Badania topograi i elastyczno±ci bªony erytrocytów

Na Rysunku 7.5 przedstawiono przykªadowe obrazy z mikroskopu fazowego oraz z mikroskopu siª atomowych erytrocytów pochodz¡cych z krwi osoby zdrowej (A, C) oraz pacjenta z nieleczonym nadci±nieniem i nieleczon¡ hipercholesterolemi¡ (B, D). Jak mo»na zaobserwowa¢ na prezentowanych obrazach, czerwone ciaªka krwi osób z pierwotnym nadci±nieniem i hipercholesterolemi¡ przyjmuj¡ ksztaªt elipsoidalny, który istotnie ró»ni si¦ od owalnego ksztaªtu erytrocytów zdrowych. Obserwowane zmiany w ksztaªcie krwinek nadci±nieniowych mog¡ by¢ powi¡zane z modykacj¡ struktur tworz¡cych szkielet bªonowy czerwonego ciaªka krwi. W tym celu przeprowadzono pomiary topograi czerwonych ciaªek krwi przy u»yciu AFM, który pozwala uzyska¢ obrazy wysokiej rozdzielczo±ci.

Rysunek 7.5: Przykªadowe obrazy erytrocytów wyizolowanych z krwi osoby zdrowej (A, C); pacjenta z nieleczonym nadci±nieniem i nieleczon¡ hipercholesterolemi¡ (B, D). (A), (B) obrazy z mikroskopu fazowego; (C), (D) obrazy 3D z mikroskopu siª atomowych.

Za pomoc¡ AFM badano zmiany struktury bªony erytrocytów pochodz¡cych od pacjentów z nieleczonym nadci±nieniem lub nieleczonym nadci±nieniem i nieleczon¡ hipercholesterolemi¡ i porównywano je do prawidªowej struktury zdrowych erytrocytów. Pomiary przeprowadzano przy cz¦±ciowym odwodnieniu komórek, co umo»liwiaªo obserwacj¦ sieci szkieletu bªonowego krwinek. Na Rysunku 7.6 przedstawiono, w tej samej skali, typowe obrazy struktury bªony erytrocytów pochodz¡cych z krwi osoby zdrowej (A) oraz pacjenta z nieleczonym nadci±nieniem i nieleczon¡ hipercholesterolemi¡ (B).

Rysunek 7.6: Przykªadowe obrazy AFM struktury bªony erytrocytów wyizolowanych z krwi osoby zdrowej (A); pacjenta z nieleczonym nadci±nieniem i nieleczon¡ hipercholesterolemi¡ (B). Powierzchnia skanowania wynosi 2 x 2 µm2. Biaªe linie na rysunkach (A) i (B) przedstawiaj¡ kierunki, wzdªu» których wyznaczano przekroje powierzchni bªony badanych erytrocytów (C) i (D). (C) - próbka zdrowa; (D) - próbka z nieleczonym nadci±nieniem i nieleczon¡ hipercholesterolemi¡.

Ju» na pierwszy rzut oka mo»na zauwa»y¢ ró»nice w strukturze szkieletu bªonowego erytrocytów pochodz¡cych od osób zdrowych i od pacjentów z nadci±nieniem pierwotnym i hipercholesterolemi¡. Szkielet bªonowy erytrocytów zdrowych przyjmuje struktur¦ plastra miodu podczas, gdy bªona komórek czerwonych wyizolowanych z krwi pacjentów z nadci±nieniem przyjmuje form¦ kolby kukurydzy. W celu ilo±ciowego opisu ró»nic w strukturach bªon dla przedstawionych i pozostaªych przypadków zmierzonych wykonano dodatkowo analiz¦ zaobserwowanych regularno±ci w postaci uwypukle« (opisanych przez odlegªo±ci) oraz wgª¦bie« (okre±lonych przez ±rednice) (Rysunek 7.7).

Na strukturach bªony pochodz¡cych od erytrocytów zdrowych wyznaczono drobne uwypuklenia o ok. 44 ± 13 nm oraz dªugie struktury o ok. 94 ± 36 nm, a tak»e wgª¦bienia o ±rednicy ok. 54 ± 20 nm (Rysunek 7.7 A, C, E, G). W przypadku strukrur bªony erytrocytów pochodz¡cych z krwi pacjentów z nieleczonym nadci±nieniem i nieleczon¡ hipercholesterolemi¡ zidentykowano wgª¦bienia o ±rednicy ok. 54 ± 22 nm oraz dwie ró»ne dªugo±ci uwypukle«

7.1. Wpªyw chorób na wªa±ciwo±ci erytrocytów 101

Rysunek 7.7: Rozkªad gaussowski struktur bªony erytrocytów pochodz¡cych od zdrowej osoby (A, C, E, G) oraz pacjenta z nieleczonym nadci±nieniem i nieleczon¡ hipercholesterolemi¡ (B, D, F, H). Drobne uwypuklenia (A, B), dªugie uwypuklenia (C, D) oraz wgª¦bienia (E, F), a tak»e (G, H) podªu»ne uwypuklenia (biaªa linia numer 2 na Rysunku 7.6 B). Na poszczególnych wykresach podane s¡ ±rednie warto±ci rozmiarów dla poszczególnych struktur powierzchni erytrocytu.

w ksztaªcie kolby kukurydzy ok. 82 ± 38 nm oraz ok. 188 ± 53 nm z drobnymi strukturami ok. 51 ± 21 nm (Rysunek 7.7 B, D, F, H). Wyst¦puje istotna ró»nica mi¦dzy rozmiarami dªugich struktur w przebadanej grupie pacjentów z pierwotnym nadci±nieniem oraz osób zdrowych.

W oparciu o obecn¡ wiedz¦ na temat budowy szkieletu bªonowego erytrocytów (patrz Podrozdziaª 2.2) dªugie struktury o warto±ci ok. 94 ± 36 nm oraz ok. 82 ± 38 nm odpowiadaj¡ dimerom spektryny, natomiast najdªu»sze struktury o warto±ci ok. 188 ± 53 nm obserwowane jedynie w przypadku erytrocytów pochodz¡cych od osób chorych (nieobecne w zdrowych czerwonych ciaªkach krwi), s¡ zwi¡zane z tetramerami spektrynowymi. Drobne struktury obserwowane pomi¦dzy lub na lamentach spektrynowych prawdopodobnie s¡ zwi¡zane z kompleksem ankirynowym lub biaªek wi¡»¡cych [5, 117]. Mog¡ one odpowiada¢ monomerom aktynowym, które s¡ poª¡czone z cz¡steczk¡ tropomiozyny (o dªugo±ci ok. 33 - 34 nm) i biaªkiem wi¡»¡cym tropomiozyn¦, tropomodulin¡ (ok. 14 ± 2,4 nm) [118]. Gdy, szkielet bªonowy jest stabilizowany poprzez wi¡zanie z ankiryn¡, która wyst¦puje ok. 80 nm od ko«cowego ogonka spektryny, obserwujemy struktury wªa±nie wielko±ci ok. 40 - 50 nm. Odlegªo±¢ pomi¦dzy dwoma ankirynami zwi¡zanymi z tetramerem spektryny wynosi ok. 40 nm [5, 118], do których drobne uwypuklenia równie» mog¡ by¢ przypisane.

W przypadku komórek czerwonych pochodz¡cych z krwi pacjentów z nadci±nieniem nieleczonym, gdy struktury typu kolby kukurydzy dominuj¡ szkielet bªonowy, mo»na wnioskowa¢, »e zanik struktury heksagonalnej zwi¡zany jest z utrat¡ stabilno±ci poª¡czenia spektryna-aktyna-adducyna [5, 117].

Na schemacie (Rysunek 7.8) przedstawiono proponowany mechanizm tworzenia si¦ struktury kolby kukurydzy w przypadku szkieletu membranowego erytrocytów pochodz¡cych od pacjentów z nadci±nieniem t¦tniczym i hipercholesterolemi¡.

Rysunek 7.8: Schemat bªony erytrocytów pochodz¡cych od osób zdrowych (A) oraz pracjentów z nieleczonym pierwotnym nadci±nieniem i nieleczon¡ hipercholesterolemi¡ (B).

7.1. Wpªyw chorób na wªa±ciwo±ci erytrocytów 103 Badanie sztywno±ci bªon erytrocytów

W celu zbadania elastyczno±ci bªony zdrowych erytrocytów i pochodz¡cych od pacjentów z pierwotnym nadci±nieniem przy u»yciu AFM zebrano krzywe siªowe z powierzchni mierzonych czerwonych ciaªek krwi. Na Rysunku 7.9 przedstawiono histogramy wyznaczonych z analizy krzywych siªowych warto±ci moduªów Younga dla poszczególnych przypadków (patrz Podrozdziaª 5.3).

Rysunek 7.9: Histogramy warto±ci moduªów elastyczno±ci wyznaczonych z analizy krzywych siªowych zebranych na powierzchni erytrocytów pochodz¡cych od osób zdrowych (A); pacjentów z nieleczonym nadci±nieniem (B); pacjentów z nieleczonym nadci±nieniem i nieleczon¡ hipercholesterolemi¡ (C); pacjentów z nieleczon¡ hipercholesterolemi¡ (D).

W przypadku zdrowych czerwonych ciaªek krwi (Rysunek 7.9 A) poszczególne warto±ci moduªów Younga zawieraj¡ si¦ w przedziale ok. 1,4 - 20 kPa, gdzie najwi¦cej przypadków zaobserwowano wokóª warto±ci ok. 3,65 kPa (49 przypadków). Dla erytrocytów pacjentów z pierwotnym nadci±nieniem t¦tniczym (Rysunek 7.9 B) warto±ci moduªu elastyczno±ci mieszcz¡ si¦ w zakresie od ok. 2 do 50 kPa z najwi¦ksz¡ liczb¡ przypadków wokóª dwóch warto±ci moduªu Younga: a) (98 przypadków) przy ok. 9,7 kPa; oraz b) (82 przypadki) przy ok. 21,2 kPa. Warto±ci moduªu Younga dla przypadku krwinek czerwonych pochodz¡cych od pacjentów z nieleczonym nadci±nieniem i nieleczon¡ hipercholesterolemi¡ (Rysunek 7.9 C) zmieniaj¡ si¦ od ok. 2 do 26 kPa, przy czym najwi¦ksz¡ liczb¦ przypadków zarejestrowano wokóª warto±ci ok. 4,7 kPa (202 przypadki). Dla erytrocytów pochodz¡cych od pacjentów

z nieleczon¡ hipercholesterolemi¡ (Rysunek 7.9 D) warto±ci moduªu Younga rozªo»one s¡ w zakresie od ok. 2,4 do 56 kPa. Zaobserwowano skupienie warto±ci moduªu elastyczno±ci wokóª dwóch warto±ci: a) (229 przypadków) przy ok. 6,4 kPa; b) (89 przypadków) przy ok. 35 kPa.

Powy»sze wyniki pokazuj¡, »e wyznaczone warto±ci moduªu Younga w przypadku erytrocytów osób zdrowych i z nieleczonym nadci±nieniem oraz z nieleczon¡ hipercholesterolemi¡ s¡ do siebie zbli»one i najwi¦cej przypadków zaobserwowano dla E ∼ 1,4 - 7,7 kPa. Jednak»e ro±nie liczba przypadków o zwi¦kszonym module Younga dla E > 7,7 kPa. Tendencja ta jest zgodna z obserwacj¡, »e czerwone ciaªka krwi pochodz¡ce od pacjentów z nieleczonym nadci±nieniem wykazuj¡ zwi¦kszon¡ sztywno±¢. ‘redni moduª Younga wynosi ok. 15,5 kPa, natomiast sama hipercholesterolemia powoduje, »e ro±nie elastyczno±¢ bªony erytrocytów, ale pojawiaj¡ si¦ te» wyra¹nie oddzielone obszary o zwi¦kszonej sztywno±ci (3-krotnie) w stosunku do warto±ci moduªu Younga wyznaczonego dla erytrocytów osób z nieleczonym nadci±nieniem.

Pomiary pokazuj¡, »e zmieniona organizacja szkieletu bªonowego w przypadku czerwonych ciaªek krwi pacjentów z nadci±nieniem lub hipercholesterolemi¡ istotnie wpªywa na elastyczno±¢ komórek, a tym samym na pªynno±¢ bªony komórkowej. Planowane s¡ dalsze badania w tym kierunku w celu zwi¦kszenia statystyki przypadków.