Badania stanu hemoglobiny

Spektroskopia mössbauerowska jest niezwykle czuª¡ metod¡ pozwalaj¡c¡ na detekcj¦ zmian stanów hemolgobiny. Parametry nadsubtelne uzyskiwane z widm mössbauerowskich umo»liwiaj¡ rozró»nianie stanów walencyjnych i spinowych »elaza, a tak»e liczby koordynacyjnej, scharakteryzowanie rodzaju ligandów oraz ich rozkªad.

Promieniowanie jonizuj¡ce γ i neutronowe mo»e bardzo ªatwo dotrze¢ do wn¦trza erytrocytów, a w przypadku gazu radonowego zasi¦g cz¡stek α wynosi ok. 30 µm, a wi¦c i w tym przypadku mo»na byªo si¦ spodziewa¢ wpªywu promieniowania α na ±rodowisko wewn¦trzne czerwonych ciaªek krwi. Tak wi¦c homeostaza, której staªe utrzymanie jest bardzo wa»ne do wªa±ciwego funkcjonowania erytrocytów, oraz zdolno±¢ Hb do przenoszenia tlenu, mo»e by¢ zakªócona przez promieniowanie jonizuj¡ce. ›elazo hemowe w zale»no±ci od stanu hemoglobiny tj. od przyª¡czonej cz¡stki, mo»e zmienia¢ swój stan walencyjny i spinowy. Dlatego badania stopnia utleniania »elaza hemowego s¡ cz¦sto stosowane w celu monitorowania stopnia wysycenia Hb tlenem, pojawienia si¦ DeoxyHb oraz patologicznych jej stanów.

7.2.2.1 Promieniowanie α

Na Rysunku 7.16 przedstawiono przykªadowe widma mössbauerowskie erytrocytów wyizolowanych z krwi zdrowej osoby (A i C) i pacjenta z cukrzyc¡ (B i D), niena±wietlanych i na±wietlanych. Stosowana dawka promieniowania α wynosiªa ok. 4,8 µGy. Warto±ci parametrów nadsubtelnych uzyskanych z dopasowania do danych eksperymentalnych przedstawionych na Rysunku 7.16 zebrane s¡ w Tabeli 7.2.

Rysunek 7.16: Widma mössbauerowskie erytrocytów pochodz¡cych z krwi zdrowej osoby (A, C) oraz pacjenta z cukrzyc¡ (B, D) odpowiednio niena±wietlanych i na±wietlanych promieniowaniem α o dawce ok. 4,8 µGy.

Tabela 7.2: Parametry nadsubtelne uzyskane z dopasowania teoretycznego widm mössbauerowskich niena±wietlanych i na±wietlanych (dawka ok. 4,8 µGy) erytrocytów zdrowych i pochodz¡cych od pacjenta z cukrzyc¡. IS przesuni¦cie izomeryczne; QS -rozszczepienie kwadrupolowe. Szeroko±¢ linii 0,20 ± 0,02 mm/s.

Widma zawieraj¡ trzy skªadowe, z których pierwsz¡ i drug¡ charakteryzuje podobne przesuni¦cie izomeryczne ∼0,17 mm/s, ale ró»ne rozszczepienia kwadrupolowe QS1 = 2,18 ± 0,03 mm/s oraz QS2 = 1,76 ± 0,15 mm/s. Parametry nadsubtelne pierwszej skªadowej s¡ charakterystyczne dla OxyHb, której szóstym ligandem jest O2 (»elazo znajduje si¦ w niskospinowym stanie Fe2+), natomiast druga skªadowa pochodzi od DeoxyHbOH, której szóstym ligandem zamiast O2jest OH, a »elazo jest w mieszanym stanie walencyjnym Fe2+/Fe3+

[83]. Trzecia skªadowa o najmniejszym przesuni¦ciu izomerycznym oraz rozszczepieniu kwadrupolowym ok. 0,6 mm/s odpowiada methemoglobinie (MetHb), w której do »elaza hemowego przyª¡czona jest cz¡steczka H2O (»elazo jest w stanie Fe3+) [83]. W Tabeli 7.2 zebrane s¡ tak»e udziaªy procentowe poszczególnych skªadowych. Jak wida¢ najwi¦kszy udziaª w widmie mössbauerowskim pochodzi od OxyHb, a zawarto±¢ pozostaªych dwóch skªadowych jest porównywalna i wynosi ok. 17%.

Poniewa» nie zarejestrowano znacz¡cych ró»nic, pomi¦dzy przypadkami niena±wietlanymi i na±wietlanymi, mo»na stwierdzi¢, »e zastosowana dawka promieniowania α nie zmieniªa wewn¦trznego ±rodowiska czerwonych ciaªek krwi, niezale»nie od ich pochodzenia (przynajmniej na takim poziomie, aby mogªo to wpªyn¡¢ na posta¢ hemoglobiny). Poniewa» promieniowanie α o dawce ok. 4,8 µGy nie wywoªaªo »adnych zmian tak»e w przypadku wyizolowanej Hb, to z caª¡ pewno±ci¡ mo»na potwierdzi¢, »e ewentualne zmiany powstaªe we wn¦trzu erytrocytów w wyniku dziaªania promieniowania α nie zaszªy w takim stopniu, aby mogªy wpªyn¡¢ na stan Hb.

7.2. Wpªyw promieniowania jonizuj¡cego na stabilno±¢ erytrocytów 115 7.2.2.2 Promieniowanie γ

Na Rysunku 7.17 przedstawiono przykªadowe widma mössbauerowskie erytrocytów wyizolowanych z krwi zdrowej osoby (A i C) i pacjenta z cukrzyc¡ (B i D), odpowiednio niena±wietlanych i na±wietlanych dawk¡ promieniowania γ o warto±ci ok. 1,8 mGy. Warto±ci parametrów nadsubtelnych uzyskanych z dopasowania do danych eksperymentalnych przedstawionych na Rysunku 7.17 zebrane s¡ w Tabeli 7.3.

Rysunek 7.17: Widma mössbauerowskie erytrocytów pochodz¡cych z krwi zdrowej osoby (A, C) oraz pacjenta z cukrzyc¡ (B, D) odpowiednio niena±wietlanych i na±wietlanych dawk¡ ok. 1,8 mGy.

Aby uzyska¢ dobre dopasowanie widma nale»aªo uwzgª¦dni¢ w widmie mössbauerowskim niena±wietlanych erytrocytów 3 skªadowe, a w widmie na±wietlanych czerwonych ciaªek krwi 4 skªadowe. We wszystkich widmach s¡ widoczne podwidma, których parametry s¡ charakterystyczne dla OxyHb (IS ∼ 0,16 mm/s, QS ∼ 2,17 mm/s) i DeoxyHbOH (IS ∼ 0,17 mm/s, QS ∼ 1,75 mm/s) oraz MetHb (IS ∼ 0,13 mm/s, QS ∼ 0,73 mm/s). Ponadto, w na±wietlanych promieniowaniem γ erytrocytach zarówno zdrowych, jak i pochodz¡cych od pacjenta z cukrzyc¡ pojawiaj¡ca si¦ czwarta skªadowa o IS ∼ 0,09 mm/s i QS ∼ 0,47 mm/s odpowiada prawdopodobnie zmienionej formie MetHb, któr¡ nazwano MetHbN AS. W Tabeli 7.3 zawarte s¡ równie» udziaªy poszczególnych stanów Hb. Zawarto±¢ OxyHb w zdrowych czerwonych ciaªkach krwi jest niewiele wi¦ksza od jej udziaªu w erytrocytach pochodz¡cych od pacjenta z cukrzyc¡. Zawarto±¢ DeoxyHbOH wynosi ok. 20%, a MetHb jest 2 razy mniej w krwinkach czerwonych osoby zdrowej ni» w erytrocytach pacjenta z cukrzyc¡. W wyniku na±wietlania w erytrocytach zdrowych i wyizolowanych z krwi pacjenta z cukrzyc¡ pojawiªa

si¦ nowa skªadowa o udziale ok. 12%, której parametry przypominaj¡ MetHb. Skªadowa ta, nazwana MetHbN AS najwyra¹niej powstaªa kosztem DeoxyHbOH i MetHb.

Tabela 7.3: Parametry nadsubtelne uzyskane z dopasowania teoretycznego widm mössbauerowskich niena±wietlanych i na±wietlanych (dawka ok. 1,8 mGy) erytrocytów zdrowych i pochodz¡cych od pacjenta z cukrzyc¡. IS przesuni¦cie izomeryczne; QS -rozszczepienie kwadrupolowe. Szeroko±¢ linii 0,20 ± 0,02 mm/s.

W tym przypadku zastosowana dawka promieniowania γ o warto±ci ok. 1,8 mGy wyra¹nie zmodykowaªa stan hemoglobiny, najprawdopodobniej w wyniku bezpo±redniego dziaªania z Hb jak i zmian powstaªywch we wn¦trzu erytrocytów. Jest to promieniowanie przenikliwe dla badanego materiaªu biologicznego.

7.2. Wpªyw promieniowania jonizuj¡cego na stabilno±¢ erytrocytów 117 7.2.2.3 Promieniowanie neutronowe

W niniejszej cz¦±ci przedstawione s¡ wyniki z bada« wpªywu niskich dawek promieniowania neutronowego na stabilno±¢ hemoglobiny w erytrocytach wyizolowanych z krwi dwóch ró»nych przedstawicieli zdrowych dawców ró»ni¡cych si¦ skªadem zjologicznych stanów hemoglobiny. Widma mössbauerowskie niena±wietlanych i na±wietlanych próbek s¡ zaprezentowane na Rysunku 7.18. Warto±ci parametrów nadsubtelnych uzyskane z danych eksperymentalnych zebrane s¡ w Tabeli 7.4.

Rysunek 7.18: Widma mössbauerowskie erytrocytów pochodz¡cych z krwi dwóch osób: przypadek 1 (A, C) oraz przypadek 2 (B, D) odpowiednio niena±wietlanych i na±wietlanych promieniowaniem neutronowym o warto±ci dawki ok. 45 µGy.

Dla przypadku 1 wyst¦puj¡ dwie skªadowe o parametrach IS1 ∼ 0,16 mm/s i QS1 ∼ 1,60 mm/s oraz IS2 ∼ 0,17 mm/s i QS2 ∼ 2,16 mm/s, w przypadku 2 pojawia si¦ dodatkowo DeoxyHb (IS ∼ 0,9 mm/s i QS ∼ 2,21 mm/s) zawieraj¡ca wysoko-spinowe »elazo Fe2+. W wyniku na±wietlania pojawiªa si¦ kolejna skªadowa nazwana MetHbN AS(IS ∼ 0,2 mm/s i QS ∼ 0,3 mm/s). Procentowy udziaª poszczególnych skªadowych w widmach mössbauerowskich jest podany w Tabeli 7.4. W obu przypadkach niena±wietlanych zawarto±¢ DeoxyHbOH jest zbli»ona. DeoxyHb pojawiaj¡ca si¦ u dawcy 2 powstaªa kosztem skªadowej OxyHb. Udziaª w widmie nowej skªadowej pojawiaj¡cej si¦ w wyniku na±wietlania w przypadku 1 wynosi ok. 4%, a w przypadku 2, ok. 13%. Dla dawcy 1 zaobserwowano spadek udziaªu MetHbN AS przy jednoczesnym wzro±cie zawarto±ci DeoxyHbOH. Dla dawcy 2 udziaª DeoxyHbOH pozostaje staªy, ale maleje zawarto±¢ DeoxyHb.

Tabela 7.4: Parametry nadsubtelne uzyskane z dopasowania teoretycznego widm mössbauerowskich niena±wietlanych i na±wietlanych (dawka ok. 45 µGy) erytrocytów zdrowych pochodz¡cych od dwóch dawców. IS - przesuni¦cie izomeryczne; QS - rozszczepienie kwadrupolowe. Szeroko±¢ linii 0,20 ± 0,02 mm/s.

Jak wida¢ z powy»szych danych promieniowanie neutronowe (ok. 45µGy) zmodykowaªo hemoglobin¦ i zmieniªo udziaª poszczególnych jej stanów.

Poniewa» promieniowanie neutronowe jest najbardziej przenikliwym promieniowaniem jonizuj¡cym i miaªo najwi¦kszy wpªyw na zmiany stanu hemoglobiny wewn¡trz erytrocytów obu dawców, przeprowadzono dodatkowo badania wpªywu promieniowania neutronowego na odwracalno±¢ wi¡zania tlenu przez Hb. Pomiary zostaªy przeprowadzone zgodnie z opisem zawartym w Podrozdziale 6.5. Na Rysunku 7.19 przedstawiono przykªadowe zale»no±ci czasowe widm mössbauerowskich poszczególnych skªadowych odpowiednio dla kontroli (A) oraz dla czerwonych ciaªek krwi eksponowanych na promieniowanie neutronowe (ok. 45 µGy) (B). Zaobserwowano, »e w przypadku kontrolnej próbki czerwonych ciaªek krwi zawarto±¢ DeoxyHbOH (Rysunek 7.19 A) z pocz¡tkowego poziomu ok. 60% malaªa z czasem poªowicznego zaniku ∼2 godz. osi¡gaj¡c stabilny udziaª na poziomie ok. 18% ju» po czasie ok. 8 godz. Równocze±nie poziom OxyHb zmieniaª si¦. Z poziomu ok. 40% w 1 godz. pomiaru, OxyHb wzrosªa do poziomu ok. 85% po 8 godz. pomiaru. W wyniku na±wietlania, jak wida¢ na Rysunku 7.19 B, odwracalne wi¡zanie O2 przez Hb ulegªo znacznemu spowolnieniu w porównaniu do niena±wietlanych erytrocytów. Czas poªowiczny zmian zawarto±ci OxyHb i DeoxyHbOH wzrósª prawie 4-krotnie do ok. 10 godz. Ponadto pojawiªy si¦ dodatkowe skªadowe w widmie mössbauerowskim. Dla pocz¡tkowych czasów byªa to DeoxyHb zjologiczna, a dla czasu powy»ej 13,5 godz. dodatkowo MetHbN AS, która pozostawaªa na staªym poziomie ok. 6%.

7.2. Wpªyw promieniowania jonizuj¡cego na stabilno±¢ erytrocytów 119

Rysunek 7.19: Zale»no±¢ czasowa zmian zawarto±ci DeoxyHbOH i OxyHb oraz pozostaªych stanów Hb wyst¦puj¡cych w poszczególnych widmach mössbauerowskich w erytrocytach dawcy 1 zbieranych co godzin¦. Erytrocyty niena±wietlane (A) i na±wietlane (B) promieniowaniem neutronowym o dawce ok. 45 µGy.

Poniewa» dla dªugich czasów pomiarowych wraz ze wzrostem ci±nienia parcjalnego tlenu zanika udziaª DeoxyHb zjologicznej, a udziaª OxyHb pozostaje na ni»szym poziomie (< 80%) ni» ma to miejsce w przypadku niena±wietlanej próbki, mo»na wnioskowa¢, »e MetHbN AS powstaje z formy zjologicznej DeoxyHb, która nie jest w stanie przyª¡czy¢ tlenu cz¡steczkowego O2. Powy»sze wyniki pokazuj¡, »e promieniowanie neutronowe o dawce ok. 45 µGy silnie wpªywa na zdolno±¢ bªony erytrocytów do przepuszczania gazów, w szczególno±ci O2 i N2 oraz modykuje zdolno±¢ Hb do przyª¡czania tlenu.

PODSUMOWANIE UZYSKANYCH WYNIKÓW

W celu sprawdzenia wpªywu bardzo niskich dawek promieniowania α, γ i neutronowego na ±rodowisko wewn¦trzne erytrocytów poprzez monitorowanie stanów hemoglobiny przeprowadzono badania dla najwy»szych warto±ci dawki równowa»nej zastosowanych w badaniach stabilno±ci erytrocytów opisanych w Podrozdziale 7.2.1. Pomiary mössbaurowskie pokazaªy, »e ok. 95 µSv (ok. 4,8 µGy) promieniowania α, nie wywoªywaªo »adnych zmian w równowadze wewn¦trznej czerwonych ciaªek krwi, ani bezpo±renio nie zmieniªo struktury Hb.

Promieniowanie γ o dawce ok. 1,8 mSv (ok. 1,8 mGy) powodowaªo pojawienie si¦ nowej skªadowej MetHbN AS o przesuni¦ciu izomerycznym ok. 0,08 ± 0,03 mm/s i rozszczepieniu kwadrupolowym ok. 0,47 ± 0,10 mm/s w erytrocytach zarówno pochodz¡cych od osoby zdrowej, jak i chorej na cukrzyc¦, na poziomie ok. 12%. Nowa skªadowa najprawdopodobniej powstaªa kosztem DeoxyHbOH i MetHb.

Natomiast ok. 450 µSv (ok. 45 µGy) promieniowania neutronowego tak»e ju» wpªyn¦ªo na stany hemoglobiny w erytrocytach na±wietlanych, w których pojawiª si¦ nowy stan Hb, MetHbN AS charakteryzuj¡cy si¦ IS ∼ 0,19 ± 0,08 mm/s i QS ∼ 0,32 ± 0,05 mm/s. Co wi¦cej pomiary w zale»no±ci od wysycenia tlenem pokazaªy, »e nowa forma MetHbN AS tworzy si¦ poprzez stan DeoxyHb. Badania odwracalnego przyª¡czenia O2 przez Hb w erytrocytach niena±wietlanych i na±wietlanych promieniowaniem neutronowym wskazuj¡ dodatkowo na zmian¦ przepuszczalno±ci bªony czerwonych ciaªek krwi dla O2 i N2 oraz zmodykowan¡ zdolno±¢ Hb do przyª¡czenia O2 w wyniku ekspozycji na to promieniowanie jonizuj¡ce.