm) i dobrej jakości rejestrowanych widm IR [15, 16]. Celem prezentowanej rozprawy była jakościowa oraz półilościowa analiza zmian biochemicznych występujących w hipokampie dorosłych szczurów w różnych modelach drgawek, to jest w pilokarpinowym modelu po stanie epileptycznym (łac. post status epilepticus) oraz w modelu drgawek rozniecanych elektrycznie. Jako główne metody pomiarowe zastosowano synchrotronową mikrospektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera oraz ultraszybką mikrospektroskopię FTIR. Dodatkowo wykonano pomiary przy użyciu mikrospektroskopii Ramana. Wszystkie badania przeprowadzono na linii pomiarowej SMIS synchrotronu SOLEIL.. 9.

(10) Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. Uzyskane rezultaty pokazały, że na skutek drgawek wywołanych pilokarpiną rośnie liczba inkluzji kreatynowych w hipokampie szczura. Statystyczna analiza korelacji dowodzi, że liczba tych inkluzji rośnie wraz z całkowitym czasem trwania aktywności drgawkowej. Kolejnym krokiem było przebadanie preparatów pobranych po zakończeniu widocznej aktywności drgawkowej, w tak zwanej fazie latencji po podaniu pilokarpiny. Wyniki tego eksperymentu wskazują, że akumulacja kreatyny jest efektem trwałym. Co więcej, liczba inkluzji zarejestrowanych w okresie latencji jest znacząco większa w porównaniu do fazy ostrej. W przeciwieństwie do modelu pilokarpinowego, w modelu drgawek rozniecanych elektrycznie nie odnotowano występowania agregatów kreatynowych. Jednakże w preparatach pobranych od zwierząt z tej grupy zarejestrowano występowanie licznych inkluzji zawierających cholesterol, a ich liczba była skorelowana ze skumulowanym czasem trwania następczych drgawek tonicznych (w obszarze CA3) i klonicznych (w całym hipokampie). Dla modelu drgawek rozniecanych dowiedziono również występowania zmian drugorzędowej struktury protein oraz zmian strukturalnych lipidów w hipokampie, co zostało już poprzednio zaobserowane dla pilokarpinowego modelu drgawek.. 10.

(11) ABSTRACT The infrared spectroscopy has been used for analysis of biological samples for almost 80 years [1, 2]. The goal of the first studies using this method was the recognition of isolated chemical substances. Thanks to the results of these studies, libraries of biochemical spectra are commonly available today, which allows identification of substances and changes occurring in their chemical structure. Dynamic development of scientific instrumentation, using of interferometer and Fourier transformation in analysis of detected signal in particular, allows reduced time of single spectra registration [3]. This was the first step that allowed the development of Fourier transform microspectroscopy (µFTIR). The µFTIR is a chemical imaging technique, combining features of optical microscopy and vibrational spectroscopy. The main advantage of microspectroscopy FTIR is no neccessity of using stains or markers during a sample preparation [4]. For these reasons the microspectroscopy FTIR is widely used for basic reaserches [5–8] and also as a diagnostic tool [9–12]. There were two ways of µFTIR development. The aim of the first one was imaging of biological structures on a subcellular level. High brightness of synchrotron beamlight allows achieving high quality of spectra even with IR beamlight reduced to a few μm diameter. In that case the signal to noice ratio is higher than for traditional sources of IR, what allows detection of subtle changes in structure of biomolecules [13, 14]. The aim of the second concept of µFTIR development was reducing time of measurements of relatively big tissues’ sections, which is necessary for histopathological reaserches. The solution to this requirement was using FPA (focal plane array) detectors, allowing the ultrafast Fourier transform microscpectroscopy (µUFFTIR) to develop [15, 16]. The aim of the presented thesis was qualitative and semi-quantitative analysis of biochemical changes occurring within hippocampus in the two rat models of epilepsy, which were pilocarpine post status epilepticus and kindling model with electrically involved seizures. The FTIR microspectroscopy with synchrotron source of radiation and ultrafast FTIR microspectroscopy with traditional source of IR were used for the study. The Raman microspectroscopy was used as an additional technique. Measurements were done at SMIS beamline of SOLEIL synchrotron. The results of presented studies show an increased frequency of creatine inclusions in rat hippocampus from the pilocarpine-induced status epilepticus and positive correlation between their quantity and the total time of seizure activity. The study with the following status epilepticus latent phase suggests that aggregation of creatine is a permanent. Furthermore, the number of observed aggregates is even higher in the latent than in the acute phase of pilocarpine model of seizures. The research with a kindling model of epilepsy did not prove creatine aggregation. However numerous deposits containing cholesterol were observed after electrically involved seizures there. The number of these deposits within hippocampus was correlated with the cumulative time of clonic seizures duration. Also the number of deposits within the third part of Ammons horn was correlated with cumulative time of tonic seizures. As in the case of pilocarpine-induced seizures, the structural changes of proteins and lipids were also identified after repetitive electrical stimulation. 11.


(13) 1. WPROWADZENIE DO EPILEPSJI Celem rozdziału jest przedstwienie najważniejszych, w odniesieniu do tematu prezentowanej pracy, informacji dotyczących epilepsji, a więc jej definicji i genezy, oraz uzasadnienie stosowania zwierzęcych modeli schorzenia. W rozdziale tym również zostały pokrótce opisane wykorzystane w pracy zwierzęce modele drgawek. Ostatni podrozdział stanowi opis hipokampa, jako struktury, dla której przeprowadzono badania spektroskopowe opisane w rozdziałach 7. i 8. niniejszej rozprawy doktorskiej.. 1.1. Epilepsja i epileptogeneza Istotą epilepsji są powtarzające się zaburzenia czynności mózgu, polegające na samorzutnych i zsynchronizowanych wyładowaniach bioelektrycznych w dużych grupach neuronów [17]. Przypuszcza się, że co najmniej 10% ludzi doświadczyło lub doświadczy pojedynczego napadu drgawkowego [18, 19]. Drgawki mogą pojawić się w następstwie urazów głowy, nowotworów mózgu, chorób naczyń krwionośnych ośrodkowego układu nerwowego (OUN), zakażeń OUN, chorób zwyrodnieniowych i demielinizacyjnych, jednak w ponad 70% przypadków ich etiologia pozostaje nieznana [20–22]. Oficjalny raport Międzynarodowej Ligi ds. Walki z Padaczką (ang. International Ligue Against Epilepsy - ILAE) z 2014 r. definiuje epilepsję jako zaburzenie w funkcjonowaniu mózgu, polegające na trwałej predyspozycji do generowania drgawek epileptycznych oraz występowaniu neurobiologicznych, poznawczych, psychologicznych i społecznych konsekwencji takiego stanu [19]. Zgodnie z obowiązującymi wytycznymi ILAE, kliniczna diagnoza epilepsji może zostać postawiona, gdy spełniony jest co najmniej jeden z poniższych warunków [19]: 1) wystąpiły co najmniej dwa spontaniczne lub odruchowe napady drgawkowe w odstępie czasowym większym niż 24 h; 2) wystąpił jeden spontaniczny lub odruchowy napad drgawkowy, a prawdopodobieństwo kolejnych napadów jest zbliżone do ogólnego ryzyka nawrotu aktywności drgawkowej (przynajmniej 60%) po dwóch spontanicznych napadach, występujących w ciągu kolejnych 10 lat; 3) zdiagnozowano zespół padaczkowy. Podstawowa klasyfikacja napadów padaczkowych rozróżnia napady o pochodzeniu uogólnionym, ogniskowym oraz napady o nieznanym początku (ang. unknown onset) [23]. Cechą charakterystyczną klinicznych napadów uogólnionych jest jednoczasowe1 występowanie wyładowań komórkowych w całym mózgowiu. O napadach ogniskowych mówimy wtedy, gdy aktywność napadowa występuje w pewnej części mózgu – ognisku padaczkowym, następnie zanika lub rozprzestrzenia się na całe mózgowie powodując kliniczny napad padaczkowy wtórnie uogólniony [24]. Do napadów o nieznanym początku zalicza się wszystkie te przypadki, w których nie jest możliwe określenie czy są to napady. Przyjmuje się, że czas pomiędzy wyładowaniami w kolejnych lokalizacjach powinien być nie dłuższy niż 8 milisekund. 1. 13.

(14) Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. uogólnione czy ogniskowe [23]. Objawy kliniczne napadu uwarunkowane są m.in. przez lokalizację czynnościowo-anatomiczną ogniska padaczkorodnego. W znacznej liczbie przypadków ognisko padaczkorode powstaje w strukturach płata skroniowego, dlatego padaczka płata skroniowego (ang. temporal lobe epilepsy – TLE) jest często przedmiotem badań doświadczalnych [18]. Ten typ padaczki cechuje się największym stopniem lekooporności [i]. Oprócz typowych drgawek tonicznych, klonicznych lub tonicznoklonicznych, symptomem pojawienia się aktywności drgawkowej w TLE mogą być m. in. utrata świadomości, utrata przytomności, zaburzenia percepcji, halucynacje czy dysfazja [18]. Powtarzającym się napadom drgawowym często towarzyszą zmiany anatomopatologiczne uwidaczniające się głównie w strukturach hipokampa i ciała migdałowatego [25–27]. Stwardnienie hipokampa, na które składają się utrata neuronów przy jednoczesnym przeroście astrogleju, obserwowane było zarówno w preparatach pobranych od pacjentów epileptycznych [28, 29] jak i w preparatach pobranych od zwierząt, u których wywołano drgawki [30, 31]. Utrata neuronów, głównie w obszarach CA1 i CA3 rogu Amona, może nastąpić już po pierwszym epizodzie drgawkowym [32]. Jedne z najnowszych badań, prowadzonych przy użyciu dwóch modeli padaczki pourazowej, dowodzą również utraty interneuronów w hipokampie [33]. Badania biochemiczne wskazują, iż wrażliwość neuronów CA1 na uszkodzenia jest pozytywnie skorelowana z aktywnością glikolityczną oraz zapotrzebowaniem na tlen danej populacji neuronów [24, 34], a już po pierwszych drgawkach następuje znaczący wzrost zużycia glukozy oraz wzrost metabolizmu w mózgu [35, 36]. Proces epileptogenezy wykazuje cechy neurodegeneracji. Wspólnym czynnikiem chorób neurodegeneracyjnych, jak np. choroba Alzheimera czy Parkinsona, oraz epilepsji właśnie, jest występowanie stresu oksydacyjnego [37–43]. Badania na zwierzętach potwierdzają, że konsekwencją wystąpienia pierwszego epizodu napadowego jest generacja stresu oksydacyjnego i związanych z nim dysfunkcji mitochondriów [44–46]. Z kolei wolne rodniki hydroksylowe, powstające m.in. w wyniku reakcji nadtlenku wodoru H2O2 z jonami Cu2+ oraz Fe2+ (reakcja Fentona) [47], łatwo utleniają proteiny, lipidy i DNA, co może prowadzić do zaburzenia funkcji białek, przepuszczalności błon komórkowych oraz ekspresji genów [48]. Powyższe zjawiska mogą wpływać na zwiększenie pobudliwości neuronów oraz obniżenie progu drgawkowego [48]. Zmiany w akumulacji pierwiastków takich jak Ca, Zn i Fe, były obserwowane w hipokampie w zwierzęcym pilokarpinowym modelu drgawek [49–52], jak również w krwi pacjentów epileptycznych [42].. 1.2. Wybrane zwierzęce modele drgawek Postęp w odkrywaniu tajemnic epilepsji niewąpliwie zawdzięczamy pracom badawczym wykorzystującym zwierzęce modele drgawek. Stosuje się je zarówno w celu opracowania nowych leków przeciwdrgawkowych, jak i do obserwacji procesów zachodzących w okresie epileptogenezy [17, 18]. Przyjmuje się, że optymalny eksperymentalny model drgawek epileptycznech powinien spełniać następujące warunki [17]: 1) warunek podobieństwa objawów; 2) warunek przewidywalności reakcji na leczenie; 3) warunek podobieństwa patomechanizmów. 14.

(15) 1. Wprowadzenie do epilepsji. Wśród zwierzęcych modeli drgawek wyróżnić można modele tzw. po stanie padaczkowym (łac. post status epilepticus) oraz modele drgawek rozniecanych. W pierwszej z wymienionych grup modeli stan padaczkowy2 wywołuje się poprzez podanie substancji o właściwościach prodrgawkowych, jak np. kwas kainowy, pilokarpina, lit + pilokarpina. Charakterystyczną cechą modeli po stanie padaczkowym jest występowanie kolejno [18, 53] : 1) fazy ostrej – okres obejmujący status epilepticus, trwa do kilku godzin od podania konwulsanta; 2) fazy latencji – okres epileptogenezy trawający ok. 1-2 tygodnie, podczas którego nie pojawiają się drgawki epileptyczne; 3) fazy chronicznej – cechuje się występowaniem samoistnych napadów drgawkowych z częstotliwością 2-3 razy w ciągu tygodnia. Cechą charakterystyczną modelu po stanie padaczkowym jest tzw. stwardnienie hipokampa polegające na dezorganizacji cytoarchitektonicznej i obumieraniu neuronów piramidowych [18, 54]. Liczne publikacje naukowe sugerują, iż zmiany te przypominają nieprawidłowości w obszarach płata skroniowego obserwowane u pacjentów cierpiących na TLE [53, 55–59]. Istotą modeli drgawek rozniecanych, zwanych też modelami kindlingu, jest przewlekła ekspozycja na podprogowy bodziec pobudzający (chemiczny lub elektryczny) o charakterze prodrgawkowym [53]. Wskutek trwającej 1-3 tygodni stymulacji elektrycznej struktur układu limbicznego lub wielokrotnego podania substancji drgawkotwórczej dochodzi do obniżenia progu drgawkowego i pojawienia sie napadów o stopniowo wzrastającym nasileniu i czasie trwania (Rysunek 1) [18, 53]. Wystąpienie drgwek samoistnych w tym modelu jest nieczęstym zjawiskiem, z tego względu to drgawki rozniecane są zazwyczaj przedmiotem badań. Sam charakter rejestrowanych drgawek jak i ich wrażliwość na farmaceutyki są bardzo zbliżone w modelach post status epilepticus oraz modelach drgawek rozniecanych [18, 53]. W tych drugich natomiast nie odnotowuje się typowych dla TLE zmian neuropatologicznych, takich jak np. stwardnienie struktury hipokampa [60, 61]. W mózgach szczurów poddanych wielokrotnej stymulacji występuje jednak ubytek interneuronów we wnętrzu zakrętu zębatego [60, 62].. Za stan padaczkowy (łac. status epilepticus) uważa się napad drgawkowy trwający co najmniej 30 min. lub występującą w tym czasie serię napadów, między którymi chory nie odzyskuje świadomości [20]. 2. 15.

(16) Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. Rysunek 1. Poglądowe porównanie intensywności i częstości występowania drgawek w modelach po stanie padaczkowym i drgawek rozniecanych. Czerwone strzałki oznaczają bodziec pobudzający (jednokrotną iniekcję np. pilokarpiny w modelach po stanie padaczkowym lub powtarzającą się stymulację np. elektryczną w modelach drgawek rozniecanych), wg [18].. 1.3. Hipokamp – budowa i funkcje Hipokamp, wraz z ciałem migdałowatym i korą śródwęchową, wchodzi w skład układu limbicznego odpowiedzialnego za kierowanie popędami, emocjami oraz mechanizmami związanymi z pamięcią. W budowie hipokampa można wyróżnić zakręt zębaty (ang. dentate gyrus - DG), hipokamp właściwy i podkładkę (łac. subiculum - SUB). Hipokamp właściwy zwany jest też rogiem Amona (łac. cornu Ammonis - CA). Można w nim wyodrębnić cztery odcinki (od CA1 do CA4). Podział rogu Amona na poszczególne sektory został ustalony w oparciu o rozmieszczenie i budowę neuronów piramidowych. Neurony te charakteryzują się relatywnie dużymi jądrami komórkowymi, dzięki czemu są dość dobrze widoczne w obrazie mikroskopowym nawet niebarwionych preparatów [63]. Neurony piramidowe cechują się zwiększoną aktywnością glikolityczną (liczbą reakcji glikolitycznych) [24]. Spośród obszarów rogu Amona, to w obszarze CA1 warstwa piramidowa jest najgrubsza, a sam sektor wykazuje bardzo dużą wrażliwość na niedokrwienie. W obszarze CA2 warstwa piramidowa zbudowana jest ze stosunkowo dużych neuronów, jednak ułożonych w postaci cienkiej warstwy. Pole CA3 charakteryzuje się największą odpornością na niedokrwienie. Sektor CA4 nie zawsze jest wyodrębniany, gdyż określenie granicy między CA3 i CA4 oraz CA4 i DG nie jest jednoznaczne [63, 64]. W niniejszej pracy przyjęto, iż termin hipokamp oznaczać będzie hipokamp właściwy wraz z zakrętem zębatym. Dla uproszczenia pominięta tu została podkładka, gdyż nie stanowiła ona przedmiotu badań. Dla obszaru między CA4 a DG przyjęto termin wnęka zakrętu zębatego (hillus – H). Poszczególne obszary hipokampa wraz z przyjętym w pracy oznaczeniem warstw komórkomych budujących tę strukturę zaprezentowano na rysunku 2. 16.

(17) 1. Wprowadzenie do epilepsji. Rysunek 2. Obraz mikroskopowy hipokampa szczura z zaznaczonymi regionami hipokampa właściwego (CA1CA4), zakrętem zębatym (DG) i jego wnęką (H) oraz podkładką (SUB). Kolorem czerwonym zaznaczono przechodzącą przez CA warstwę piramidową (pir.) a żółtym warstwę ziarnistą (ziar.) w DG. Na zewnątrz CA znajduje się warstwa komórek wielokształtnych (wiel.), która wyściela również wnętrze zakrętu zębatego. Wewnętrzną warstwą hipokampa właściwego i zewnętrzną DG jest warstwa drobinowa (drob.). Podział na sektory zaznaczony na rysunku ma charakter poglądowy.. Wnętrze hipokampa tworzy ubogokomórkowa warstwa drobinowa [63]. Komórki warstwy ziarnistej zakrętu zębatego to w większości neurony glutamatergiczne unerwiane przez interneurony warstwy komórek wielokształtnych. Aksony komórek ziarnistych, stanowiące tzw. włókna mszyste (ang. mossy fibers), tworzą zakończenia synaptyczne na dendrytach komórek piramidowych obszarów CA3 i CA4. Z kolei aksony komórek piramidowych sektora trzeciego CA tworzą połączenia synaptyczne z neuronami piramidowymi obszaru CA2 oraz, przez tzw. bocznice Schaffera, łączą się z dendrytami komórek piramidowych sektora CA1 [63–66]. Ważną grupę komórek występujących w mózgu stanowią komórki glejowe. Choć początkowo sądzono, że stanowią one jedynie podporę dla komórek nerwowych, to zostało udowodnione, iż komórki glejowe pełnią szereg istotnych funkcji, jak np. modulowanie przekazywania sygnałów między neuronami [66, 67]. Astrocyty, komórki glejowe zaliczane do makrogleju, regulują stężenie jonów potasu, zapobiegają dyfuzji neuroprzekaźnika oraz w niektórych sytuacjach wiążą neurotransmitery [68]. Astrocyty stanowią dla neuronów również dodatkowe źródło glukozy w sytuacjach wzmożonego jej zużycia [66]. Co więcej, badania z ostatnich lat wiążą zaburzenia w funkcjonowaniu astrocytów z szeregiem chorób neurologicznych [69–75].. 17.


(19) 2. WPROWADZENIE TEORETYCZNE DO SPEKTROSKOPII OSCYLACYJNEJ Celem niniejszego rozdziału jest omówienie metod pomiarowych zastosowanych w prezentowanej pracy doktorskiej, to jest synchrotronowej mikrospektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (µSRFTIR - ang. synchrotron radiation Fourier transform infrared microspectroscopy) oraz ultraszybkiej mikrospektroskopii FTIR (µUFFTIR - ang. ultra-fast Fourier transform infrared microspectroscopy). Ważną częścią tego rozdziału jest także przedstawienie zastosowanej aparatury pomiarowej. W badaniach przedstawionych w niniejszej pracy użyto również mikropektroskopii Ramana jako metody komplementarnej do mikrospektroskopii FTIR. Metody te, należące do grupy metod spektrsokopii wibracyjnej, mają wiele cech wspólnych. Z tego względu podstawy fizyczne powyższych technik pomiarowych zostały opisane w tym samym podrozdziale. Badania przy użyciu µSRFTIR jak i µUFFTIR przeprowadzono w technice transmisyjno-odbiciowej. Najważniejsze informacje dotyczące tej techniki zostały zaprezentowane w ostatnim podrozdziale.. 2.1. Podstawy fizyczne spektroskopii oscylacyjnej Podstawowym zjawiskiem fizycznym, na którym opierają się wszystkie metody spektroskopowe jest rezonansowe pochłanianie promieniowania elektromagnetycznego [76]. Wielkościami rejestrowanymi w trakcie badań spektroskopowych są energia i natężenie promieniowania zaabsorbowanego, wyemitowanego lub też rozproszonego przez badany materiał. Uzyskane w ten sposób widma energetyczne stanowią źródło jakościowej bądź ilościowej informacji o składzie chemicznym lub strukturze próbki. Wśród metod spektroskopowych wyróżniamy spektroskopię w podczerwieni i spektroskopię Ramana, których celem jest analiza widm oscylacyjnych cząsteczek, spektroskopię w zakresie widzialnym i ultrafiolecie (UV-VIS) koncentrującą się na absorpcji elektronowej w molekułach, elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR) badający zmianę orientacji spinu elektronowego w zewnętrznym polu magnetycznym oraz magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) badający zmianę orientacji spinu jądrowego w zewnętrznym polu magnetycznym [76–78]. Przedmiotem badań zarówno spektroskopii w podczerwieni jak i spektroskopii Ramana są widma rotacyjno-oscylacyjne molekuł. Na ich podstawie można uzyskać informacje dotyczące budowy cząsteczki oraz wiązań międzyatomowych, które ją tworzą [76, 77, 79, 80]. 2.1.1. Ruch oscylacyjny molekuły Molekuła, inaczej zwana cząsteczką, to układ przynajmniej dwóch atomów połączonych wiązaniem kowalencyjnym, jonowym bądź wodorowym. Opis energii molekuły musi uwzględniać zarówno energię wynikającą z jej ruchu, a więc energię kinetyczną, jak i energię elektronów (z uwzględnieniem ich energii kinetycznej i energii potencjalnej oddziaływania z jądrem atomowym oraz sąsiadującymi elektronami) oraz wewnętrzną energię jąder atomowych (zarówno kinetyczną jak i potencjalną energię nukleonów). Przy 19.

(20) Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. założeniu niezależności poszczególnych składowych, całkowitą energię cząsteczki można opisać następująco [76, 81]: 𝐸 = 𝐸𝑡 + 𝐸𝑟 + 𝐸𝑜𝑠𝑐 + 𝐸𝑒 + 𝐸𝑗 , gdzie: 𝐸 𝐸𝑡 𝐸𝑟 𝐸𝑜𝑠𝑐 𝐸𝑒 𝐸𝑗. -. (1). całkowita energia molekuły [J]; energia ruchu translacyjnego molekuły [J]; energia ruchu rotacyjnego [J]; energia ruchu oscylacyjnego [J]; energia elektronowa [J]; energia wewnętrzna jąder atomowych [J].. Atomy w cząsteczce są połączone dzięki oddziaływaniu między elektronami walencyjnymi. Jądra atomowe wraz z zamkniętymi powłokami elektronowymi (tzw. zręby atomu) drgają wokół położenia równowagi, przypominając tym samym układ sprężynujący [76]. Matematycznie ruch takiego układu przybliża się za pomocą modelu oscylatora harmonicznego (Rysunek 3).. Rysunek 3. Model oscylatora harmonicznego. Przez m1 oraz m2 oznaczono masy połączone sprężyną, r oznacza odległość między masami, a 𝑟𝑒 położenie równowagi tych mas.. Jeśli przez 𝒙 oznaczymy wychylenie z położenia równowagi (𝒙 = 𝒓 – 𝒓𝑒 ), to siła sprężystości działająca na układ dwóch atomów wynosi (ponieważ ruch oscylatora można rozpatrywać w jednym wymiarze, można zaniedbać notację wektorową) [81, 82]: 𝐹𝑠 = −𝑘𝑥 ,. (2). gdzie: 𝐹𝑠 𝑘 𝑥. - siła sprężystości działająca na układ dwóch atomów [N]; - współczynnik sprężystości układu [N/m]; - wychylenie z położenia równowagi [m].. Przyjmując, że początek układu współrzędnych, w którym rozpatrujemy ruch oscylatora pokrywa się z jedną z mas, masę całego układu możemy potraktować jako masę zredukowaną [81, 82]: 𝑚1 𝑚2 𝑚= . (3) 𝑚1 + 𝑚2. 20.

(21) 2. Wprowadzenie teoretyczne do spektroskopii oscylacyjnej. Wychodząc z drugiej zasady dynamiki Newtona otrzymujemy równanie ruchu oscylatora harmonicznego w następującej postaci: 𝑑2 𝑥 𝑘 + 𝑥=0 . 𝑑𝑡 2 𝑚. (4). Rozwiązaniem powyższego równania ruchu jest funkcja periodyczna o postaci: 𝑥 = 𝐴𝑐𝑜𝑠(𝜔𝑡 + 𝜑) , gdzie: 𝐴 𝜔 𝑡 𝜑. -. (5). amplituda wychylenia [m]; częstość drgań [rad/s]; czas trwania ruchu [s]; faza początkowa [rad].. Z równań (4) i (5) wynika, że częstość drgań układu jest równa: 𝑘 ω = 2𝜋𝜈 = √ , 𝑚. (6). gdzie: 𝜈. - częstotliwość oscylacji [Hz].. W podejściu mikroskopowym całkowitą energię układu opisujemy przy pomocy równania Schrödingera [78]: −. ℏ 𝑑2 𝛹 ∙ + 𝑈(𝑥)𝛹(𝑥) = 𝐸𝛹(𝑥) , 2𝑚 𝑑𝑥 2. (7). gdzie: 𝑚 𝛹 𝑥 𝑈(𝑥) 𝐸. -. masa zredukowana [kg]; funkcja falowa; wychylenie [m]; energia potencjalna układu [J]; energia całkowita [J].. Energia potencjalna oscylatora harmonicznego dana jest wzorem [81, 82]: 𝑥. 1 𝑈(𝑥) = ∫ −𝐹𝑠 𝑑𝑥 = 𝑘𝑥 2 . 2 0. (8). Biorąc pod uwagę równania (6) i (8) oraz wstawiając je do równania Schrödingera (7) otrzymujemy równanie energii oscylacji Eosc:. 21.

(22) Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. 1 1 𝑘 𝐸𝑜𝑠𝑐 = (𝜐 + ) ℎ = (𝜐 + ) ℏ√ , 2 2 𝑚. (9). gdzie: 𝜐. - oscylacyjna liczba kwantowa, 𝜐 = 0, 1, 2, 3 … .. Dla oscylatora harmonicznego różnica energii między kolejnymi poziomami oscylacyjnymi jest wielkością stałą, równą [76, 78]: 𝑘 ∆𝐸𝑜𝑠𝑐 = 𝐸𝜐+1 − 𝐸𝜐 = ℏ√ . 𝑚. (10). Powyższe rozważania są słuszne jedynie dla przypadku idealnego oscylatora harmonicznego. W rzeczywistości, rozpatrując drgania molekuły, należy uwzględnić to, że współczynnik sprężystości 𝑘 maleje wraz ze wzrostem wychylenia, co przy odpowiednio dużym 𝑟, skutkuje zerwaniem wiązania między atomami i dysocjacją cząsteczki. Dodatkowym czynnikiem zakłócającym są straty energii związane z odziaływaniem molekuły z otoczeniem. Układ podlegający takim ograniczeniom można jednak matematycznie opisać modelem oscylatora anharmonicznego, którego energia potencjalna przyjmuje następującą postać [76, 78, 83]: 1 1 2 (11) 𝐸𝑜𝑠𝑐,𝑎 = (𝜐 + ) ℎ𝜈0 − (𝜐 + ) ℎ𝜈0 𝜒 , 2 2 gdzie:. 0 . - częstość drgań oscylatora na poziomie zerowym [Hz]; - współczynnik anharmoniczności, wielkość niemianowana.. Dla oscylatora anharmonicznego różnica energii między sąsiadującymi poziomami energetycznymi wynosi wówczas: ∆𝐸𝑜𝑠𝑐,𝑎 = 𝐸𝜐+1 − 𝐸𝜐 = ℎ𝜈0 [1 − 2𝜒(𝜐 + 1)] .. (12). Oscylacyjna liczba kwantowa dla oscylatora anharmonicznego może się zmieniać o 𝛥𝜐 = ±1, ±2, ±3 ... [76, 78, 83]. Wykres energii potencjalnej oscylatora harmocznicznego i anharmonicznego (tzw. krzywą Morse’a) przedstawiono na rysunku 4.. 22.

(23) 2. Wprowadzenie teoretyczne do spektroskopii oscylacyjnej. Rysunek 4. Wykres poziomów energii oscylacji z zaznaczonym konturem wykresu energii potencjalnej dla: a) oscylatora harmonicznego; b) oscylatora anharmonicznego. Strzałki zwrócone grotem do góry oznaczają przejścia absorpcyjne, a grotem w dół przejścia emisyjne. Wartość re jest to odległość równowagowa jąder. Dla r~re krzywą Morse’a można przybliżyć parabolą. Przejście z poziomu 0 na 1 nazywamy tonem podstawowym, natomiast przejścia z poziomu 0 na poziomy 2 i dalej nazywamy kolejnymi nadtonami. Intensywność pasm maleje wraz ze wzrostem numeru nadtonu [76, 78, 80].. O ile w przypadku molekuły dwuatomowej mamy do czynienia jedynie z drganiami rozciągającymi wiązanie między atomami, to w przypadku molekuły wieloatomowej, a takie najczęściej występują w układach biologicznych, wzrasta różnorodność możliwych oscylacji. Za drgania podstawowe (normalne) uznaje się takie oscylacje molekuł, dla których ruch atomów (lub grup atomów) w cząsteczce występuje w zgodnej fazie i z jednakową częstością. Drgania takie są wzajemnie od siebie niezależne i nie powodują przesunięcia środka masy układu drgającego [76, 79, 80]. Wyróżniamy następujące rodzaje drgań normalnych (Rysunek 5): a) drgania rozciągające, w których dochodzi do zmiany długości wiązania chemicznego miedzy atomami; b) drgania deformacyjne zmieniające kąt wychylenia poszczególnych atomów względem atomu centralnego, te dzielą się na oscylujące w płaszczyźnie układu atomów drgania nożycowe i wahadłowe oraz na oscylujące poza tą płaszczyzną drgania wachlarzowe i skręcające; c) drgania szkieletowe rozumiane jako drgania pierścienia jako całości.. Rysunek 5. Rodzaje drgań: a) rozciągających, b) deformacyjnych.. 23.

(24) Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. 2.1.2. Oddziaływanie promieniowania elektromagnetycznego z materią – absorpcja i rozpraszanie W trakcie oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego z materią zachodzą zjawiska takie jak absorpcja bądź rozpraszanie. Parametrami determinującymi to, który z wymienionych procesów nastąpi, są długość fali padającego promieniowania (𝜆) oraz charakter materii, z którą ono oddziałuje (skład pierwiastkowy, rodzaj i wielkość molekuł, gęstość materiału). Promieniowanie elektromagnetyczne można opisać za pomocą parametrów takich jak długość fali (), częstotliwość () i energia (𝐸) [78]: 𝑐 𝐸 = ℎ𝜈 = ℎ , 𝜆 gdzie: 𝐸 ℎ.  𝑐. . -. (13). energia kwantu [J]; stała Plancka, h = 6,62510-34 [Js]; częstotliwość fali [Hz]; prędkość rozchodzenia się fali elektromagnetycznej w próżni, c = 3108 ms-1; długość fali [m].. W spektrofotometrii bardzo często korzysta się z pojęcia liczby falowej wyrażonej w cm-1 [76, 77, 80]: 𝜈̅ =. 100 . 𝜆. (14). Zakres promieniowanie podczerwonego (ang. infrared radiation) z podziałem na bliską (ang. near infrared - NIR), średnią (ang. middle infrared - MIR) i daleką podczerwień (ang. far infrared - FIR) podano w tabeli 1. Z oscylacjami wewnątrzmolekularnymi, dającymi informacje o konformacji układu, związany jest zakres średniej podczerwieni. Dlatego też jest on powszechnie stosowany w badaniach analitycznych, a widma cząsteczek uzyskane dla tego zakresu zwane są „odciskiem palca” molekuły [80]. Tabela 1. Zakres widmowy promieniowania podczerwonego [77]. Zakres podczerwieni.  [m]. ̅ [cm-1] 𝝂.  [Hz]. bliska (NIR). 7,710-7 - 2,510-6. 13,0·103 - 4,0103. 1,21014 - 3,91014. średnia (MIR) daleka (FIR). 2,510-6 - 2,510-5 2,510-5 - 1,010-3. 4,0103 - 0,4103 0,4103 - 0,1102. 1,21013 - 1,21014 3,01011 - 1,21013. Badania spektrometryczne z wykorzystaniem podczerwieni pozwalają uzyskać informacje o charakterze jakościowym, czyli o częstotliwościach absorbowanego promieniowania, bądź też o charakterze ilościowym, jak np. natężenie zaabsorbowanego promieniowania o danej częstotliwości. W tym drugim przypadku podstawową obowiązującą zależnością pozwalającą określić natężenie promieniowania po przejściu przez materiał badany jest prawo Bouguera–Lamberta. Załóżny, że molekuły w materiale badanym stanowią centra absorbujące rozmieszczone równomiernie w całej objętości próbki oraz, że absorbują one 24.

(25) 2. Wprowadzenie teoretyczne do spektroskopii oscylacyjnej. taką samą ilość monochromatycznego promieniowania padającego w postaci skolimowanej wiązki. Przy koncetracji cząsteczek w materiale równej C oraz oświetleniu wiązką powierzchni równej S, prawdopodobieństwo absorpcji lub rozproszenia światła w elemencie próbki o grubości 𝑑𝑠 wynosi [79, 83]: −. 𝑑𝐼 𝜎𝐶𝑆 = 𝑑𝑠 , 𝐼 𝑆. (15). gdzie: 𝑑𝐼 - wartość, o jaką zmieniło się natężenie promieniowania po przejściu przez element próbki o grubości ds [Wm-2]; 𝐼 - natężenie promieniowania padającego na próbkę [Wm-2]; 𝜎 - przekrój czynny na ekstynkcję [m-2]; C - koncentracja molekuł w materiale [m-3]; S pole powierzchni naświetlone przez padającą wiązkę [m2]; 𝑑𝑠 - grubość elementu próbki [m]. Po scałkowaniu powyższego równania, otrzymujemy równanie określające natężenie wiązki po przejściu przez element próbki o grubości s: 𝐼 = 𝐼0 𝑒 −𝜎𝐶𝑠 ,. (16). gdzie: 𝐼 - natężenie promieniowania elektromagnetycznego po przejściu przez próbkę [Wm-2]; 𝑠 - grubość próbki [m]. Iloczyn 𝜎𝐶 jest liniowym współczynnikiem osłabienia. Zaniedbując rozpraszania, można przyjąć, że liniowy współczynnik osłabienia jest tożsamy z liniowym współczynnikiem absorpcji (𝑎). Równanie 16. przyjmuje wtedy następującą postać: 𝐼 = 𝐼0 𝑒 −𝑎𝑠 .. (17). Stosunek natężenia promieniowania po przejściu przez próbkę do jego natężenia przed próbką zwany jest transmitancją (wyrażana w %): 𝑇=. 𝐼 100% . 𝐼0. (18). W niniejszej pracy jako miarę zaabsorbowanego promieniowania IR podaje się absorbancję: 𝐴 = −𝑙𝑜𝑔𝑇 .. (19). Absorbancja jest wyrażana w jednostkach umownych a.u. (ang. arbitrary units). Zjawiskiem konkurencyjnym do absorpcji jest rozproszenie promieniowania elektromagnetycznego. W wyniku tego procesu cząsteczka, z którą oddziałuje promieniowanie EM staje się emiterem promieniowania o częstotliwości 𝜈𝑟 równej częstotliwości wiązki padającej 𝜈𝑝 , lub o częstotliwości zmienionej o wartość częstotliwości 25.

(26) Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. oscylacji molekuły (𝜈𝑟 = 𝜈𝑝 ± 𝜈𝑜𝑠𝑐 ) [76, 79, 83]. Wyjaśnienie tego zjawiska przedstawiono poniżej. Składowa elektryczna promieniowania oddziałującego z molekułą powoduje przemieszczenie ładunków ujemnych względem dodatnich w molekule, a więc powstanie momentu dipolowego 𝜇 opisanego zależnością [76, 83]:. 𝑖𝑛𝑑 = 𝛼𝐸𝑝 , gdzie: 𝛼 𝐸𝑝 -. (20). polaryzowalność molekuły [Cm2/V]; natężenie składowej elektrycznej padającego promieniowania [V/m].. Natężenie składowej elektrycznej promieniowania elektromagnetycznego zmienia się periodycznie w czasie 𝑡: 𝐸𝑝 = 𝐸𝑚 𝑐𝑜 𝑠(2𝜋𝜈𝑝 𝑡) ,. (21). gdzie: 𝐸𝑚 - amplituda natężenia składowej elektrycznej padającego promieniowania [V/m]; 𝜈𝑝 - częstotliwość padającego promieniowania EM [Hz]. Oznaczona we wzorze (20) jako 𝛼 polaryzowalność molekuły określa zdolność elektronów do przemieszczania się względem jądra w polu elektrycznym. Jej wartość zależy od wychylenia atomów cząsteczki z położenia równowagi. Ponieważ rozpatrujemy jedynie drgania normalne, to ruch zrębów atomowych opisujemy względem współrzędnej normalnej 𝑞. Korzystając z równania (5), w przypadku drgania molekuły z częstotliwością 𝜈𝑜𝑠𝑐 , zmianę odległości między jej atomami zapisujemy jako: 𝑞 = 𝐴𝑐𝑜𝑠(2𝜋𝜈𝑜𝑠𝑐 𝑡) .. (22). Przy założeniu, że rozpatrywana molekuła jest dwuatomowa oraz ma jedną współrzędną normalną 𝑞, to funkcja opisująca polaryzowalność, po rozwinięciu w szereg Maclaurina i w przybliżeniu harmonicznym, przyjmuje postać [79]: 𝑑𝛼 𝛼(𝑞) = 𝛼0 + ( ) ∙ 𝐴𝑐𝑜𝑠(2𝜋𝜈𝑜𝑠𝑐 𝑡) , 𝑑𝑞 𝑞=0. (23). gdzie 𝛼0 oznacza polaryzowalność molekuły przy zerowym wychyleniu atomów względem współrzędnej normalnej 𝑞. Wstawiając zależności (21) i (23) do równania (20), opisującego wyindukowany moment dipolowy, oraz korzystając z tożsamości trygonometrycznej na iloczyn dwóch cosinusów, otrzymujemy [79]: 1 𝑑𝛼 𝜇𝑖𝑛𝑑 = 𝛼0 𝐸𝑚 𝑐𝑜𝑠(2𝜋𝜈𝑝 𝑡) + ( ) ∙ 𝐴𝐸𝑚 𝑐𝑜𝑠[2𝜋(𝜈𝑝 −𝜈𝑜𝑠𝑐 )𝑡] + 2 𝑑𝑞 𝑞=0 1 𝑑𝛼 + ( ) ∙ 𝐴𝐸𝑚 𝑐𝑜𝑠[2𝜋(𝜈𝑝 +𝜈𝑜𝑠𝑐 )𝑡] . 2 𝑑𝑞 𝑞=0 26. (24).

(27) 2. Wprowadzenie teoretyczne do spektroskopii oscylacyjnej. Zatem, jeżeli promieniowanie padające na cząsteczkę indukuje powstanie momentu dipolowego, nie powodując przy tym przejścia molekuły na inny poziom oscylacyjny, to cząsteczka emituje promieniowanie o częstotliwości równej częstotliwości promieniowania padającego. Zjawisko to jest znane jako rozproszenie Rayleigha. Jeżeli natomiast w wyniku takiego odziaływania zostanie zmieniona polaryzowalność, a molekuła przejdzie na wyższy lub niższy oscylacyjny poziom energetyczny, to energia promieniowania rozproszonego zostanie zmieniona o różnicę energii między danymi poziomami (Rysunek 6). Gdy energia promieniowania rozproszonego jest mniejsza od energii promieniowania padającego, to mówimy o rozproszeniu stokesowskim, gdy zaś energia promieniowania rozproszonego jest większa od energii promieniowania padającego mówimy wtedy o rozproszeniu antystokesowkim. Powyższe zjawisko zwane jest efektem Ramana [76, 79, 83].. Rysunek 6. a) Poglądowa wizualizacja możliwych przejść energetycznych przy rozproszeniu promieniowania EM. b) Poglądowa wizualizacja różnic w natężeniu promieniowania rozproszonego o częstotliwościach 𝜈𝑟 = 𝜈𝑝 −𝜈𝑜𝑠𝑐 , 𝑣𝑟 = 𝜈𝑝 oraz 𝜈𝑟 = 𝜈𝑝 +𝜈𝑜𝑠𝑐 .. Prawdopodobieństwo zajścia rozproszenia promieniowania jest od 3 do 4 rzędów wielkości mniejsze niż prawdopodobieństwo jego absorpcji. By móc efektywnie rejestrować promieniowanie rozproszone należy zintensyfikować natężenie wiązki padającej. Z tego względu w spektroskopii Ramana stosuje się źródła promieniowania IR o dużej intensywności wiązki, jakimi są lasery [76]. 2.1.3. Reguły wyboru Zgodnie z drugą zasadą termodynamiki entropia, czyli stopień zróżnicowania dystrybucji energii na poziomach energetycznych, w układzie izolowanym jest stała bądź rośnie. Konsekwencją tego są nieustanne zmiany liczby molekuł w danym stanie energetycznym (w temperaturze powyżej zera bezwzględnego). Zakładając, iż w każdym elemencie objętości układu izolowanego panuje taka sama temperatura, obsadzenie poziomów energetycznych można opisać przy pomocy statystyki Boltzmanna [76, 81]: 𝑛𝑤 ∆𝐸 = 𝑒𝑥𝑝 (− ) , 𝑛𝑛 𝑘𝐵 𝑇. (25). gdzie: 27.

(28) Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. 𝑛𝑤 𝑛𝑛 𝐸 𝑘𝐵 𝑇. -. liczba molekuł w wyższym stanie energetycznym, wielkość niemianowana; liczba molekuł w niższym stanie energetycznym, wielkość niemianowana; różnica energii między wyższym i niższym stanem energetycznym [J]; stała Boltzmanna, kB = 1,38·10-23 [J/K]; temperatura [K].. Z powyższej funkcji rozkładu energii wynika, iż wraz ze wzrostem temperatury otoczenia rośnie liczba molekuł w wyższym stanie energetycznym. Przejście między oscylacyjnymi poziomami energetycznymi będzie możliwe wtedy i tylko wtedy, gdy: 1) zaabsorbowany lub wyemitowany zostanie kwant o energii równej różnicy energetycznej między danymi poziomami; 2) oscylacyjna liczba kwantowa ulegnie zmianie o: 𝛥𝜐 = ±1 dla oscylatora harmonicznego lub 𝛥𝜐 = ±1, ±2, ±3 … dla oscylatora anharmonicznego. Wymienione powyżej warunki przejścia energetycznego, zwane regułami wyboru, są konieczne, ale niewystarczające dla przejścia molekuły do innego stanu energetycznego. Z einsteinowskiego opisu prawdopodobieństwa przejść energetycznych wynika, że prawdopodobieństwo zaistnienia przejścia wymuszonego jest równe [79]: 𝑊 = 𝐵𝑤𝑛 ∙ 𝜌 ,. (26). gdzie: 𝑊 - prawdopodobieństwo przejść wymuszonych; 𝐵𝑤𝑛. - współczynnik Einsteina określający prawdopodobieństwo przejścia ze stanu 𝑤 na 𝑛;. . - gęstość energii padającego promieniowania.. Występujący w tym równaniu współczynnik 𝐵𝑤𝑛 jest wprost proporcjonalny do kwadratu momentu przejścia, który wynosi [79]: +∞ ∗ 𝜇𝑤𝑛 = ∫ 𝜓𝑤 𝜇𝜓𝑛 𝑑𝑞,. (27). −∞. gdzie:. 𝑤𝑛. - moment przejścia;. ∗𝑤 , 𝑛 - funkcje falowe stanów w i n z równania Schrödingera; . - moment dipolowy molekuły będący funkcją współrzędnej normalnej 𝑞.. Postać funkcji (𝑞) jest zmienna dla różnych oscylatorów. Rozwijając ją w szereg Maclaurina i wstawiając do równania na 𝐵𝑤𝑛 jedynie dwa pierwsze człony rozwinięcia dowiedziemy, iż przejście ze stanu 0 na 1 (ton podstawowy) jest możliwe wtedy, gdy w czasie oscylacji wzdłuż współrzędnej normalnej zmianie ulega moment dipolowy 𝒅𝝁. molekuły (𝒅𝒒 ≠ 𝟎) [76, 80]. Zmiana momentu dipolowego molekuły stanowi ostatni warunek przejścia między oscylacyjnymi poziomami energetycznymi. Tylko przy spełnieniu powyższych warunków możliwe jest uzyskanie pasma w widmie w spektroskopii w podczerwieni. 28.

(29) 2. Wprowadzenie teoretyczne do spektroskopii oscylacyjnej. Do. otrzymania. pasma. ramanowskiego. polaryzowalności molekuły. 𝒅𝜶 ( 𝒅𝒒. niezbędna. jest. natomiast. zmiana. ≠ 𝟎), co wynika z równania (24). Odmienne warunki. konieczne do uzyskania pasm w widmie podczerwieni i widmie Ramana powodują, iż niektóre pasma nieaktywne w spektroskopii w podczerwieni stają się widoczne w spektroskopii Ramana i na odwrót. Informacje uzyskane przy zastosowaniu tych dwu odmiennych metod badawczych wzajemnie się uzupełniają [76].. 2.2. Podstawowe elementy spektrometru IR 2.2.1. Źródła promieniowania IR Źródłem promieniowania podczerwonego jest każde ciało posiadające energię cieplną. Promieniowanie emitowane przez taki obiekt przyjmuje plankowski rozkład temperatury, a jego całkowita zdolność emisyjna opisana jest prawem Stefana [78]: 𝑅𝑇 = 𝜎𝑇 4 ,. (28). gdzie: 𝑅𝑇 - całkowita zdolność emisyjna ciała [Wm-2];  - stała Stefana-Boltzmana [Wm-2K-4]; 𝑇 - temperatura emitera [K]. W warunkach laboratoryjnych zazwyczaj korzysta się ze spektrometrów IR ze źródłem globarowym lub włóknem Nernsta. W badaniach wymagających wysokiej rozdzielczości spektralnej i przestrzennej jako źródło IR wykorzystuje się promieniowanie synchrotronowe. W eksperymentach przedstawionych w niniejszej pracy głównymi narzędziami badawczymi były spektrometr ze źródłem globarowym (mapowanie rozkładu przestrzennego makromolekuł biologicznych) oraz spektrometr z synchrotronowym źródłem IR (identyfikacja agregatów w hipokampie), dlatego tylko te dwa źródła zostaną omówione poniżej. Globar jest to cienki pręt o długości kilku centymetrów i średnicy kilku-kilkunastu milimetrów wykonany ze sproszkowanego węglika krzemu. Globar pracuje w temperaturze 1500 K. Jego zaletą jest brak ujemnej stałej termooporowej oraz większa wydajność emisyjna dla fal krótszych od 7 m, wadą natomiast relatywnie (w porównaniu do źródeł synchrotronowych) wysoka wartość rozdzielczości przestrzennej [13, 84]. Przez promieniowanie synchrotronowe rozumiemy fale elektromagnetyczne emitowane przez cząstki o niezerowym ładunku elektrycznym (zazwyczaj pozytony lub elektrony) poruszające się z prędkością bliską prędkości światła w zewnętrznym polu magnetycznym. Powstawanie promieniowania synchrotronowego zostało przewidziane w 1944 r. w pracy autorstwa Iwanenko i Pomeranchuka [85], a eksperymentalnie dowiedzione rok później przez Eldera i jego zespół [86, 87]. Wytwarzanie promieniowania synchrotronowego zostało schematycznie przedstawione na rysunku 7. W warunkach wysokiej próżni paczka cząstek naładowanych zostaje wprowadzona do akceleratora liniowego, gdzie przechodząc przez mikrofalowe wnęki rezonansowe ulega przyspieszeniu i osiąga energię kinetyczną rzędu MeV. Następnie po wejściu do akceleratora kołowego (tzw. booster) cząstki 29.

(30) Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. naładowane są ponownie przyspieszane, a ich energia wzrasta do GeV. Z taką energią cząstki naładowane trafiają do pierścienia akumulacyjnego synchrotronu i tam, w wyniku oddziaływania z polem magnetycznym, emitują promieniowanie EM stycznie do krzywizny toru. W synchrotronach pierwszej generacji promieniowanie synchrotronowe uzyskiwano przez wprowadzenie paczki ładunków w jednorodne pole magnetyczne wytwarzane przez dipol magnetyczny, gdzie działająca na poruszające się ładunki siła Lorentza powoduje zakrzywienie toru ruchu tych cząstek, a tym samym pojawienie się przyspieszenia dośrodkowego. Intensywność tak uzyskiwanego promieniowania jest wprost proporcjonalna do liczby ładunków w poruszającej się paczce [87]. Z czasem w konstrukcji pierścieni synchrotronowych, obok dipoli magnetycznych pełniących rolę magnesów zakrzywiających, pojawiły się tak zwane urządzenia wstawkowe, tj. wigglery i undulatory, zbudowane z macierzy magnesów, w których tor ruchu paczki ładunków jest wielokrotnie zakrzywiany, dzięki czemu intensywność uzyskiwanego promieniowania SR jest większa o kilka rzędów wielkości niż w przypadku tradycyjnych dipoli [88]. Warto zaznaczyć, iż w przypadku undulatora emitowane fotony ulegają interferencji dając na wyjściu promieniowanie niemalże monochromatyczne o wysokiej intensywności. Przy zastosowaniu wigglerów otrzymuje się promieniowanie charakteryzujące się stosunkowo małą długością fali i, tak jak w przypadku magnesów zakrzywiających, ciągłym spektrum [iv, v].. Rysunek 7. Schemat ideowy powstawania promieniowania synchrotronowego.. Do głównych cech promieniowania synchrotronowego zalicza się [87, 88]: a) wysoką kolimację: rozwartość stożka emisji promieniowania synchrotronowego zależy od energii poruszających się cząstek (~1/𝛾, gdzie 𝛾 jest czynnikiem Lorentza); b) wysokie natężenie wiązki: dla wiązki promieniowania X powstałego w synchrotronach III generacji jasność wynosi co najmniej 1018 fotonów/(s*mm2*mrad2*0,1%BW), BW oznacza szerokość widmową3; c) polaryzację liniową w płaszczyźnie pierścienia synchrotonowego a eliptyczną poza tą płaszczyzną;. 3. 0,1%BW odpowiada szerokości pasma 10-3 ω o częstotliwości ω.. 30.

(31) 2. Wprowadzenie teoretyczne do spektroskopii oscylacyjnej. d) możliwość uzyskania promieniowania EM w szerokim zakresie widmowym: od dalekiej podczerwieni (λ≌10-5 m) po promieniowanie X (λ<10-10 m) (przy zastosowaniu undulatorów uzyskuje się wiązkę quasi-monochromatyczną). Dzięki powyższym cechom promieniowanie synchrotronowe jest powszechnie stosowanym narzędziem badawczym w różnych dziedzinach nauki np. w badaniach biologicznych [13, 89, 90], geologicznych [91, 92] czy nawet w badaniach dzieł sztuki [93– 95]. Moc promieniowania IR uzyskiwanego w synchrotronach nie jest wyższa niż promieniowania pochodzącego z tradycyjnych źródeł IR. Jednak mały naturalny rozmiar źródła oraz wąski kąt emisji promieniowaina IR powodują, iż jasność promieniowania IR uzyskiwanego z synchrotronu jest od 100 do 1000 razy większa niż w przypadku tradycyjnego źródła IR [96]. Dzięki temu przy synchrotronowej wiązce IR o rozmiarach rzędu kilku m, a więc porównywalnych z rozmiarami pojedynczych komórek, możliwe jest otrzymanie widma o znacznie lepszej jakości niż przy użyciu źródła globarowego. Jednak zwiększając rozmiar wiązki IR uzyskiwanej z synchrotronu i globaru możliwe jest uzyskanie widm o zbliżonej jakości. Z rysunku 8A wynika, iż by uzyskać wartość sygnału na detektorze przy zastosowaniu globarowego źródła promieniowania IR porównawalną do tej dla źródła synchrotronowego, należy zastosować aperturę ograniczającą przekrój poprzeczny wiązki nie bardziej niż do 70 µm. Na rysunku 8B porównano widma uzyskane przy użyciu synchrotronowego (widmo czerwone) oraz globarowego (widmo niebieskie) źródła IR przy aperturze wynoszącej 6 µm. Z rysunku wynika, że wartość stosunku sygnału do szumu jest wyższa dla promieniowania synchrotronowego niż dla globarowego. To przekłada się na niższą, a więc korzystniejszą, wartość rozdzielczości przestrzennej w przypadku mikrospektroskopii IR ze źródłem synchrotronowym w porównaniu do tej z tradycyjnym źródłem promieniowania IR [13, 16, 89].. Rysunek 8. (A) Porównanie zależności sygnału, rejestrowanego na detektorze MCT, od rozmiaru zastosowanej apertury dla wiązki promieniowania IR uzyskanej z synchrotronu i globaru. (B) Porównanie widm absorpcyjnych otrzymanych przy zastosowaniu promieniowania IR ze źródła synchrotronowego oraz z globarowego przy aperturze równej 6 µm, wg [13].. Dyfrakcja promieniowania elektromagnetycznego na elementach układu optycznego, zarówno w mikrospektroskopii FTIR jak i innych metodach spektroskopowych, powoduje iż fizycznie nie jest możliwe uzyskać wiązki promieniowania o przekroju poprzecznym na 31.

(32) Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. próbce mniejszym od pewnej wartości. Wartość ta nazwana jest limitem dyfrakcyjnym. W przypadku układu z pojedynczą aperturą limit dyfrakcyjny wynosi 2λ/3 [13], co przy zakresie MIR od 4000 cm-1 do 500 cm-1 wynosi odpowiednio od 1,7 µm do 17 µm. W przypadku geometrii konfokalnej, a więc w sytuacji gdy rozmiar wiązki ograniczany jest aperturą zarówno przed próbką jak i przed detektorem, limit dyfrakcyjny jest równy λ/2 [13], co w przeliczeniu dla zakresu MIR daje rodzielczość przestrzenną od 1,25 µm do 12 µm. 2.2.2. Interferometr Zarówno w spektroskopii IR jak i w spektroskopii Ramana kluczowym elementem aparatury jest interferometr, który pozwala na selektywne wzmacnianie intensywności promieniowania skierowanego na badaną próbkę. Ideowy schemat interferometru został przedstawiony na rysunku 9. Interferometr składa się z trzech zwierciadeł: stacjonarnego, ruchomego oraz półprzepuszczalnego. Wiązka promieniowania EM o ciągłym spektrum, emitowanego przez źródło, po przejściu przez układ soczewek (a w przypadku wiązki IR zwierciadeł) zostaje skierowana na zwierciadło półprzepuszczalne. W przypadku badań z użyciem średniej podczerwieni zwierciadło półprzepuszczalne zbudowane jest z transparentnego dla MIR bromku potasu (KBR) pokrytego warstwą germanu lub tlenku żelaza [77]. Zwierciadło półprzepuszczalne rozdziela wiązkę pierwotną (oznaczona na rysunku jako wiązka 1) na dwie wiązki o jednakowych intensywnościach (2 i 3), biegnące prostopadle do siebie. Jedna z nich (2) trafia na zwierciadło stacjonarne. Pozostała część wiązki pierwotnej (3) zostaje skierowana na zwierciadło ruchome, poruszające się ruchem jednostajnym, z prędkością rzędu 0,001-10 mm∙s-1, w kierunku równoległym do wiązki na nie padającej. Wiązki odbite od zwierciadeł stacjonarnego (2) i ruchomego (3’) wracają do separatora, gdzie ulegają interferencji. Powstała w ten sposób wiązka (4) zostaje skierowana na badany preparat. Zwierciadło ruchome zmienia swoje położenie o 𝛥𝑥, więc różnica dróg optycznych między falami 2 i 3’ wynosi  = 2𝛥𝑥. Zatem wzmocnienie fal zachodzi dla wartości przesuwu zwierciadła 𝑥 równego parzystej wielokrotności długości fali padającego promieniowania, a wygaszenie dla 𝑥 równego nieparzystej wielokrotności . Zwykle do precyzyjnego pomiaru położenia zwierciadła ruchomego używa się wiązki lasera helowo-neonowego [83].. 32.

(33) 2. Wprowadzenie teoretyczne do spektroskopii oscylacyjnej. Rysunek 9. Schemat ideowy interferometru Michelsona.. Detektor, do którego dociera promieniowanie po przejściu przez badany preparat, rejestruje intensywność widma interferencyjnego w funkcji różnicy dróg optycznych promieniowania biegnącego w interferometrze [77, 79]: +∞. 𝑆() = ∫ 𝐼(𝜈) cos(2𝜋𝜈𝛿) 𝑑𝜈 ,. (29). 0. gdzie:. . 𝐼(𝜈). - różnica dróg optycznych; - intensywność promieniowania o częstoliwości ν.. Za pomocą transformacji Fouriera można przekształcić podaną wyżej funkcję zależną od  w funkcję opisującą inetnsywność promieniowania zależną od częstotliwości [77, 79]: +∞. 𝐼(𝜈) = ∫ 𝑆() cos(2𝜋𝜈𝛿) 𝑑 .. (30). −∞. 33.

(34) Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. 2.2.3. Detektory podczerwieni Promieniowanie podczerwone może być rejestrowane przez detektory piroelektryczne, jak termopara, bolometr, komórka Golaya, lub fotoelektryczne. Detektory fotoelektryczne są dziś znacznie bardziej powszechne. Działanie detektorów fotoelektrycznych polega na pomiarze natężenia prądu elektrycznego powstałego wskutek wybicia elektronu z materiału fotodiody w wyniku absorpcji kwantu promieniowania elektromagnetycznego. W zależności od tego, w jakim zakresie podczerwieni prowadzone są badania, kryształ detektora fotoelektrycznego dobiera się tak, by przerwa energetyczna kryształu pokrywała się z energią analizowanego promieniowania IR [3, 97]. W mikrospektroskopii w podczerwieni zazwyczaj wykorzystuje się detektory zbudowane z tellurku kadmowo-rtęciowego zwane detektorami MCT (ang. mercury, cadmium, telluride). Ich zaletą jest bardzo dobry stosunek sygnału do szumu otrzymywanych widm, wadą natomiast niska temperatura pracy i wynikająca z tego konieczność chłodzenia ciekłym azotem [3, 77].. 2.3. Charakterystyka spektroskopowa głównych makromolekuł biologicznych Jak już zaznaczono w poprzednim rozdziale, w spektroskopi FTIR dokonuje się analizy częstotliwości drgań normalnych. Na ich podstawie identyfikowane są związki, w których budowie można wyróżnić charakterystyczne grupy funkcyjne. W drganiu normalnym uczestniczą wszystkie zręby atomowe molekuły, co oznacza, że oscylacja jednego atomu wpływa na drgania pozostałych atomów cząsteczki. Drgania charakterystycznych grup funkcyjnych są niezależne od drgań pojedynczych atomów z nimi sąsiadujących. Umożliwia to analizę drgań poszczególnych grup funkcyjnych traktowanych jak odizolowany człon układu [80]. W budowie związków organicznych można wyróżnić szereg grup funkcyjnych. Dotyczy to również wielkocząsteczkowych związków biologicznych, jakimi są proteiny, lipidy, kwasy nukleinowe oraz węglowodany. Przy zastosowaniu spektroskopii absorbcyjnej FTIR jesteśmy w stanie zarówno zidentyfikować te związki jak i ocenić stopień ich zmian strukturalnych. Przykładowe widmo absorbcyjne przedstawiono na rysunku 10.. 34.

(35) 2. Wprowadzenie teoretyczne do spektroskopii oscylacyjnej. Rysunek 10. Przykładowe widmo z zakresu średniej podczerwieni zarejestrowane dla tkanki nerwowej (widmo podddano korekcji linii bazowej). Na rysunku zaznaczone zostały główne pasma absorpcji oraz opisane drgania im odpowiadające (rozwinięcie skrótów: roz. – drgania rozciągające, asym. – asymetryczne, sym. – symetryczne).. Częstotliwości drgań charakterystyczne dla poszczególnych makromolekuł zostały przedstawione w tabeli 2. Tabela 2. Pochodzenie pasm absorpcji identyfikowanych w widmach IR tkanki nerwowej [98, 99] Liczba falowa ~1080 cm-1 ~1240 cm-1 ~1390cm-1. Rodzaj molekuły. Rodzaj i pochodzenie drgań. Kwasy nukleinowe, fosfolipidy, węglowodory ufosforylowane. rozciągające symetryczne fosfodiestrowej grupy 𝑃𝑂2−. Kwasy tłuszczowe, wielocukry. rozciągające symetryczne grupy karboksylowej 𝐶𝑂𝑂 −. rozciągające asymetryczne fosfodiestrowej grupy 𝑃𝑂2−. ~1460 cm-1. rozciągające asymetryczne wiązania 𝐶 − 𝐻 grupy 𝐶𝐻2. ~1548 cm-1. rozciągające grupy 𝐶 − 𝑁 (pasmo amidu II). ~1631 cm-1. Białka. rozciągające wiązania 𝐶 = 𝑂 grupy amidowej, białka o strukturze β-kartki (wchodzi w skład pasma amidu I). ~1655 cm-1. rozciągające wiązania 𝐶 = 𝑂 grupy amidowej, białka o strukturze α-helisy (wchodzi w skład pasma amidu I). ~3290 cm-1. rozciągające grupy 𝑁 − 𝐻 (pasmo amidu A). ~1740 cm-1. rozciągające wiązanie 𝐶 = 𝑂 grupy estrowej. ~2855 cm-1. rozciągające symetryczne wiązania 𝐶 − 𝐻 grupy metylenowej 𝐶𝐻2. ~2925 cm-1. Tłuszcze. rozciągające asymetryczne wiązania 𝐶 − 𝐻 grupy metylenowej 𝐶𝐻2. ~2958 cm-1. rozciągające asymetryczne wiązania 𝐶 − 𝐻 grupy metylowej 𝐶𝐻3. ~3012 cm-1. rozciągające wiązanie 𝐶 − 𝐻 grupy = 𝐶𝐻 w nienasyconych kwasach tłuszczowych. 35.

(36) Wykorzystanie zaawansowanych metod spektroskopowych w badaniach nad patogenezą epilepsji na przykładzie modeli zwierzęcych. 2.4. Zalety i wady transmisyjno-odbicowej mikrospektroskopii FTIR W mikrospektroskopii FTIR możliwe jest wykonywanie pomiarów przy zastosowaniu różnych trybów pracy. W trybie transmisyjnym badany preparat umieszczony zostaje między źródłem promieniowania IR a detektorem. Detektor rejestruje promieniowanie, które przeszło przez badany materiał. Podkład, na którym umieszcza się próbkę musi być przezroczysty dla wiązki IR w analizowanym zakresie liczby falowej. To założenie spełniają substancje takie jak np. BaF2, CaF2, ZnS, ZnSe [83]. W badaniach próbek tkanek, ze względu na ich relatywnie niewielką grubość, a co za tym idzie niewielką absorpcję, często stosuje się tryb transmisyjno-odbiciowy (ang. transflection). Podkłady stosowane w tym trybie pracy pokryte są warstwą metalu odbijającego dany zakres IR, wskutek czego wiązka promieniowania IR dwukrotnie przechodzi przez próbkę. W ten sposób zostają uwypuklone przestrzenne różnice absorbancji w preparacie. Inne zalety pracy w trybie transmisyjno-odbiciowewym to brak występowania aberracji chromatycznej oraz niewielki koszt szkieł (w porównaniu do podkładów stosowanych w transmisji). Nośniki użyte w eksperymentach opisanych w niniejszej pracy pokryte są warstwą Ag/SnO2. Jest to związek chemicznie obojętny i prawie całkowicie odbijający promieniowanie podczerwone średniego zakresu. Praca w trybie transmisyjno-odbiciowym obarczona jest jednak pewnymi wadami. Zjawiskami niekorzystnymi, istotnymi ze względu na ich wpływ na jakość uzyskiwanych wyników, są efekty rozproszeniowe, w szczególności rozproszenie Mie’go jak również tzw. efekt elektrycznej fali stojącej.. 2.4.1 Rozproszenie Mie’go W mikrospekroskopii FTIR materiałów biologicznych widma spektroskopowe z zakresu średniej podczerwieni, oprócz pasm absorpcji charakterystycznych dla konkretnych substancji chemicznych, mogą posiadać cechy wynikające z innych efektów fizycznych zachodzących w trakcie przejścia wiązki promieniowania elektromagnetycznego przez badane struktury. W trakcie badań zarówno pojedynczych komórek jak i wycinków tkanek zaobserwowano występowanie w widmach, pochodzących z heterogenicznych obszarów preparatów, nietypowych cech takich jak sinusoidalne falowanie linii bazowej, zaburzenia w relacji pasm amidu I i amidu II oraz przesunięcie maksimum pasma amidu I w kierunku niższych liczb falowych [100–102]. Dalsze analizy wykazały, iż przyczyną sinusoidalnych oscylacji linii bazowej jest rozproszenie Mie’go [100], a anomalia w obrębie pasma amidu I mogą wynikać z rezonansowej formy tego rozproszenia (RMieS – ang. resonant Mie scattering) [103]. Pod pojęciem rozproszenia Mie’go kryje się rozproszenie fal EM na dielektrycznych sferach. Określająca to zjawisko wydajność rozpraszania 𝑄 dana jest wzorem: 4 4 𝑄 = 2 − 𝑠𝑖𝑛𝜌 + 2 (1 − 𝑐𝑜𝑠𝜌) , (31) 𝜌 𝜌 przy czym: 𝜌 = 2𝜋𝑎. 36. 𝑛−1 , 𝜆. (32).