4. OPIS WYNIKÓW BADAŃ
4.2. CZĘSTOŚCI WYSTĘPOWANIA I ANALIZA ODMIAN ALLELICZNYCH
4.2.7. Analiza pojedynczych mutacji genów sprzyjających rozwojowi otyłości i ich wpływ
gospo-darkę lipidową i lipemią poposiłkową (DTTL)
a. Allele predysponujące do wystąpienia wyższych BMI w grupie z rodzinną otyłością Na podstawie analizy uzyskanych wyników wybrano allele „predysponujące do rozwoju otyłości” badanych genów, które w grupach o genotypie homozygotycznym lub heterozygotycznym wykazywały wyższe średnie wartości BMI. Ryc. 54 przedsta-wia częstości alleliczne „predysponujących do rozwoju otyłości” alleli genów w kolej-ności od najczęstszego do najrzadszego występowania w badanej grupie.
Ryc. 54. Odsetkowa częstość alleliczna „alleli predysponujących do wystąpienia otyłości” badanych genów w grupie z rodzinną otyłością
Najczęściej, bo u 80% osób, w badanej grupie „rodzin otyłych” z terenu Małopolski występował allel C receptora dopaminergicznego (mutacja C→T w regionie regulato-rowym genu). U 63% występował allel G białka szoku cieplnego HSP-70-2 (mutacja typu silent [Gln] w kodonie 352 A→G), a u 52% allel T w intronie 6 genu lipazy lipo-proteinowej.
b. Ocena genotypów „predysponujących” do wyższych BMI i ich związek z antro-pometrycznymi wskaźnikami otyłości (WHR, procentowa zawartość tkanki tłuszczowej) Obserwacje podgrup genotypowych wyraźnie wykazują różny związek alleli „pre-dysponujących do otyłości” ze średnimi wartościami wskaźników antropometrycznych charakteryzujących otyłość. Za miarę wpływu przyjęto średni procent zmiany badane-go parametru pomiędzy dwiema grupami genotypowymi: homozybadane-gotycznym „predys-ponującym” i homozygotycznym „zabezpieczającym” przed rozwojem otyłości. War-tości przedstawione na wykresach są podane jako procentowe warWar-tości względne. Za 100% przyjmowano średnią badanego parametru w całej grupie badanej. Na ryc. 55 przedstawiono względną zmianę procentową w BMI pomiędzy podgrupami różniący-mi się genotypem badanych genów.
Do obliczenia względnej procentowej zmiany [%Z] zastosowano wzór:
[%Z] = [{BMI BB (lub BMI AB)* – BMI AA} / BMI średnie dla całej grupy] × 100 gdzie: AA – oznacza homozygotyczny genotyp „ochraniający”; AB –
heterozygo-tyczny genotyp predysponujący∗; – BB – homozygotyczny genotyp „predys-ponujący”.
∗ Ze względu na bardzo rzadkie występowanie genotypu homozygotycznego GG dla mutacji genu apoCIII i Arg/Arg mutacji receptora β3-AR we wzorze użyto w tych przypadkach średniej grupy o genoty-pie heterozygotycznym.
Ryc. 55. Względna procentowa różnica wskaźnika masy ciała (BMI) pomiędzy nosicielami przeciwstaw-nych genotypów badaprzeciwstaw-nych genów (* we wzorze użyto genotypu heterozygotycznego)
W badanej grupie rodzin otyłych (n = 265) genotyp CC receptora dopaminergicz-nego predysponował najsilniej do wystąpienia wyższych BMI. W analizie Anova po-równującej średnie w podgrupach genotypowych wykazano, że różnica w BMI dla podgrup nosicieli tej mutacji jest istotna statystycznie (p = 0,028).
Każdy z badanych polimorfizmów wpływa modyfikująco, często w sposób niei-stotny statystycznie, na różne szlaki metaboliczne zaangażowane w gospodarkę ener-getyczną ustroju i regulację apetytu. Jest to zgodne ze współczesnym piśmiennictwem [najszerzej w 39, 40]. Odzwierciedla się w wynikach oceniających parametry fenoty-powe pomiędzy podgrupami genotypowymi. Związek wskaźnika WHR i procentowej zawartości tkanki tłuszczowej, powszechnie uznane parametry oceniające otyłość ze wzrostem BMI, różni się w przypadku polimorfizmu różnych genów.
Ryc. 56 przedstawia kolejno „mutacje predysponujące do wyższego BMI” badanych genów i względną różnicę procentową we wskaźniku WHR, obliczoną za pomocą wzoru:
[%Z] = [{WHR BB (lub WHR AB)* – WHR AA} / WHR średnie dla całej grupy] × 100 gdzie: AA – oznacza homozygotyczny genotyp „ochraniający”; AB –
heterozygo-tyczny genotyp predysponujący*; BB – homozygotyczny genotyp „predyspo-nujący”.
Posiadanie genotypu GG genu β3-AR (mutacja w kodonie 64), genotypu CC recep-tora dopaminergicznego i genotypu GG w intronie 8 genu lipazy lipoproteinowej naj-silniej predysponowała te grupy do wyższych średnich wskaźników WHR.
Grupy o genotypie CC mutacji w genie receptora dopaminergicznego-2, w porów-naniu z grupami o genotypie CT i TT, charakteryzowały się nie tylko znamiennie wyż-szym BMI, lecz również niekorzystnym, rozpatrując w kategorii ryzyka innych zwią-zanych z otyłością konsekwencji zdrowotnych, rozmieszczeniem tkanki tłuszczowej.
Ryc. 57 przedstawia kolejno badane geny i względną różnicę procentową w zawar-tości tkanki tłuszczowej obliczoną za pomocą wzoru:
[%Z] = [{% t. tł. BB (lub % t. tł. AB)* – % t. tł. AA} / % t. tł. średnie dla całej grupy] × 100
gdzie: AA – oznacza homozygotyczny genotyp „ochraniający”; AB – heterozygotyczny genotyp predysponujący*; BB – homozygotyczny genotyp „predysponujący”.
Największą różnicę w procentowej zawartości tkanki tłuszczowej pomiędzy oso-bami o różnym genotypie wykazano dla polimorfizmu Pro12→Ala w białku czynnika transkrypcyjnego PPAR-γ2. Różnica ta była istotna statystycznie (zob. poprzedni roz-dział analiza Anova p = 0,048). Duże, choć nieznamienne, różnice wykazano dla muta-cji w receptorze dopaminergicznym, lipazy lipoproteinowej (intron 6) i czynniku ne-krozy nowotworu TNF-α.
Ryc. 56. Względna procentowa różnica indeksu WHR pomiędzy nosicielami przeciwstawnych genoty-pów badanych genów (*we wzorze użyto genotypu heterozygotycznego), n = 265. Wartości ujemne wskazują, że podgrupa o genotypie predysponującym do wyższych BMI nie predysponowała do pod-wyższenia wskaźnika WHR
Ryc. 57. Względna procentowa różnica w zawartości tkanki tłuszczowej ocenianej za pomocą aparatu Maltron pomiędzy nosicielami przeciwstawnych genotypów badanych genów (* we wzorze użyto geno-typu heterozygotycznego), n = 265. Wartości ujemne wskazują, że podgrupa o genotypie predysponu-jącym do wyższych BMI nie predysponowała do podwyższenia średniej zawartości tkanki tłuszczowej c. Związek genotypów „predysponujących do wyższych BMI” a stężenie leptyny
W całej badanej grupie obserwowano silną korelację pomiędzy stężeniem leptyny a BMI (p < 0,001). Zgodne jest to z danymi z piśmiennictwa [1–5]. Korelację tę przed-stawia ryc. 58.
Ryc. 58. Korelacja pomiędzy wskaźnikiem masy ciała (BMI) a poziomem leptyny w grupie rodzin otyłych (stężenie leptyny przedstawiono jako log leptyny), n = 265
Podgrupy genotypowe posiadające allele genów „predysponujących do rozwoju otyłości” równolegle z wyższymi średnimi BMI posiadały wyższe stężenia leptyny.
W podgrupach genotypowych natomiast korelacja stężenia leptyny i BMI się różniła.
Ryc. 59 przedstawia kolejno badane geny i względną różnicę procentową w stę-żeniu leptyny obliczoną za pomocą wzoru:
[%Z] = [{Lep. BB (lub Lep. AB)* – Lep. AA} / Lep. średnie dla całej grupy] × 100 gdzie: AA – oznacza homozygotyczny genotyp „ochraniający”; AB – heterozygotyczny
genotyp predysponujący*; BB – homozygotyczny genotyp „predysponujący”.
Ryc. 59. Względna procentowa różnica w stężeniu leptyny na czczo pomiędzy nosicielami przeciw-stawnych genotypów badanych genów (* we wzorze użyto genotypu heterozygotycznego), n = 265.
Wartości ujemne wskazują, że podgrupa o genotypie predysponującym do wyższych BMI nie predys-ponowała do podwyższenia średniego stężenia leptyny
Silny wzrost stężenia leptyny obserwowano w podgrupach genotypowych dla geno-typu CC receptora dopaminergicznego, genogeno-typu TT LPL-P (mutacja C→T w intronie 6) (istotne statystycznie różnice pomiędzy genotypami w teście Anova p = 0,039), genotypu TT FOX-C2 (mutacja w promotorze –512 C→T), genotypu AA receptora melanokortyny 3 (mutacja Ile→Val w kodonie 81) i GG białka szoku cieplnego HSP-70-2. Wzrost stężenia leptyny korelował ze wzrostem indeksu masy ciała z wyjątkiem genotypów „predysponujących do wyższych wartości BMI” genu β3-AR, LPL-H, FABP i UCP-1, gdzie względny przyrost masy ciała nie szedł w parze ze wzrostem stężenia leptyny.
d. Związek genotypów „predysponujących do wyższych BMI” z indeksem insulinoopor-ności HOMA-IR
Na ryc. 60 przedstawiono względne procentowe różnice w indeksie insulinooporno-ści HOMA-IR pomiędzy grupami o genotypach „predysponujących” do rozwoju otyło-ści i „zabezpieczających”. Różnice obliczono według wzoru:
[%Z] = [{HOMA BB (lub HOMA AB)* – HOMA AA} / HOMA średnie dla całej grupy] × 100 gdzie: AA – oznacza homozygotyczny genotyp „ochraniający”; AB – heterozygotyczny
genotyp predysponujący*; BB – homozygotyczny genotyp „predysponujący”.
Ryc. 60. Względna procentowa różnica we wskaźniku insulinooporności HOMA-IR pomiędzy nosiciela-mi przeciwstawnych genotypów badanych genów (* we wzorze użyto genotypu heterozygotycznego) n = 265. Wartości ujemne wskazują, że podgrupa o genotypie predysponującym do wyższych BMI nie predysponowała do podwyższenia wskaźnika HOMA-IR
Najsilniejszy wpływ na rozwój insulinooporności odnotowano w grupach o ge-notypie AA genu TNF-α (znamienne statystycznie różnice pomiędzy genotypami w teście Anova p = 0,38), genotypie TT (w intronie 6) genu lipazy lipoproteinowej oraz w grupie o genotypie CC (mutacja wywołująca Met→Thr w kodonie 493) białka szoku cieplnego HSP-70-hom.
Otyłość bez wpływu na rozwój insulinooporności była charakterystyczna dla grup o genotypach MCR-3 (AA), DRD2 (TT) i PPAR-γ2 (GG).
e. Związek genotypów „predysponujących do wyższych BMI” a zaburzenia gospodarki cholesterolowej
Częstym powikłaniem otyłości i zespołu metabolicznego są zaburzenia gospodarki lipidowej: podwyższone stężenia triglicerydów, cholesterolu całkowitego, cholesterolu LDL i obniżone stężenia cholesterolu HDL. Na ryc. 61 przedstawiono względne pro-centowe różnice w stężeniach cholesterolu całkowitego, cholesterolu LDL i HDL po-między grupami o genotypach „predysponujących” do rozwoju otyłości i „zabezpie-czających”.
Różnice obliczono według wzoru:
[%Z] = [{Chol. BB (lub Chol. AB)* – Chol. AA} / Chol. średnie dla całej grupy] × 100 gdzie: AA – oznacza homozygotyczny genotyp „ochraniający”; AB – heterozygotyczny
genotyp predysponujący*; BB – homozygotyczny genotyp „predysponujący”.
W podgrupach o genotypie GG genu PPAR-γ2 i CC genu receptora dopaminergicz-nego równolegle z wyższym BMI współwystępowały wyższe stężenia cholesterolu całkowitego, cholesterolu LDL i cholesterolu HDL. Najwyższą dodatnią różnicę dla cholesterolu HDL obserwowano dla grupy o genotypie AA i GA genu receptora mela-nokortyny 3.
Ryc. 61. Względna procentowa różnica w stężeniu cholesterolu całkowitego, cholesterolu LDL i cho-lesterolu HDL pomiędzy nosicielami przeciwstawnych genotypów badanych genów, n = 265
Dla większości badanych genów obserwowano niewielki wzrost cholesterolu całko-witego i LDL oraz niewielki spadek cholesterolu HDL wiążący się z genotypem „pre-dysponującym” do rozwoju otyłości. Grupy o genotypie CC HSP-70-hom, GG LPL-H
oraz AA TNF-α charakteryzowały się znacznie obniżonymi stężeniami cholesterolu HDL (predysponującymi do rozwoju miażdżycy). Dodatkowo grupa o genotypie AA TNF-α cechowała się obniżonym stężeniem cholesterolu całkowitego i LDL.
f. Związek genotypów „predysponujących do wyższych BMI” a lipemia poposiłkowa (DTTL)
Na ryc. 62 przedstawiono względne procentowe różnice w wartościach pola po-wierzchni pod krzywą triglicerydową i WKT pomiędzy grupami o genotypach „pre-dysponujących” do rozwoju otyłości i „zabezpieczających”. Różnice obliczono według wzoru:
[%Z] = [{Auc BB (lub Auc AB)* – Auc AA} / Auc średnie dla całej grupy] × 100 gdzie: AA – oznacza homozygotyczny genotyp „ochraniający”; AB – heterozygotyczny
genotyp predysponujący*; BB – homozygotyczny genotyp „predysponujący”.
Najwyższe wartości pola powierzchni triglicerydów obserwowano w grupach o genotypie TT genu FOX-C2, AA TNF-α, CC genu HSP-70-hom. Dodatkowo grupie o genotypie CC genu HSP-70-hom towarzyszyło najwyższe stężenie WKT.
Ryc. 62. Względna procentowa różnica w wartości pola powierzchni pod krzywą triglicerydową i wol-nych kwasów tłuszczowych w przebiegu DTTL pomiędzy nosicielami przeciwstawwol-nych genotypów badanych genów, n = 26
Grupy o genotypie predysponującym do rozwoju otyłości receptora melanokorty-ny-4, receptora β2-adrenergicznego oraz β3-adrenergicznego, charakteryzowały się względnym obniżeniem pola powierzchni pod krzywą triglicerydową oraz towarzyszą-cym silnym obniżeniem pola powierzchni pod krzywą WKT w przebiegu DTTL.
W grupach o genotypie AA i GA receptora melanokortyny obserwowano względny spadek wartości pola powierzchni pod krzywą triglicerydową u osób z wyższymi war-tościami BMI.
g. Związek genotypów „predysponujących do wyższych BMI” a wyrzut insuliny w DTTG i DTTL
Wyrzut insuliny oceniany wartością pola powierzchni pod krzywą insulinową w przebiegu testów DTTG i DTTL był silnie skorelowany w całej grupie. Genotyp
„predysponujący do wyższych wartości BMI” genów: receptora dopaminergicznego D2, β3-adernergicznego, receptora melanokortyny-3, CETP i PPAR-γ2 charakteryzo-wał się niższym wyrzutem insuliny niż genotypy „zabezpieczające” przed rozwojem otyłości tych samych genów. Przeciwnie, wyższymi stężeniami insuliny w przebiegu testu charakteryzowały się podgrupy o genotypach TNF-α (AA), białka szoku cieplne-go HSP-70-hom i czynnika transkrypcyjnecieplne-go FOX-C2 (TT).
Ryc. 63. Procentowa różnica w stężeniu insuliny podczas testu lipemii poposiłkowej i testu obciążenia glukozą (wyrażona jako pole powierzchni pod krzywą insulinową) pomiędzy nosicielami przeciwstaw-nych genotypów badaprzeciwstaw-nych genów
Na ryc. 63 przedstawiono badane polimorfizmy genetyczne w kolejności od naj-wyższych względnych różnic wartości pola pod krzywą insulinową w przebiegu DTTG pomiędzy grupą o genotypie „predysponującym” do rozwoju otyłości i genotypie „za-bezpieczającym”. Względna różnica powierzchni pól pod krzywą insulinową w prze-biegu DTTL i DTTG była podobna, lecz dla niektórych genotypów wyrzut insuliny w DTTL był wyższy lub niższy niż dla DTTG. Dla lepszego zobrazowania różnic w wyrzucie insuliny w reakcji na podaną w roztworze glukozę (DTTG) i bogato-tłuszczowy posiłek wprowadzono nowy wskaźnik względny współczynnik wydziela-nia insuliny (WWI), będący stosunkiem pola powierzchni pod krzywą insulinową w DTTL do pola powierzchni pod krzywą insulinową w DTTG.
Współczynnik ten świadczy o wielkości wyrzutu insuliny po spożyciu standardo-wego posiłku o dużej zawartości tłuszczu w porównaniu z posiłkiem zawierającym
glukozę. Im wyższy jest współczynnik WWI, tym wyższy jest wyrzut insuliny po po-siłku bogatotłuszczowym względem wyrzutu insuliny po wypiciu 75 g glukozy.
Wzrost tego współczynnika wskazuje na wyższy względny wyrzut insuliny w reakcji na posiłek zawierający pokarm o wysokiej zawartości tłuszczu.
Współczynnik WWI w całej grupie przyjmował wartość średnią 1,66 ± 0,71. Nie różnił się znacząco w grupie kobiet i mężczyzn, a jego wartość nie zależała od wieku badanych. Zależał natomiast istotnie (p = 0,013 w teście t-Studenta) od stopnia otyło-ści. Współczynnik ten świadczy o stosunku wyrzutu insuliny po spożyciu standardo-wego posiłku o dużej zawartości tłuszczu w porównaniu z posiłkiem zawierającym glukozę.
Grupy genotypowe charakteryzujące się wysokim współczynnikiem odpowiadały na posiłek bogatotłuszczowy względnie wyższym wyrzutem insuliny niż na roztwór glukozy, a tym samym osoby posiadające ten genotyp mogą mieć gorszą tolerancję tłuszczu i powinny w ochronie przed rozwojem insulinooporności spożywać pokarm o zmniejszonej zawartości tłuszczu. Geny, których polimorfizm wpływał na zmniej-szenie współczynnika WWI, wskazują na zwiększoną insulinooporność w odpowie-dzi na obciążenie glukozą, a luodpowie-dzie o tym genotypie powinni raczej unikać pokar-mów o dużej zawartości cukru lub spożywać węglowodany o niskim indeksie glike-micznym.
Względny wpływ badanych polimorfizmów na współczynnik WWI przedstawia ryc. 64.
Ryc. 64. Względna różnica w wartości współczynnika WWI pomiędzy grupami homozygot i heterozygot
„predysponującymi” do rozwoju otyłości a grupami homozygot o niższym średnim BMI, n = 265
Względne wartości obliczano według wzoru:
[%Z] = [{WWI BB (lub WWI AB)* – WWI AA} / WWI średnie dla całej grupy] × 100 gdzie: AA – oznacza homozygotyczny genotyp „ochraniający”; AB – heterozygo-tyczny genotyp predysponujący*; BB – homozygotyczny genotyp „predyspo-nujący”; WWI – względny współczynnik wydzielania insuliny.
Wyższą wartością względnego współczynnika WWI charakteryzowały się genotypy posiadające mutacje „predysponujące do rozwoju otyłości” w genach LPL, receptora β2-AR, PPAR-γ2 i FOX-C2. Niższą wartością (wyższym wyrzutem insuliny po wypi-ciu roztworu glukozy) charakteryzowały się z kolei genotypy „predysponujące” do rozwoju otyłości genów: receptora melanokortyny 3, FABP-1, receptora β3-AR, TNF-α, HSP-70-hom i SR-BI.
Podsumowanie
Najwyższe wskaźniki masy ciała w rodzinach otyłych z terenu Małopolski posia-dały podgrupy:
• o genotypie CC w sekwencji niekodującej od 3’ końca receptora dopaminer-gicznego DRD2 (C→T), dodatkowo allel C sprzyjający otyłości był allelem dominującym w tej grupie i występował u 80% badanych;
• o genotypie AA w promotorze genu TNF-α, allel A sprzyjający otyłości wystę-pował u 20% badanych;
• o genotypie GG w kodonie 64 Trp64→Arg receptora β3-adrenergicznego, allel G występował u 9% badanych.
Te same genotypy miały najsilniejsze znaczenie w kształtowaniu wysokiego wskaź-nika WHR w badanej grupie. Dodatkowo, wyższe wskaźniki WHR obserwowano dla genotypu TT (intron 6) i GG (intron 8) lipazy lipoproteinowej. Najwyższą procento-wą zawartość tkanki tłuszczowej obserwowano dla genotypu GG genu receptora jądrowego PPAR-γ2 (Ala/Ala) i genotypu CC DRD2, AA TNF-α, TT LPL-P i TT FOX-C2.
Na tej podstawie można wnioskować, że na rozwój otyłości w badanej grupie miały największy wpływ: genotyp CC receptora DRD2, AA TNF-α, TT LPL-P, GG LPL-H GG PPAR-γ2 i TT FOX-C2.
Najwyższe stężenia leptyny obserwowano dla genotypu TT LPL-P; TT FOX-C2, AA MCR-3. Najniższe stężenia leptyny obserwowano dla genotypu GG LPL-H; GG FABP-1 i AA TNF-α.
Skłonność do rozwoju insulinooporności związanej z otyłością obserwowano dla genotypu AA TNF-α, CC HSP-70-hom, TT SR-BI, TT FOX-C2 i GG HSP-70-2.
Zaburzenia lipidowe, skłonność do wysokich stężeń cholesterolu, cholesterolu LDL i HDL towarzyszyły genotypowi GG PPAR-γ2, CC DRD2 i AA MCR-3. Niskie stężenia cholesterolu HDL towarzyszyły genotypom CC HSP-70-hom, GG LPL-H, GG UCP-1 i AA TNF-α.
Wysokie stężenia triglicerydów w przebiegu DTTL charakteryzowały genotypy AA TNF-α, CC HSP-hom, GG LPL-H. Niższe stężenia triglicerydów z kolei były cha-rakterystyczne dla genotypów AA MCR-3, CC DRD2.
Na podstawie oryginalnie obliczonego wskaźnika WWI określono genotypy, które równocześnie z predyspozycją do rozwoju otyłości reagują wyższym wyrzutem insuli-ny na DTTL niż DTTG. Należą do nich genotypy TT i CT LPL-P, AA HSP-70-2, GG receptora β2-AR, receptora dopaminergicznego DRD2, GG i CG PPAR-γ2, AA i AG UCP-1 oraz TT i CT FOX-C2. Wykazano również, że genotypy AA MCR-3, GG FABP-1, GG i TG receptora β3-AR i AA i GA TNF-α miały wyższy wyrzut insuliny po DTTG.