Dynamiczne rozpraszanie światła
Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS, Dynamic Light Spectroscopy) zwane również spektroskopią korelacji fotonów (PCS, Photon Correlation Spectrosopy) jest ważną techniką stosowaną w nauce i przemyśle. Pozwala na badanie własności zawiesin, roztworów koloidów, biologicznych roztworów, makromolekuł i polimerów. Jest to metoda nieinwazyjna i nieniszcząca, umożliwiająca pomiar cząstek w szerokim zakresie: od ok. 1 nm do kilku μm. Podczas pomiaru DLS wiązka światła rozpraszana jest na cząstkach zawieszonych w roztworze, które znajdują się w ciągłym, losowym ruchu Browna. Zmiany natężenia rozproszonego światła, spowodowane tym ruchem niosą informację dotyczącą współczynnika dyfuzji badanych cząstek. W przypadku sferycznych cząstek pozwala to przy użyciu równania Stokes'a – Enstein'a na obliczenie ich promienia hydrodynamicznego RH. Jest to promień, jaki miałaby twarda sfera o takim samym współczynniku dyfuzji jak badana cząstka. [80]
Df
= kBT
6π ηRH , (2.4.1)
gdzie: kB stała Boltzmanna, T – temperatura, η – lepkość otaczającego nanocząstki roztworu. Na Rys. 2.13. przedstawiony został schemat pokazujący zasadę działania układu do pomiarów metodą DLS. Składa się on z wiązki lasera, oświetlającego próbkę, detektora ustawionego pod kątem rozpraszania θ, mierzącego intensywność rozproszonego światła I(θ, t). Zazwyczaj wiązka wchodząca i rozproszona są formowane na elementach optycznych (apertura, szczelina lub soczewka). Obszar próbki, z którego rejestrowany jest sygnał to ten, przez który przechodzi wiązka padająca i rozproszona (zaznaczony na Rys. 2.13. na czerwono). W komercyjnych systemach pomiarowych najczęściej używany jest laser He-Ne o długości fali 633 nm, kąt, pod jakim mierzone jest rozproszone światło to najczęściej 90° lub 173°. [80-81]
Rys. 2.13. Zasada pomiarów metodą DLS [81].
Cząsteczki znajdujące się w oświetlonym obszarze znajdują się pod działaniem pola elektrycznego padającej fali światła. Na ich ładunki działa siła, która je przyspiesza. W konsekwencji prowadzi to do wypromieniowania światła. Jeśli oświetlone regiony są optycznie różne, tzn. mają różne stałe dielektryczne, amplitudy rozproszonego światła nie będą takie same. Można powiedzieć, że rozproszenie światła jest skutkiem lokalnych fluktuacji stałej dielektrycznej badanego medium. Molekuły ciągle przemieszczają się i rotują (tzw. ruchy Browna). Sprawia to, że stała dielektryczna w danym miejscu nieustannie zmienia się, co daje wkład w rozpraszanie światła.[81]
Teoria rozpraszania Rayleigha i Mie
Klasyczna teoria rozpraszania została wprowadzona przez Lorda Rayleigha. Jednym z założeń tej teorii jest rozmiar cząsteczek - znacznie mniejszy od długości fali. Dla przykładu
dla lasera He-Ne o dł. fali 633 nm w przybliżeniu mogłyby to być cząstki o rozmiarach mniejszych niż λ/10, czyli ok 60 nm. Wiele badanych cząstek, zwłaszcza biomolekuł nie spełnia tego założenia.
Teorią, która opisuje zjawisko rozpraszania niezależnie od rozmiaru cząstki jest teoria rozpraszania, wprowadzona przez Gustava Mie. Dzięki niej można przeliczyć rozkład intensywności rozproszonego promieniowania na rozkład objętości lub liczby cząstek.
Gdy cząstka ma rozmiar większy od długości fali rozproszone promieniowanie ma większą intensywność w kierunku „do przodu” (Rys.2.14.a). Gdy cząstka ma rozmiar porównywalny z długością fali pojawiają się minima i maxima w zależności od kąta obserwacji. Teoria Mie dokładnie rozwiązuje równania Maxwella i przewiduje istnienie maksimów i minimów intensywności światła, gdy średnica cząstki d ~ λ (Rys.2.14.b). Światło rozproszone od cząstki mającej rozmiary mniejsze od długości fali ma izotropowy rozkład we wszystkich kierunkach i może być opisywane przez mniej złożoną teorię Rayleigha. [81, 83]
Rys. 2.14. a) rozkład kątowy rozproszonego promieniowania w modelu Rayleigh'a i Mie. b) Minima i maksima rozproszonego promieniowania zależą od kąta obserwacji, co schematycznie pokazano na rysunku b).[81]
Intensywność rozproszonego promieniowania I(q, t) fluktuuje w czasie. Wielkość q to wektor falowy, q=(4πn/λ) sin(θdls/2), gdzie: θdls-kąt rozpraszania, n-współczynnik załamania, λ-długość fali.
Im mniejsze są badane nanocząstki, tym szybciej się poruszają, co przekłada się na szybsze zmiany intensywności . Schematycznie zostało to pokazane na Rys. 2.15.a.
Rys. 2.15. Fluktuacje natężenia światła rozproszonego przez nanocząstki o dużym i małym promieniu. Mniejsze nanocząstki są bardziej podatne na działające siły, w związku z czym w ich przypadku intensywność rozproszonego światła zmienia się szybciej. Rysunek pochodzi z [80].
Zależne od czasu fluktuacje natężenia I(q, t) mogą zostać scharakteryzowane przez wprowadzenie funkcji autokorelacji, zgodnie z poniższym wzorem [80]:
(2.4.2)
gdzie: τ = i Δt – przedział czasowy pomiędzy dwoma sygnałami I(q, i Δt) a I(q, (i+j) Δt). Przykładowe wykresy funkcji autokorelacji pokazane zostały na wykresie 2.15.b. Dla dużej liczby monodyspersyjnych cząstek, podlegających ruchom Browna funkcja korelacji posiada eksponencjalny zanik. Wykres funkcji korelacji daje wiele informacji na temat próbki. Między innymi dla mniejszych cząstek funkcja ta szybciej opada oraz próbki o większym stopniu monodyspersji charakteryzuje bardziej strome zbocze funkcji. [80]
Intensywność rozproszonego światła jest proporcjonalna do promienia nanocząstki w szóstej potędze. Stąd technika ta jest niezwykle czuła na obecność nawet bardzo małych ilości agregatów. Dla przykładu, jeśli badany koloid zawiera tyle samo cząstek o rozmiarach np. 5 i 50 nm rozkład natężenia będzie wyglądał jak na Rys.2.16.c. i stosunek I50 nm:I5 nm ~ 106. W przypadku rozkładu objętości: V50 nm:V5 nm ~ 103. Dzieje się tak, gdyż większe cząstki rozpraszają więcej światła. Rozkład intensywności może być przeliczony przy użyciu teorii rozpraszania Mie, współczynnika załamania i absorpcji na rozkład objętości lub liczby cząstek. [81]
Rys. 2.16. Różnice w rozkładach liczby i objętości cząstek oraz intensywności rozproszonego światła dla próbki zawierającej taką samą liczbę nanocząstek o rozmiarach 5 i 50 nm [81]. Z-average i polidyspersyjność próbki
Często wyniki DLS wyrażane są poprzez wartość z-average, znaną również jako średnią skumulowaną. Natężenie rozproszonego światła jest wprost proporcjonalne do szóstej potęgi promienia nanocząstek (kwadratu objętości). To powoduje, że w obliczaniu średniego promienia hydrodynamicznego należy wziąć pod uwagę te wagi, zgodnie ze wzorem [80]:
〈y 〉=
∑
iniRH ,6iyi∑
iniRH ,6i , (2.4.3)
gdzie ni – liczba cząstek o promieniu RHi.
Należy zaznaczyć, że z-average powinien być używany tylko w odniesieniu do monodyspersyjnych układów. W przypadku mieszanin cząstek znacznie różniących się rozmiarami wartość z-average nie opisuje w sposób odpowiedni wyników pomiarów, co pokazane zostało na Rys. 2.17.[80]
Rys. 2.17. Przykładowy rozkład dla próbki, w której obecne są cząstki o 2 różnych wielkościach. Z-average przyjmuje w tym przypadku wartość pośrednią [80].
Polidyspersyjność (PdI) jest parametrem używanym do określania szerokości rozkładu cząstek. Jeśli założymy, ze cząstki należą do jednej populacji opisywanej rozkładem Gaussa, wskaźnik polidyspersyjności (PdI, Polydispersity Index) będzie związany z odchyleniem standardowym σ w następujący sposób:
PdI= σ2
ZD2 , (2.4.4)
gdzie zD - rozmiar z-average, średni ważony promień hydrodynamiczny. Polidyspersyjność może być również przedstawiona jako:
PdI, równa względnej wariancji;
Pd, (Polidyspersyjność, absolutna polidyspersyjność) – równa jest odchyleniu standardowemu (σ) lub szerokości rozkładu;
%Pd = (PdI)1/2 x 100 - wielkość nazywana również względną polidyspersyjnością.
W przypadku badań białek z trzech współczynników wymienionych powyżej %Pd jest jednym z najczęściej używanych. Próbki o wartości %Pd <20% są uważane za monodyspersyjne. [81]
Potencjał zeta
Oddziaływania powierzchniowe stanowią istotne zagadnienie w przypadku nanocząstek ze względu na ich rozmiary i związaną z tym dużą powierzchnię czynną.
Podwójna warstwa elektryczna
Wokół naładowanych cząstek, zawieszonych w roztworze, w którym znajdują się jony tworzy się charakterystyczna podwójna warstwa elektryczna jonów o przeciwnym znaku. Bezpośrednio na powierzchni cząstki tworzą one gęsto upakowaną warstwę, nazywaną warstwą Sterna. Kolejne jony, odczuwają nie tylko przyciągającą siłę, pochodząca od cząsteczek koloidu, ale również odpychające oddziaływanie warstwy Sterna oraz sąsiednich jonów o tym samym znaku. [84, 86]
Rys. 2.18. Rozkład jonów wokół nanocząstki w roztworze. Rysunek na podstawie [86].
Tworzy się więc tzw. warstwa dyfuzyjna, o największym stężeniu jonów blisko powierzchni i stopniowym zaniku tego stężenia aż do uzyskania wartości równej stężeniu jonów w roztworze. Jeśli popatrzymy na zależność stężenia jonów o tym samym znaku, co cząstka zaobserwujemy ich brak przy powierzchni i stopniowe zwiększanie aż do uzyskania wartości równej stężeniu tych jonów w roztworze. Gęstość ładunku w jakimkolwiek punkcie równa
jest różnicy koncentracji dodatnich i ujemnych jonów. Osiąga największą wartość w pobliżu cząstki i stopniowo zanika do 0.
Warstwa Sterna i warstwa dyfuzyjna wokół cząstki nazywane są podwójna warstwą elektryczną. Grubość tej warstwy zależy od rodzaju i stężenia jonów w roztworze. Wynosi ona zwykle kilka nm i określana jest parametrem, zwanym odległością Deby'e: κ-1, definiowanym jako:
κ−1=
√
εrε0kBT2NAe2I
, (2.4.5)
gdzie: I – siła jonowa elektrolitu [mol/m3], ε0 – przenikalność dielektryczna próżni, εr – względna przenikalność dielektryczna, kB – stała Boltzmanna, T – temperatura, NA – stała Avogadra, e – ładunek elementarny.
W obrębie warstwy dyfuzyjnej istnieje umowna granica, nazywana płaszczyzną poślizgu, do której jony i nanocząstka tworzą stabilną całość. Gdy cząstka porusza się, jony te poruszają się wraz z nią. Różnica potencjału pomiędzy płaszczyzną poślizgu a roztworem nazywana jest potencjałem elektrokinetycznym lub potencjałem zeta. [86]
Stabilność koloidów. Teoria DLVO
Teoria DLVO (nazywana tak od jej twórców: Derjauguina, Landau'a, Verwey'a i Overbeeka) dostarcza klasycznego wyjaśnienia stabilności koloidów w zawiesinach. Zgodnie z tą teorią stabilność cząstki w roztworze zależy od jej całkowitego potencjału VT, gdzie [86]:
VT = VA + VR + VS, (2.4.6) VS to potencjał związany z solwentem, wnoszący marginalny wkład w VT. Znacznie większe znaczenie ma bilans pomiędzy przyciągającym (VA) i odpychającym (VR) oddziaływaniem, które opisują wzory [86]:
VA
= −A
12π D2 , (2.4.7) gdzie: A – stała Hamakera, D – odległość pomiędzy cząstkami,
VR=2π εaζ2exp(−κ D), (2.4.8) gdzie: a – promień cząstki, ε – przewodność dielektryczna solwenta, 1/κ – długość Debye'a, ζ – potencjał zeta.
Rys. 2.19. Zależność zmian energii swobodnej cząstki od odległości do innej cząstki zgodnie z teorią DLVO [86].
Bilans pomiędzy odpychającymi silami elektrostatycznymi i przyciągającymi silami van der Waalsa decyduje o stabilności cząstek w układzie lub ich tendencji do aglomeracji. Krzywa DLVO ma charakterystyczny kształt, w którym wyróżnić można barierę energetyczną, której wysokość wskazuje na to, jak bardzo stabilny stanowi koloid oraz jak dużą energię kinetyczną musiałyby mieć nanocząstki by pokonać tę barierę i znaleźć się w takiej odległości, gdzie przeważają oddziaływania van der Waalsa. [86]
Pomiar potencjału zeta. Metoda elektroforetyczna
Potencjał zeta może być mierzony przy wykorzystaniu różnych zjawisk: elektroforezy, elektroosmozy, potencjału przepływu, potencjału sedymentacji. Metoda elektroforetyczna używana jest najczęściej. [88]
Zjawisko elektroforezy zachodzi wtedy, gdy zawieszone w roztworze naładowane cząstki poddane są działaniu zewnętrznego pola elektrycznego. Prędkość naładowanych cząstek (v) w polu elektrycznym zależy od ich ładunku, natężenia pola (E), stałej dielektrycznej roztworu i jego lepkości. Stosunek tej prędkości do natężenia pola elektrycznego to ruchliwość elektroforetyczna [86]:
μE
=v
Potencjał zeta ζ powiązany jest z ruchliwością elektroforetyczną (wzór Henry'ego) [86]:
μE=
2ε ζ f (κa)
3η , (2.4.10)
gdzie: ε – stała dielektryczna, κ – odległość Debye'a, f(κa) – funkcja Henry'ego, η – współczynnik lepkości, a- współczynnik odnoszący się do promienia cząstki.
Wielkość potencjału zeta daje informację na temat stabilności dyspersji lub roztworu koloidalnego. Cząstki o dużej bezwzględnej wartości potencjału zeta dążą do wzajemnego odpychania. Nie mają więc tendencji do agregowania. Przyjmuje się, że dyspersja jest stabilna, jeśli |ζ| > 30 mV.
Rys. 2.20. Przykładowy wykres zależności potencjału zeta od pH roztworu. Rysunek pochodzi z [86]
Na wartość potencjału zeta mają wpływ różne czynniki. Między innymi pH i przewodność roztworu. Grubość podwójnej warstwy elektrycznej (odległość Debye'a κ-1) zależy od stężenia jonów w roztworze. A zatem im większa siła jonowa roztworu, tym mniejsza odległość Debye'a. Warto zauważyć, że zmiana grubości EDL może wpływać na dyfuzję cząstki, co skutkuje zmianą omawianego wcześniej i mierzonego metodą DLS promienia hydrodynamicznego cząstki. [86]