Spektroskopia absorpcyjna w zakresie nad oletu (UV) i ±wiatªa widzialnego (VIS) nale»y do najbardziej rozpowszechnionych metod wykorzystywanych od wielu lat w laboratoriach analitycznych. Metoda ta mo»e by¢ wykorzystywana do identy kacji próbek (gazowych, ciekªych, staªych), które absorbuj¡ promieniowanie w zakresie 200-800 nm [4].
5.1.1 Promieniowanie elektromagnetyczne
Promieniowanie elektromagnetyczne ma natur¦ korpuskularno-falow¡. Fala elektormagnetyczna, czyli zaburzenie rozchodz¡ce si¦ w przestrzeni, jest scharakteryzowana przez dªugo±¢ fali λ oraz jej cz¦sto±¢ ν rozchodzenia si¦, które powi¡zane s¡ zale»no±ci¡ [55, 72]:
λ = c
ν (5.1)
gdzie: c = 299792458 m/s - pr¦dko±¢ rozchodzenia si¦ fali elektromagnetycznej w pró»ni. Na Rysunku 5.1 jest pokazany szeroki zakres dªugo±ci fal promieniowania elektromagnetycznego.
Promieniowanie elektromagnetyczne w opisie korpuskularnym jest strumieniem bezmasowych cz¡stek zwanych fotonami, które nios¡ ±ci±le okre±lon¡ energi¦ E [72]:
E = hν = hc
λ (5.2)
gdzie: h - staªa Plancka (6, 625 · 10−34J · s).
5.1.2 Absorpcja promieniowania elektromagnetycznego
Cz¡steczka w wyniku oddziaªywania z promieniowaniem EM zmienia swoj¡ energi¦ ∆E. Zgodnie z postulatem Bohra ta zmiana energii mo»e by¢ zapisana równaniem [4]:
∆E = Ek− Ep =hν (5.3)
gdzie: Ek- energia cz¡steczki w stanie ko«cowym; Ep- energia cz¡steczki w stanie pocz¡tkowym; h - staªa Plancka; ν - cz¦stotliwo±¢ promieniowania.
Je±li Ek > Ep, to energia cz¡steczki ∆E > 0. Wówczas promieniowanie jest absorbowane przez cz¡steczk¦ i powstaje widmo absorpcyjne. Je±li Ek < Ep to ∆E < 0, a cz¡steczka, w tym przypadku, emituje nadmiar energii w postaci promieniowania EM i powstaje przy tym widmo emisyjne. Foton jest najmniejsz¡ ilo±ci¡ energii jaka mo»e by¢ zaabsorbowana lub emitowana przez cz¡steczk¦. Caªkowita energia cz¡steczki wynosi [4, 74]:
Etot = Eel+ Eosc+ Erot (5.4)
gdzie: Eel - energia elektryczna; Eosc - energia oscylacyjna; Erot - energia rotacyjna. Poszczególne skªadowe energii caªkowitej powi¡zane s¡ ze sob¡ nast¦puj¡co:
Eel>> Eosc>> Erot (5.5)
Zmiany energii rotacyjnej lub oscylacyjnej cz¡steczki zachodz¡ w zakresie podczerwieni i milimetrowych dªugo±ci fal radiowych, natomiast absorpcja promieniowania EM w zakresie UV/VIS powoduje zmiany energii elektronowej zale»nych od struktury elektronowej badanej cz¡steczki. Za absorpcj¦ promieniowania EM w zakresie bliskiego nad oletu oraz ±wiatªa widzialnego odpowiedzialne s¡ pewne wi¡zania ukªadów nienasyconych wyst¦puj¡ce w cz¡steczce: grupy z podwójnymi i potrójnymi wi¡zaniami (> C = C <, −C ≡ C−, −N = O, > C = O, > C = N, −N = N−, > C = S, −C = N) oraz ukªady aromatyczne i heteroaromatyczne [4]. S¡ to tzw. chromofory. Auksochromy, czyli grupy elektronodonorowe tj. −NH2, −OH, −N(R)2, −OCH3, wprowadzone do chromoforu powoduj¡ przesuni¦cie jego maksimum absorpcji w kierunku fal dªu»szych, tzw. przesuni¦cie batochromowe lub w kierunku fal krótszych okre±lanego jako przesuni¦cie hipsochromowe [4].
5.1.3 Prawa absorpcji
Je±li wi¡zka ±wiatªa o nat¦»eniu I0pada na próbk¦, to jej cz¦±¢ mo»e ulega¢ odbiciu, rozproszeniu oraz absorpcji. Mo»na to zapisa¢ równaniem [4, 75]:
I0 = Iodb+ Iroz+ Iabs+ I (5.6)
gdzie: I0 - nat¦»enie ±wiatªa padaj¡cego; Iodb - nat¦»enie ±wiatªa odbitego; Iroz - nat¦»enie ±wiatªa rozproszonego; Iabs - nat¦»enie ±wiatªa pochªoni¦tego; I - nat¦»enie ±wiatªa przechodz¡cego. Je»eli wi¡zka pada prostopadle na próbk¦ b¦d¡c¡ klarownym roztworem,
5.1. Spektroskopia absorpcyjna 63 to warto±ci Iodb oraz Iroz s¡ niewielkie i mo»na je pomin¡¢. Wówczas gªówn¡ przyczyn¡ osªabienia promieniowania EM jest jego absorpcja. Zgodnie z pierwszym prawem absorpcji (prawem Bouguera-Lamberta), nat¦»enie promieniowania przechodz¡cego zale»y od liczby cz¡stek absorbuj¡cego o±rodka, na który pada wi¡zka promieniowania. Przyjmuj¡c, »e liczba cz¡stek absorbuj¡cych to dªugo±¢ drogi promieniowania (grubo±¢ warstwy pochªaniaj¡cej) l, to nat¦»enie przechodz¡cego przez próbk¦ promieniowania jest równe:
I = I0e−al (5.7)
gdzie: a - staªa absorpcji (wspóªczynnik absorpcji).
Je»eli badana próbka jest roztworem, to nat¦»enie promieniowania monochromatycznego przechodz¡cego zale»y od st¦»enia substancji absorbuj¡cej c:
I = I0e−alc (5.8)
Jest to równanie Bouguera-Lamberta-Beera zwane drugim prawem absorpcji, z którego po przeksztaªceniu i zaªo»eniu, »e st¦»enie c wyra»one jest w mol · dm−3 otrzymujemy wzór na absorbancj¦ A:
A = εlc (5.9)
gdzie: ε - molowy wspóªczynnik absorpcji.
Trzecim prawem absorpcji jest prawo addytywno±ci absorbancji mówi¡ce, »e je»eli w danym roztworze znajduje si¦ mieszanina substancji o absorbancjach A1, A2, A3,..., An oraz je»eli poszczególne skªadniki nie oddziaªuj¡ ze sob¡, to absorbancja tego roztworu wynosi:
A = A1+ A2+ A3+ ... + An (5.10)
Stosunek nat¦»enia ±wiatªa przechodz¡cego I do padaj¡cego I0 nazywany jest transmitancj¡ T (wspóªczynnikiem transmisji)
I I0
= T (5.11)
Zale»no±¢ ª¡cz¡ca absorbancj¦ z transmitancj¡ przedstawia równanie
A = −logT (5.12)
5.1.4 Spektrofotometry
Urz¡dzeniem do pomiarów absorpcji (lub transmisji ciaª staªych, ciekªych i gazowych) jest spektrofotometr. Gªównymi cz¦±ciami spektrofotometru s¡: ¹ródªo ±wiatªa emituj¡ce promieniowanie o ci¡gªym widmie, monochromator selekcjonuj¡cy wi¡zk¦ promieniowania, statyw dla kuwety z badanym roztworem, fotodetektor rejestruj¡cy promieniowanie po przej±ciu przez próbk¦.
Wyró»nia si¦ spektrofotometry [75, 76]:
• klasyczne, w których monochromator znajduje si¦ przed badan¡ próbk¡, a wyselekcjonowane kolejne przez niego wi¡zki ±wiatªa monochromatycznego, po przej±ciu przez próbk¦ sukcesywnie dochodz¡ do detektora.
• z detekcj¡ równolegª¡, w których promieniowanie polichromatyczne przechodzi przez kuwet¦ z badan¡ substancj¡, a nast¦pnie ulega rozszczepieniu. Kolejno caªe wi¡zka pada na matryc¦ fotodiodow¡, w której ka»da fotodioda mierzy nat¦»enie promieniowania dla okre±lonej dªugo±ci fali.
• jednowi¡zkowe, w których wi¡zka ±wiatªa przechodzi najpierw przez odno±nik, a nast¦pnie po zamianie kuwet, przechodzi ona przez badan¡ substancj¦.
• dwuwi¡zkowe, w których odpowiednio wyselekcjonowana przez monochromator wi¡zka zostaje podzielona na dwie równe cz¦±ci przechodz¡ce jednocze±nie jedna przez kuwet¦ z odno±nikiem, a druga przez kuwet¦ z badan¡ substancj¡.
Na Rysunku 5.2 przedstawiono schematyczn¡ budow¦, spektrofotometru Varian Cary 50 Bio, wykorzystywanego w niniejszej pracy do badania widm absorpcyjnych.
Rysunek 5.2: Schemat budowy spektrofotometru Varian Cary 50 Bio [77].
wiatªo z wysokoci±nieniowej lampy ksenonowej, która emituje widmo ci¡gªe o staªej mocy, pada na monochromator, czyli ukªad skªadaj¡cy si¦ ze szczeliny wej±ciowej, siatki dyfrakcyjnej i szczeliny wyj±ciowej. Tutaj nast¦puje wydzielenie interesuj¡cego zakresu dªugo±ci fali. Promie« kolejno pada na rozdzielacz wi¡zki, który dzieli strumie« na wi¡zk¦ odniesienia i na wi¡zk¦, która przechodzi przez kuwet¦ z badan¡ substancj¡. Jednocze±nie, w tym miejscu, nast¦puje korekcja wi¡zki próbkowania wzgl¦dem wi¡zki odniesienia. Strumie« wi¡zki ±wietlnej przetworzony przez fotodetektory na sygnaª elektryczny jest wzmacniany i po przej±ciu przez system elektroniczny, wy±wietlany na monitorze komputera w postaci widma absorpcyjnego badanej substancji z uwzgl¦dnieniem widma odniesienia. Pomiar wi¡zki odniesienia dla rozpuszczalnika, który wchodzi w skªad badanego roztworu jest pierwsz¡ czynno±ci¡, któr¡ si¦ wykonuje przyst¦puj¡c do badania widm absorpcyjnych danej substancji. Pomiar ten jest zapisywany w pami¦ci komputera i ka»dorazowo uwzgl¦dniany w korekcji wi¡zki próbkuj¡cej w danej serii pomiarowej.
5.1. Spektroskopia absorpcyjna 65
5.1.5 Przykªadowe widma absorpcyjne hemoglobiny
Wªa±ciwo±ci spektralne hemoglobiny zale»¡ od specy cznych oddziaªywa« mi¦dzy hemem z odpowiednio przyª¡czonym ligandem a cz¦±ci¡ biaªkow¡. Warto±ciowo±¢ »elaza i rodzaj przyª¡czenia danego podstawnika, a tak»e struktura cz¦±ci biaªkowej i pier±cienia por rynowego maj¡ wpªyw na ksztaªt widm absorpcyjnych tego biaªka. Charakterystyczne widmo poszczególnych form hemoglobiny wyst¦puje w zakresie widzialnym (380-670 nm). W zakresie 390-440 nm hemoglobina ma pasmo absorpcji zwane pasmem Soreta, natomiast w zakresie 440-670 nm ma ona mniej intensywne pasma, których poªo»enie maksimów jest inne dla poszczególnych pochodnych Hb. Na Rysunku 5.3 przedstawiono widmo absorpcyjne dla hemoglobiny Hb, oksyhemoglobiny HbO2 oraz karboksyhemoglobiny HbCO, a w Tabeli 5.1 poªo»enia maksimów absorpcyjnych niektórych pochodnych hemoglobiny.
Rysunek 5.3: Zale»no±¢ absorpcji pochodnych form hemoglobiny od dªugo±ci fali [78]. Tabela 5.1: Poªo»enia maksimów absorpcyjnych czterech istotnych klinicznie pochodnych hemoglobiny [79, 80].