Termicznie stymulowana emisja światła pochodząca od naświetlonego wcześniej materiału (eksponowanego na działanie promieniowania elektromagnetycznego lub promieniowania cząstek, zwana termoluminescencją (TL) jest charakterystyczna dla szerokiej gamy materiałów: półprzewodników, minerałów, nieorganicznych i organicznych kryształów oraz złożonych systemów biologicznych. Wszystkie cechują się zdolnością magazynowania i przechowywania energii radiacyjnej w metastabilnych stanach pułapkowych, która może zostać uwolniona dzięki termicznej stymulacji. Energetyczna głębokość pułapek determinuje wartość charakterystycznych temperatur, dla których występują piki TL. Dla wyższych temperatur związane są one z uwalnianiem leżących głębiej pułapek (z rekombinacją par rodników lub par elektron – dziura) [71]. Zakres temperatur, w jakich możliwa jest obserwacja termoluminescencji jest szeroki: od -250ºC w roztworach barwników fotosyntetycznych, w zakresie od -50ºC do +50ºC dla większości najważniejszych pasm pochodzących od układu fotosyntetycznego do kilku setek ºC w minerałach i innych ciałach stałych. Teoria rekombinacji ładunku w procesach termoluminescencji została po raz pierwszy opracowana dla minerałów [71-73, 85].
Termoluminescencja fotosyntetyczna
Termoluminescencja fotosyntetyczna, początkowo odkryta w suchych chloroplastach okazała się być zjawiskiem wspólnym zarówno dla cyjanobakterii, alg jak i roślin wyższych. Sygnał TL pochodzi z PSII. Jego źródłem jest termicznie stymulowana opóźniona emisja światła wzbudzonych do stanu singletowego dimerów Chl a z P680, generowana dzięki rekombinacji między ładunkami ujemnymi zakumulowanymi na przenośnikach chinonowych i ładunkami dodatnimi zakumulowanymi na kompleksie manganowym.[72-73]
Różne pasma w widmie emisyjnym TL są skutkiem rekombinacji różnych par ładunków. Nawet małe zmiany stanów energetycznych par rodników wpływają na intensywność i położenie piku w widmie TL. Ta złożoność informacji w widmach TL może być wykorzystywana do selektywnego monitorowania efektów związanych z działaniem czynników stresowych.
Aby uzyskać widma TL konieczne jest schłodzenie próbki do niskiej temperatury i jej wzbudzenie. Po tym następuje jej ogrzewanie w ciemności z jednoczesną rejestracją emitowanego widma luminescencji. Standardowa aparatura TL pozwala na pomiary w szerokim zakresie temperatur.
Rys. 2.10. Schemat głowicy pomiarowej do rejestracji widma TL. Rysunek pochodzi z [72]
Pomiar TL można przeprowadzić zarówno na całych kawałkach liści, jak i izolowanych chloroplastach, izolowanych tylakoidach czy fotosystemach. Próbkę umieszcza się na holderze, który jest jednocześnie elementem grzewczo-chłodzącym (na holderze znajduje się najczęściej miedziany dysk). Do ogrzewania próbki wykorzystuje się efekt Peltiera a do chłodzenia – ciecz chłodzącą. Do detekcji termoluminescencji konieczne jest użycie wrażliwych na światło czerwone fotopowielaczy (red-sensitive photomultiplier tubes) z okienkiem chroniącym przed światłem aktynowym (używanym w czasie naświetlania próbki). Kształt krzywej wygrzewania zależy od temperatury i czasu ekscytacji, szybkości ogrzewania i ochładzania próbki ( w granicach od 0.5 do 18 ºC/s), intensywności i długości fali światła wzbudzającego, a także interwału czasowego jego stosowania oraz ilości błysków. W niskotemperaturowej aparaturze TL próbka jest schładzana do temperatury ciekłego azotu, by uniknąć przejścia kompleksu manganowego do wyższych stanów utlenienia. (Poniżej 200 K nie są obsadzane stany S2). Dostępne są także systemy wysokotemperaturowe, pozwalające na pomiary w zakresie do 200°C. [72]
Rysunek 2.11 przedstawia schemat emisji TL pochodzącej z rekombinacji ładunków w PSII.
Rys. 2.11. D1,...,Di i A1,...Ai – odpowiednio donory i akceptory w obrębie PSII; Przykładowo dla pasma Q: Ai i Di to odpowiednio: QA- i S2, dla pasma B: QB- i S2(S3). ΔG – energia swobodna aktywacji dla radiacyjnych rekombinacji ładunków dla poszczególnych par ładunków. W przybliżeniu odpowiada ona utracie energii swobodnej podczas separacji i stabilizacji ładunku. Przerywaną strzałką zaznaczona została nieradiacyjna rekombinacja ładunku. Kształt i położenie piku TL jest zdeterminowane wartością ΔG. Wyższa temperatura, przy której mierzony jest pik wskazuje na większą wartość ΔG, tzn. na głębiej stabilizowaną parę ładunków. Indukowana światłem separacja ładunków w centrum reakcji PSII prowadzi do powstania singletowej pary rodników 1[P680+·Pheo-·], po czym następuje sekwencyjna stabilizacja rozseparowanych ładunków, kiedy to powstają pary utlenionych donorów (D+) i zredukowanych akceptorów (A-). Podczas tego procesu część swobodnej energii pochodzącej z absorpcji światła jest tracona stabilizując rozseparowane pary ładunków. Rekombinacja pary D+A- zachodzi poprzez pośrednie stany stabilizacji ładunku w serii równowagowych reakcji do momentu, aż utworzy się para rodników P680+·Pheo-·. Ich rekombinacja skutkuje pojawieniem się ponownie singletowego stanu wzbudzonego P680*, który po przejściu do stanu podstawowego emituje światło. Rysunek pochodzi z [73].
Pomimo faktu, że aparat fotosyntetyczny nie odpowiada modelowi ciała stałego (elektronowej struktury pasm w półprzewodniku) główne charakterystyki widma TL mogą być opisane w oparciu o prosty model Randalla-Wilkinsa (1945) opracowany dla termoluminescencji ciał
stałych. Zgodnie z tym modelem w prostym przybliżeniu wielostopniowa rekombinacja może zostać potraktowana jako jednostopniowy proces przy użyciu równania kinetyki pierwszego rzędu. Wtedy intensywność sygnału termoluminescencji można wyrazić wzorem [72]:
ITL(T)= -c dN/dt = (cNk(T))/β, (2.3.1)
gdzie c – współczynnik proporcjonalności,
N – koncentracja spułapkowanych ładunków, β – prędkość wygrzewania próbki,
k(T) – stała szybkości reakcji rekombinacji.
Rekombinacja ładunku jest reakcją transportu elektronu, która może być opisana przez teorię Marcusa (Marcus i Sutin, 1985). Uproszczoną wersję wzoru na stałą szybkości rekombinacji k(T) można zapisać, używając wzoru Eyringa [72]:
k(T)= s exp(-Ea/kBT), (2.3.2)
gdzie: s – tzw. współczynnik przedeksponencjalny s = K kB T/h exp(ΔS/kB),
K – tzw. współczynnik transmisji, równy 1 dla procesów adiabatycznych, o wartości pomiędzy 0 a 1 dla nieadiabatycznych,
ΔEa – energia aktywacji, ΔS – zmiana entropii.
Użycie wzoru (2.3.1) razem z formułą Eyringa (2.3.2) pozwala na otrzymanie w sposób analityczny kształtu krzywej TL (Vass et al., 1981) oraz rozseparowanie widma TL na poszczególne komponenty. Analizując krzywe TL, zarówno analitycznie jak i numerycznie otrzymuje się 3 charakterystyczne parametry widm TL: scałkowaną powierzchnię N0, energię aktywacji Ea, entropię,którą można wyznaczyć z parametru s. [72]
Widmo termoluminescencji
W układach fotosyntetycznych pojawiają się pasma w zakresie od ok -250ºC do ok 160ºC, natomiast same reakcje wsteczne fotosyntetycznego transferu elektronów są związane głównie z pasmami Q, B, C i AG w zakresie od 0ºC do 50ºC. (Tab. 2.1). Na Rys. 2.12 przedstawione są główne pasma fotosyntetycznej termoluminescencji. [73]
Rys. 2.12. Schematyczne przedstawienie pasm A, Q, C, ZV oraz B (B1, B2) w widmie termoluminescencyjnym. Na górnym wykresie widzimy: A (-15 ºC); Q (+5 ºC) i C (+50 ºC); na dolnym wykresie: ZV (-60 ºC), B (B1, B2) (+30 ºC). Spośród tych pików B i Q są najczęściej obserwowane w izolowanych fotosystemach. [73]
W tabeli 2.1. zebrane są informacje dotyczące stanów zaangażowanych w powstanie poszczególnych pasm:
Tab. 2.1. Tabela sporządzona na podstawie [71-73]
Składowe widma TL Zakres TM [°C] Pochodzenie
pasma Komentarz:
Niskotemperaturowe
pasma -250, -220, -200 związane z magazynowaniem energii wukładach barwników PSII i PSI Z ~ -160 Chl+Chl
-ZV -80 do -30 P680+QA
-A ~ -15 S3QA- Uszkodzenie kompleksu OEC, próbka wzbudzona 2 błyskami
AT ~ -10 do -20 TyrZ+QA- Uszkodzenie kompleksu OEC
(Tyr Z jest funkcjonalnym donorem elektronu do CR PSII), obserwowana w płukanym w buforze Tris cząstkach
PSII (Tris wymywa funkcjonalne klastry manganowe z PSII)
Q ~ 2 do 10 S2QA- Uszkodzenie akceptora QB lub inhibicja przez herbicydy (np. DCMU) – zablokowanie przepływu elektronu pomiędzy QA i QB
B1 ~ 20 do 30 S3QB- Lumen pH < 7 B2 ~ 28 do 32 S2QB- Lumen pH < 7 B 30 do 38 S2/3QB Lumen pH > 7
C ~ 50 TyrD+QA- Zwiększana przez DCMU lub uszkodzenie (TyrD nie jest funkcjonalnym donorem elektronów), Pasmo C nie jest związane z łańcuchem fotosyntetycznego transportu
elektronów.
AG 45 S2/S3QB W nieuszkodzonych chloroplastach lub komórkach, opóźniona luminescencja, indukowana światłem czerwonym Wysokotemperaturowe
pasma HTL1 ~ 50 do 70 Aldehydy + H2O Występują w próbkach zawierającychwodę, najprawdopodobniej pochodzą od oksydacyjnej chemiluminescencji białek otaczających barwniki. Wysokotemperaturowe
pasma HTL1
~ 120 do 140 Peroksydacja lipidów Występują dla suchych próbek
Pasma B obserwowane są w materiale fotosyntetycznym zawierającym PSII po zastosowaniu 1, 2 lub więcej błysków. Wszystkie wymienione w powyższej tabeli pasma pokazują różnorodność stabilnych stanów, w układach fotosyntetycznych. W najniższych temperaturach są to różnice energetyczne obserwowane w układach antenowych. W bardzo wysokich temperaturach pojawiają się maksima TL związane z peroksydacją głównie lipidów. W przypadku naszych badań aktywności i stabilności strony akceptorowej i donorowej najbardziej interesujące są pasma w zakresie 0 – 50ºC, związane z rekombinacją ujemnego ładunku zakumulowanego na pierwotnych i wtórnych akceptorach elektronów QA i QB i dodatniego ładunku zakumulowanego na kompleksie manganowym.
W zależności od liczby wysycających błysków światła można ustabilizować ilość dodatnich ładunków zakumulowanych na OEC (tzw. stany Si, patrz Rozdz. 1.2.1). Stosując odpowiednią sekwencję błysków można wprowadzić układ w ściśle określone stany i badać rekombinację wybranych par ładunków w danych warunkach. Zmiany różnych potencjałów pomiędzy utlenionymi a zredukowanymi chinonami wynoszą ok. 50-70 mV, co obserwowane jest jako różnica temperatur pików 25 – 30ºC zgodnie z wcześniej przedstawionym modelem
Randalla-Wilkinsa. Trzeba również zwrócić uwagę na fakt, iż ze względu na charakter powstawania widma (procesy rekombinacji) badane mogą być tylko pary donor-akceptor. Stąd charakteryzowanie zmian dla poszczególnego donora lub akceptora może być osiągnięte tylko poprzez porównanie dwóch pasm, mających odpowiednio wspólny akceptor lub donor. [71-73]
Zastosowania pomiarów termoluminescencji fotosyntetycznej
Ponieważ fotosystem typu II jest wrażliwym na różne czynniki środowiskowe elementem aparatu fotosyntetycznego, termoluminescencja stanowi narzędzie do badania mechanizmów uszkodzeń powodowanych przez czynniki zewnętrzne, takie jak: zmiana temperatury, oświetlenia (natężenia światła i jego spektrum) oraz działanie ciężkich jonów, takich jak: Cu2+, Co2+, Ni2+, Zn2+. TL używana jest również jako nieinwazyjna metoda służąca do wykrywania zmian genetycznych w roślinach, może pomagać w identyfikowaniu miejsc na które działają herbicydy i inne chaotropowe związki. [71, 73]