CZ. II. WYSTE˛POWANIE W Z
˙
YWNOS´
CI, METODY OZNACZANIA Katedra i Zakład Chemii Wydziału Lekarskiego w Zabrzu S´
la˛skiej Akademii MedycznejKierownik: prof. zw. dr hab. D. Bodzek
Hasła kluczowe: chinolony, analiza z˙ywnos´ci, chromatografia.
Key words: quinolones, food analysis, chromatography.
Chinolony stanowia˛ grupe˛ chemoterapeutyko´w, kto´re ze wzgle˛du na duz˙a˛ aktywnos´c´ bakteriobo´jcza˛, znalazły powszechne zastosowanie w medycynie i weterynarii. Spektrum ich działania obejmuje wiele szczepo´w bakterii gram-dodatnich i gram ujemnych (1). W weterynarii chinolony wykorzystywane sa˛ w leczeniu i prewencji infekcji u zwierza˛t domowych i hodowlanych oraz jako promotory przyrostu masy ciała zwierza˛t (1–5). Zuz˙ycie chinolono´w w weterynarii w 30 najbardziej uprzemysłowionych krajach s´wiata w roku 1998 wyniosło ok. 900 ton, z czego w celach leczniczych zastosowano zaledwie 10% tej ilos´ci (2, 3). Ze wzgle˛du na moz˙liwos´c´ gromadzenia sie˛ tych chemoterapeutyko´w w organiz-mach zwierza˛t oraz w pozyskiwanych z nich produktach z˙ywnos´ciowych, istnieje duz˙e prawdopodo-bien´stwo naraz˙enia człowieka na te zwia˛zki (6, 7, 8).
Ekspozycja na chinolony moz˙e powodowac´ uodparnianie sie˛ bakterii patogennych dla człowieka, jak ro´wniez˙ wyste˛powanie u ludzi ro´z˙nych odczyno´w alergicznych i toksycznych (6, 7). Dodatkowym problemem jest, wynikaja˛ce z duz˙ej stabilnos´ci chemicznej chinolono´w, zagroz˙enie długoterminowego zalegania tych zwia˛zko´w lub produkto´w ich przemian metabolicznych w ro´z˙nych elementach s´rodowis-ka, m.in. w s´ciekach, nawozach naturalnych, glebach, wodach (2).
W y s t e˛ p o w a n i e c h i n o l o n o´ w w z˙ y w n o s´ c i
W krajach Unii Europejskiej, w ramach działan´ podejmowanych dla zapewnienia bezpieczen´stwa zdrowia człowieka naraz˙onego na wpływ substancji obecnych w z˙ywnos´ci, wprowadzono Program Kontroli Pozostałos´ci w Z
˙
ywnos´ci (European Residue Plan for the Surveillance in Food), kto´ry uwzgle˛dnia m.in. oznaczanie ste˛z˙en´ leko´w stosowanych w weterynarii w ro´z˙nych produktach spoz˙yw-czych (4). Rozporza˛dzenia obowia˛zuja˛ce w Unii (Council Regulation 2377/90), jak ro´wniez˙ rozpo-rza˛dzenia wprowadzone przez działaja˛cy przy FAO/WHO Komitet Eksperto´w ds. Dodatko´w do Z˙
ywnos´ci (Joint Expert Committee on Food Additives – JECFA) s´cis´le okres´laja˛ wartos´ci dopuszczal-nych ste˛z˙en´ pozostałos´ci (Maximum Residue Limits – MRL) chinolono´w w z˙ywnos´ci (4, 9–12). Od 2000 r. okres´lenie wartos´ci MRL jest wymagane dla kaz˙dej substancji, kto´ra w krajach Unii Europejskiej jest komercyjnie stosowana w weterynarii (9).W tab. I przedstawiono obowia˛zuja˛ce limity zawartos´ci leko´w chinolonowych w wybranych produktach spoz˙ywczych pochodzenia zwierze˛cego (9, 11, 12). Rozporza˛dzenia unijne (tab. I) uwzgle˛dniaja˛ koniecznos´c´ oznaczenia zawartos´ci enrofloksacyny ła˛cznie z jej gło´wnym metabolitem ciprofloksacyna˛, tj. z chinolonem przeznaczonym do leczenia człowieka (13).
Ws´ro´d chinolono´w najcze˛s´ciej oznaczanych w produktach spoz˙ywczych wymienic´ nalez˙y ich fluoropochodne: enrofloksacyne˛, ciprofloksacyne˛, marbofloksacyne˛, danofloksacyne˛ i sarafloksacyne˛, norfloksacyne˛, ofloksacyne˛ (6, 12, 14, 15–21), orbifloksacyne˛ (trifluorochinolon stosowany w Australii BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. – XL, 2007, 1, str. 79 – 87
T a b e l a I
Maksymalne dopuszczalne wartos´ci pozostałos´ci chinolono´w w produktach pochodzenia zwierze˛cego (MRL – maximum residue limits) ustalone przez Unie˛ Europejska˛ (EU) oraz Zjednoczony Komitet
d/s Dodatko´w do Z˙ywnos´ci (JECFA) z FAO/WHO (9) T a b l e I
Maximum residue limits (MRL) of quinolones in food established by European Union (EU) and Joint Expert Committee on Food Additives (JECFA) with FAO/WHO (9)
Antybiotyk chinolonowy
Gatunki zwierza˛t hodowlanych
Pro´bka MRL(EU) MRL (JECFA) z˙ywnos´ci µg/kg µ/kg bydło, kurczak mie˛so 200 200 tłuszcz 100 100 wa˛troba, nerka 400 400 mleko 30 – Danofloksacyna trzoda chlewna mie˛s´nie 100 100 tłuszcz – 100 wa˛troba 200 50 nerka 200 200 mie˛so 400 – bydło tłuszcz 100 –
trzoda chlewna wa˛troba 1400 –
nerka 800 – Difloksacyna mie˛so 300 – kurczak tłuszcz 400 – indyk wa˛troba 1900 – nerka 600 – mie˛so, tłuszcz 100 – bydło wa˛troba 300 –
Enrofloksacyna owce nerka 200 –
+ mleko 100 –
Ciprofloksacyna trzoda chlewna mie˛so, tłuszcz 100 –
dro´b wa˛troba 200 –
kro´lik nerka 300 –
mie˛so 200 500
bydło tłuszcz 300 1000
owce wa˛troba 500 1000
trzoda chlewna nerka 1500 3000
mleko 50 – Flumechina mie˛so 400 500 kurczak tłuszcz – 1000 indyk wa˛troba 800 1000 nerka 1000 3000 łosos´ mie˛so 600 500 mie˛so, wa˛troba,
Marbofloksacyna bydło nerka 150 –
trzoda chlewna tłuszcz 50 –
mleko 75 –
bydło mie˛so 100 –
trzoda chlewna tłuszcz 50 –
Kwas oksolinowy kurczak wa˛troba, nerka 150 –
jajka 50 – ryby mie˛so 300 – kurczak mie˛so – 10 tłuszcz – 20 wa˛troba 100 80 Sarafloksacyna nerka – 80 mie˛so – 10 indyk tłuszcz – 20 wa˛troba, nerka – 80
80
B. Janoszka i inniNr 1
do leczenia infekcji u koto´w i pso´w) (22), jak ro´wniez˙ chinolony starszej generacji m.in. kwasy nalidyksowy i oksolinowy (19, 20, 22, 23).
Z przegla˛du pis´miennictwa z okresu ostatnich kilku lat wynika, z˙e ste˛z˙enia pozostałos´ci leko´w chinolonowych w poddawanych kontroli produktach spoz˙ywczych sa˛ niz˙sze od wartos´ci MRL obowia˛zuja˛cych w Unii Europejskiej (6, 9, 18).
M e t o d y o z n a c z a n i a c h i n o l o n o´ w w p r o´ b k a c h z˙ y w n o s´ c i
Wprowadzenie norm dotycza˛cych zawartos´ci pozostałos´ci antybiotyko´w w z˙ywnos´ci wia˛z˙e sie˛ z koniecznos´cia˛ monitoringu ich ste˛z˙en´ w ro´z˙nych produktach spoz˙ywczych. Pro´bki z˙ywnos´ci, dla kto´rych uzyskano, przy zastosowaniu szybkich testo´w mikrobiologicznych, wynik wskazuja˛cy na obecnos´c´ antybiotyko´w, powinny byc´ poddane szczego´łowej analizie jakos´ciowo-ilos´ciowej. Koniecz-nos´c´ taka, wynika z ro´z˙nic w wartos´ciach ste˛z˙en´ MRL chinolono´w ustalonych dla poszczego´lnych tkanek zwierze˛cych, jak ro´wniez˙ z moz˙liwos´ci obcia˛z˙enia badanych produkto´w antybiotykami innymi niz˙ chinolonowe (4, 24).
Badania nad opracowaniem procedur analitycznych oznaczania chinolono´w w z˙ywnos´ci zmierzaja˛ do wyznaczenia optymalnych warunko´w analitycznych pozwalaja˛cych na jednoczesna˛ identyfikacje˛ i anali-ze˛ ilos´ciowa˛ s´ladowych pozostałos´ci maksymalnej liczby zwia˛zko´w z tej grupy antybiotyko´w, ro´wniez˙
Ryc. 1. Ogo´lny schemat analizy chinolono´w w pro´bkach z˙ywnos´ci. Fig. 1. General pattern for analysis quinolones in food samples.
tych, kto´re dotychczas nie zostały uwzgle˛dnione w rozporza˛dzeniach unijnych (4, 6, 12, 16–23, 25–28). Ze wzgle˛du na s´ladowe zawartos´ci chinolono´w w z˙ywnos´ci, prace analityczne prowadzono przy uz˙yciu pro´bek z˙ywnos´ci wzbogaconych w znane ilos´ci wybranych chinolono´w, kto´re analizowano ro´wnolegle z pro´bkami rzeczywistymi.
Jednym z najwaz˙niejszych, a zarazem najtrudniejszych etapo´w analizy z˙ywnos´ci jest wyekstrahowa-nie frakcji zawieraja˛cej chinolony i oczyszczewyekstrahowa-nie uzyskanego ekstraktu ze składniko´w biomatrycy, co ma na celu wyodre˛bnienie koncentratu zawieraja˛cego badane zwia˛zki. Opracowane dotychczas metody oznaczania chinolono´w w z˙ywnos´ci oparte sa˛ gło´wnie o techniki ekstrakcyjne (ekstrakcja ciecz-ciecz i ekstrakcja do fazy stałej) i chromatograficzne. Na ryc. 1 przedstawiono ogo´lny schemat procedury oznaczania tych zwia˛zko´w w z˙ywnos´ci, z uwzgle˛dnieniem etapo´w wyodre˛bniania, oczyszczania i zate˛z˙ania oraz identyfikacji.
Warunki analizy chinolono´w uzalez˙nione sa˛ w znacznej mierze od ich budowy chemicznej. Chinolony sa˛ aromatycznymi heterocyklicznymi zwia˛zkami azotu, pochodnymi chinoliny, naftyrydyny, cynoliny lub pirydopirymidyny. Obecnos´c´ w ich cza˛steczkach grupy ketonowej, karboksylowej lub podstawnika piperazynowego, jak ro´wniez˙ dodatkowych grup aminowych lub podstawnika fluorowego decyduje o włas´ciwos´ciach kwasowo-zasadowych tych zwia˛zko´w.
W zalez˙nos´ci od pH w roztworach wodnych chinolony z podstawnikiem piperazynylowym moga˛ wyste˛powac´ jako kationy, jony obojnacze lub aniony, podczas gdy pozostałe chinolony moga˛ tworzyc´ tylko forme˛ oboje˛tna˛ lub anionowa˛ (9). Wzory struktur tych zwia˛zko´w w zalez˙nos´ci od pH przed-stawiono poprzez ro´wnania ro´wnowagi na ryc. 2 (9).
Ryc. 2. Ro´wnania ro´wnowagi w roztworach wodnych chinolono´w. Fig. 2. Chemical equilibrium in aqueous solutions of quinolones.
Zakresy pKadla pochodnych piperazynowych wynosza˛ pK1: 5,5–6,6 i pK2: 7,2–8,9, natomiast dla pozostałych zwia˛zko´w z tej grupy pKamieszcza˛ sie˛ w zakresie 6,0–6,9.
P r z y g o t o w a n i e p r o´ b e k z˙ y w n o s´ c i d o a n a l i z y c h i n o l o n o´ w
Duz˙a złoz˙onos´c´ matrycy pro´bek z˙ywnos´ci pochodzenia zwierze˛cego decyduje o tym, z˙e stanowi ona bardzo trudny materiał analityczny. Ze wzgle˛du na obecnos´c´ białka i tłuszczu ekstrakcja cieczowa chinolono´w moz˙e zachodzic´ z powstawaniem emulsji i pian powoduja˛cych obniz˙enie wydajnos´ci tego procesu. Znacza˛cym utrudnieniem moz˙e byc´ ro´wniez˙ tworzenie sie˛ trwałych poła˛czen´ pomie˛dzy lipoproteinami i antybiotykami. Dlatego tez˙ w pocza˛tkowym etapie oznaczania chinolono´w w z˙ywnos´ci
wprowadza sie˛ proces usunie˛cia lipido´w i protein polegaja˛cy na ultrafiltracji pro´bki (12) lub hydrolizie przy uz˙yciu roztworo´w kwasu fosforowego (V) (18, 16 ), octowego (29), solnego (17), trichloro- (12, 21) ba˛dz´ trifluorooctowego (27), zwykle w obecnos´ci acetonitrylu (25, 26). Analiza pro´bek stałych wymaga wprowadzenia dodatkowego etapu rozdrobnienia i homogenizacji (4, 6, 9, 13, 18, 26). Tak przygotowa-ny materiał poddaje sie˛ ekstrakcji cieczowej przy zastosowaniu płuczki ultradz´wie˛kowej lub wirowania i mieszania, ba˛dz´ metoda˛ przys´pieszonej ekstrakcji rozpuszczalnikowej (Accelerated Solvent Extraction – ASE) (4, 19, 20). Do ekstrakcji uz˙ywa sie˛ najcze˛s´ciej wodnych roztworo´w acetonitrylu (12, 22, 25, 29), roztworo´w kwasu fosforowego (III) lub jego soli zawieraja˛cych acetonitryl (tj. roztworo´w buforowych o wartos´ci pH od ok. 2,6 do 9) (4, 18–20, 26).
Yorke i Froc (20) przeprowadzili badania nad wpływem pH na wydajnos´c´ ekstrakcji chinolono´w zawieraja˛cych w cza˛steczce podstawnik piperazynylowy. Odzyski wynosza˛ce ponad 70% uzyskano prowadza˛c ekstrakcje˛ przy wartos´ciach pH 4.65 i 9.18. Uwzgle˛dniaja˛c fakt, z˙e chinolony te posiadaja˛ dwie wartos´ci pKa(ok. 6 i ok. 9) (ryc. 3), w s´rodowisku kwas´nym wyste˛puja˛ one gło´wnie w formie kationowej, a w zasadowym – w formie anionowej. Przy wartos´ci pH ok. 7 wyste˛puja˛ w formie jono´w obojnaczych, słabo rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach polarnych. Ekstrakcje˛ chinolono´w z uz˙yciem łatwych do odparowania rozpuszczalniko´w organicznych stosuje sie˛ rzadko ze wzgle˛du na niska˛ wydajnos´c´ tego procesu (do 40%) (5, 20).
M e t o d y w y o d r e˛ b n i a n i a z e k s t r a k t u i z a t e˛ z˙ a n i a f r a k c j i c h i n o l o n o´ w W celu usunie˛cia endogennych składniko´w matrycy pro´bki z˙ywnos´ci, m.in. tłuszczu i barwniko´w i uzyskania koncentratu chinolono´w, w kto´rym w dalszej kolejnos´ci be˛da˛ mogły zostac´ oznaczone indywidualne zwia˛zki, konieczne jest poddanie wyodre˛bnionego z z˙ywnos´ci ekstraktu procesowi doczyszczenia (20, 22). Etap ten realizowany jest najcze˛s´ciej metoda˛ ekstrakcji do fazy stałej (Solid Phase Extraction – SPE) (19, 22). Do wyodre˛bnienia frakcji chinolono´w uz˙ywano m.in. z˙elu krzemionkowego modyfikowanego łan´cuchami oktadecylowymi (tzw. faza chemicznie wia˛zana RP-C18) (4, 5, 16, 17, 21), fazy polimerowej polistyrenowo-diwinylobenzenowej (SDB) (5, 12, 21) oraz wypełnienia mieszanego złoz˙onego z fazy chemicznie wia˛zanej C8 i wymieniacza jonowego (12). Zastosowanie kolumn wypełnionych makroporowatymi polimerami (np. SPE-Oasis, firmy Waters) stwarza moz˙liwos´c´ selektywnej adsorpcji wszystkich chinolono´w obecnych w badanych pro´bkach z˙ywnos´ci. Pecorelli i wspo´łpr. (5, 19) oznaczyli 13 zwia˛zko´w z grupy chinolono´w w koncentracie wyodre˛bnionym przy uz˙yciu tej fazy z pro´bek ryb i wieprzowiny. Posyniak i wspo´łpr. (21) prze-prowadzili badania nad okres´leniem optymalnych warunko´w ekstrakcji do fazy stałej fluorochinolono´w obecnych w ekstraktach wyodre˛bnionych z wa˛troby i mie˛sa drobiowego. Rozdziały przeprowadzono na kolumnach wypełnionych faza˛ RP-C8, RP-C18, faza˛ styrenowo-diwinylobenzenowa˛ (SDB), aminowa˛ (NH2) lub benzenosulfonowa˛ (C6H5SO3H). Badania wykazały, z˙e zastosowanie fazy benzenosulfonowej pozwala najskuteczniej oczys´cic´ frakcje˛ chinolono´w, m.in. z barwniko´w i innych substancji obecnych w matrycy biologicznej i uzyskac´ koncentrat tych zwia˛zko´w z wydajnos´cia˛ ok. 80% (21).
Obszerne badania dotycza˛ce doboru optymalnych warunko´w ekstrakcji do fazy stałej chinolono´w, kto´rych ste˛z˙enia (MRL) w produktach spoz˙ywczych powinny byc´ monitorowane zgodnie z rozpo-rza˛dzeniami unijnymi, zostały opisane przez Jiménez-Lozano i wspo´łpr. (5). Autorzy poro´wnali materiały adsorbuja˛ce chinolony wg ro´z˙nych mechanizmo´w retencji, tj. faze˛ RP-C18, fazy polimerowe: styrenowo-diwinylobenzenowe (SDB), diwinylobenzeno-N-winylopirolidynowe firmy Waters (Oasis--HLB) oraz faze˛ HLB modyfikowana˛ grupami dimetylobutyloaminowymi Oasis Max-Waters. Wykaza-no, z˙e obecnos´c´ grup funkcyjnych: karboksylowej, aminowej i podstawnika piperazynylowego w cza˛s-teczce chinolonu pozwala, poprzez zastosowanie fazy ruchomej o odpowiednim pH, na selektywna˛ elucje˛ tych zwia˛zko´w. Badania przy uz˙yciu mieszanin wzorcowych siedmiu chinolono´w oraz przy zastosowaniu ekstrakto´w wyodre˛bnionych z pro´bek mie˛sa wzbogaconego w te wzorce wykazały, z˙e polimerowe fazy SDB oraz Oasis Max charakteryzuja˛ sie˛ najwie˛ksza˛ selektywnos´cia˛ ekstrakcji chinolono´w i pozwalaja˛ osia˛gna˛c´ wydajnos´c´ tego procesu, wynosza˛ca˛ ponad 80% (5).
Caro i wspo´łpr. (30) opracowali nowa˛ metode˛ wydzielania enrofloksacyny i jej metabolitu ciprofloksacyny z mieszaniny chinolono´w, polegaja˛ca˛ na ich selektywnej sorpcji do polimeru modyfiko-wanego cza˛steczkami enrofloksacyny. Metoda ta oznaczana jest skro´tem MIP, z ang. Molecular Imprinted Polymer. Zastosowanie systemu SPE złoz˙onego z w/w fazy oraz z kolumny z wypełnieniem polimerowym Oasis HLB do wyodre˛bnienia chinolono´w z pro´bek moczu ludzkiego i wa˛troby wieprzowej umoz˙liwiło oznaczenie enrofloksacyny i ciprofloksacyny w zakresie ste˛z˙en´ niz˙szym od wartos´ci MRL (tab. I) obowia˛zuja˛cych w Unii Europejskiej.
Z przegla˛du pis´miennictwa wynika, z˙e w procedurach analizy chinolono´w w z˙ywnos´ci etap SPE był czasami zaste˛powany ekstrakcja˛ rozpuszczalnikowa˛ przy uz˙yciu heksanu lub mieszaniny heksanu z eterem etylowym. Rozpuszczalniki te pełniły role˛ zaro´wno ekstrahenta, jak i czynnika usuwaja˛cego tłuszcz z badanego ekstraktu (21, 23).
M e t o d y o z n a c z e n´ j a k o s´ c i o w o - i l o s´ c i o w y c h
Do oznaczania chinolono´w w pro´bkach z˙ywnos´ci stosowano najcze˛s´ciej technike˛ wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (4, 16, 17, 21, 23, 27). Rozdzielenie frakcji zawieraja˛cej chinolony prowadzono przy zastosowaniu kolumn z faza˛ chemicznie wia˛zana˛ RP-18 (4, 12, 13, 17, 22), C-5 (19) lub C-8 (21, 27, 28) jak ro´wniez˙ kolumn z faza˛ modyfikowana˛ rodnikami fenylowymi (16, 29) lub grupami amidowymi (9). Ze wzgle˛du na moz˙liwos´c´ wysta˛pienia tzw. „ogonowania” sygnało´w na chromatogramach, spowodowanego silnym oddziaływaniem polarnych chinolono´w z faza˛ stacjonarna˛, stosowano najcze˛s´ciej kolumny z faza˛ polimerowa˛ (9) lub kolumny typu „endcappted”, zawieraja˛ce faze˛, w kto´rej aktywne grupy funkcyjne na powierzchni z˙elu krzemionkowego zostały zdezaktywowane grupami niepolarnymi np. metylowymi (12). Fazy ruchome wykorzystywane do rozdzielenia mieszanin chinolono´w były najcze˛s´ciej roztworami wodnymi metanolu (6, 13) lub acetonitrylu (4, 12, 16–18, 21–23, 27) o wartos´ciach pH w zakresie 2-4 uzyskiwanych poprzez zastosowanie buforo´w fos-foranowych lub roztworo´w kwasu cytrynowego ba˛dz´ szczawiowego. W układach złoz˙onych z chromato-grafu cieczowego i detektora masowego (LC-MS) kwasowe pH eluentu zapewniano poprzez dodatek lotnych składniko´w do fazy ruchomej, m.in. kwasu octowego, octanu amonu lub mro´wczanu amonu (9). Detekcje˛ chinolono´w rozdzielanych metoda˛ HPLC prowadzono najcze˛s´ciej za pomoca˛ detektora fluorescencyjnego (4, 6, 12, 13, 16, 18, 19, 21, 23, 26, 27, 29), spektrofotometrycznego UV (12, 32) lub detektora UV z matryca˛ fotodiodowa˛ UV-DAD (Ultra Violet – Diode Array Detector) (17, 19, 28). Do detekcji fluorescencyjnej wykorzystywano pasmo wzbudzenia przy długos´ci fali s´wiatłaλ = 325 nm i emisji w zakresie 350–400 nm dla chinolono´w kwas´nych oraz odpowiednio 275–280 nm (wzbudzenie) i 440–500 nm (emisja) dla pochodnych piperazynylowych. Ponadto w zakresie od 245 nm do 290 nm chinolony posiadaja˛ wa˛skie, specyficzne pasmo absorpcji promieniowania, kto´re moz˙e byc´ wykorzys-tywane do selektywnej analizy indywidualnych zwia˛zko´w. Formy kationowe chinolono´w, w kto´rych zwia˛zki te wyste˛puja˛ przy niskich zakresach pH, wykazuja˛ wyz˙sza˛ fluorescencje˛ niz˙ odpowiadaja˛ce im formy anionowe, dlatego tez˙, stosuja˛c detekcje˛ fluorescencyjna˛ rozdziały HPLC prowadzono przy optymalnym pH od 2 do 4 (9).
Coraz powszechniej stosowane poła˛czenie chromatografii cieczowej ze spektrometria˛ mas (LC-MS lub LC-MS/MS) nalez˙y do najsprawniejszych metod analitycznych, umoz˙liwiaja˛cych ro´wnoczesne rozdzielenie złoz˙onych mieszanin zwia˛zko´w organicznych wyodre˛bnionych z materiału biologicznego oraz wykonanie oznaczen´ jakos´ciowo-ilos´ciowych mieszaniny zawieraja˛cej kilkanas´cie zwia˛zko´w z grupy chinolono´w na poziomach ste˛z˙en´ niz˙szych od limito´w MRL (22, 24, 32–36). Jonizacje˛ tych zwia˛zko´w prowadzi sie˛ najcze˛s´ciej poprzez rozpylenie pro´bek w polu elektrycznym (ESI, Electrospray Ionization) (22) lub pod cis´nieniem atmosferycznym (API, Atmospheric Pressure Ionization) (9, 36). Analize˛ ilos´ciowa˛ prowadzono w systemie monitorowania wybranych jono´w powstaja˛cych w wyniku jonizacji (SIM – Selected Ion Monitoring) lub poprzez monitorowanie przebiegu reakcji jonizacji zachodza˛cych w spektrometrze mas (MRM – Multiple Reaction Monitoring) (9, 22, 36).
Chromatografia gazowa (GC) w sprze˛z˙eniu ze spektrometria˛ mas (MS) jest metoda˛ rzadko wykorzystywana˛ do analizy chinolono´w, gło´wnie ze wzgle˛du na koniecznos´c´ przeprowadzania ich w lotne pochodne, np. przy uz˙yciu borowodorku sodu NaBH4(9).
Do analizy chinolono´w wykorzystano ro´wniez˙ metody chromatografii planarnej (37, 38). Stosowano z˙el krzemionkowy (37, 38) lub z˙el krzemionkowy modyfikowany grupami cyjanowymi, aminowymi i hydroksylowymi (38) jako faze˛ stacjonarna˛ oraz polarne eluenty o niskim pH, zawieraja˛ce kwas mro´wkowy lub octowy, w celu rozdzielenia chinolono´w kwasowych lub roztwo´r metanolowy amoniaku, gdy rozdzielano ro´wnoczes´nie chinolony kwas´ne i zasadowe (piperazynylowe). Granice wykrywalnos´ci chinolono´w oznaczanych ta˛ metoda˛ wynosza˛ 10 ng (detekcja UV) i 0.2 ng (detekcja fluorescencyjna) (37). Kapilarna elektroforeza strefowa (Capillary Zone Electrophoresis – CZE) jest precyzyjna˛, dokładna˛ i szybka˛ metoda˛, cze˛sto stosowana˛ w analizie leko´w i ich metabolito´w, w tym ro´wniez˙ chinolono´w (5, 10, 39, 40). Rozdzielenie składniko´w mieszaniny naste˛puje w szklanej kapilarze zawieraja˛cej roztwo´r buforowy (elektrolit podstawowy), w kto´rej pod wpływem pola elektrycznego z ro´z˙na˛ pre˛dkos´cia˛ i w ro´z˙nych kierunkach przemieszczaja˛ sie˛ elektrycznie naładowane cza˛steczki analitu (41). Jiménez--Lozano i wspo´łpr. (5), stosuja˛c bufor fosforanowy o pH = 8.4, uzyskali w wyniku analizy trwaja˛cej
9 min rozdział mieszaniny zawieraja˛cej szes´c´ fluorochinolono´w oraz kwas oksolinowy. Zwia˛zki te oznaczono w pro´bkach mie˛sa drobiowego na poziomie ste˛z˙en´ niz˙szym od limito´w MRL. Wodny roztwo´r elektrolitu podstawowego moz˙e zostac´ modyfikowany rozpuszczalnikiem organicznym, co pozwala uzyskac´ lepsza˛ selektywnos´c´ rozdziału (10). Hernández i wspo´łpr. (10) zastosowali roztwo´r metanolu i acetonitrylu o pH = 4.5 zawieraja˛cy 4% kwasu octowego podczas analizy os´miu chinolono´w wyodre˛bnionych z pro´bek nerek wieprzowych. W elektroforezie kapilarnej stosowane sa˛ takie same metody detekcji jak w HPLC, najcze˛s´ciej UV/VIS i UV/DAD (5, 10, 41).
Metody immunochemiczne np. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) oraz luminescencyj-ne (29) nalez˙a˛ do szybkich, przesiewowych metod badan´ duz˙ej liczby pro´bek, jednak ze wzgle˛du na mała˛ selektywnos´c´ sa˛ stosowane gło´wnie do oznaczania sumarycznej zawartos´ci chinolono´w w matrycy pro´bek biologicznych (9).
PODSUMOWANIE
Chinolony stanowia˛ grupe˛ chemoterapeutyko´w o duz˙ej aktywnos´ci
bakteriobo´j-czej, powszechnie stosowanych przez weterynarzy w celach leczniczych oraz przez
hodowco´w jako promotory przyrostu masy ciała zwierza˛t. Ze wzgle˛du na
moz˙-liwos´c´ gromadzenia sie˛ chinolono´w w produktach z˙ywnos´ciowych, istnieje duz˙e
prawdopodobien´stwo naraz˙enia człowieka na te zwia˛zki. Obowia˛zuja˛ce w krajach
Unii Europejskiej rozporza˛dzenia s´cis´le okres´laja˛ wartos´ci dopuszczalnych ste˛z˙en´
pozostałos´ci (Maximum Residue Limits – MRL) chinolono´w w z˙ywnos´ci. W
ostat-nich latach, ze wzgle˛du na moz˙liwos´c´ stosowania coraz doskonalszych technik
analitycznych, wielu badaczy zaje˛ło sie˛ usprawnieniem metod oznaczania tych
zwia˛zko´w w ro´z˙nych produktach spoz˙ywczych. Obecnie do oznaczania chinolono´w
w pro´bkach z˙ywnos´ci stosowane sa˛ najcze˛s´ciej procedury ła˛cza˛ce ekstrakcje˛ do
fazy stałej SPE z wysokosprawna˛ chromatografie˛ cieczowa˛ lub z elektroforeza˛
kapilarna˛ z uz˙yciem detektora fluorescencyjnego lub spektrometru mas. Metody te
stwarzaja˛ moz˙liwos´c´ analizy pozostałos´ci chinolono´w w produktach spoz˙ywczych
na poziomie ste˛z˙en´ niz˙szym od obowia˛zuja˛cych w Unii Europejskiej wartos´ci
MRL.
B. J a n o s z k a, A. D a m a s i e w i c z-B o d z e k, L. W a r z e c h a QUINOLINIC ANTIBIOTICS IN FOOD