Index of /rozprawy2/10998

Pełen tekst

(1)Wydział Fizyki i Informatyki Stosowanej. Praca doktorska. Iwona Habina. Badania organizacji i aktywności izolowanych błon fotosyntetycznych modyfikowanych nanocząstkami tlenków tytanu i wielościennymi nanorurkami węglowymi Promotor: prof. dr hab. Květoslava Burda. Kraków, 2015.

(2) Oświadczenie autora rozprawy: Oświadczam, świadomy(-a) odpowiedzialności karnej za poświadczenie nieprawdy, że niniejszą pracę doktorską wykonałem(-am) osobiście i samodzielnie i że nie korzystałem(am) ze źródeł innych niż wymienione w pracy. data, podpis autora. Oświadczenie promotora rozprawy: Niniejsza rozprawa jest gotowa do oceny przez recenzentów. data, podpis promotora rozprawy. Niniejsza rozprawa doktorska została wykonana w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki POKL.04.01.01-00-434/08-02 współfinansowanego ze środków Unii Europejskiej..

(3) Praca realizowana była na Wydziale Fizyki i Informatyki Stosowanej AGH. Badania dynamicznego rozpraszania światła oraz potencjału zeta wykonano w Instytucie Katalizy i Fizykochemii Powierzchni PAN w Krakowie. Wielościenne nanorurki węglowe były funkcjonalizowane przez grupę badawczą dr L. Stobińskiego w Instytucie Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk w Warszawie i udostępnione do badań. Nanocząstki TiO2 o strukturze anatazu z domieszką brukitu oraz nanocząstki TiO 2 domieszkowane żelazem udostępnił do naszych badań dr M. Gotić z Instytutu Ruđera Boškovicia w Zagrzebiu. Podłoża napylone złotem w Zespole Nanostruktur Powierzchniowych wykorzystano dzięki uprzejmości prof. dr hab. J. Koreckiego z Katedry Fizyki Ciała Stałego AGH..

(4)

(5) Pragnę złożyć serdeczne podziękowania dla: Pani Prof. dr hab. Květoslavy Burdy za opiekę naukową, przekazanie wiedzy, poświęcony czas, cenne uwagi i wskazówki, cierpliwość i życzliwość oraz przyjazną atmosferę pracy. Dla dr. Leszka Stobińskiego z Instytutu Chemii Fizycznej PAN w Warszawie za udostępnienie próbek funkcjonalizowanych wielościennych nanorurek węglowych do badań Dla dr. Marijana Goticia z Instytutu Ruđera Boškovicia w Zagrzebiu za udostępnienie próbek nanocząstek tlenków tytanu do badań. Dla prof. dr. hab. Józefa Koreckiego z Katedry Fizyki Ciała Stałego AGH za udostępnienie podłoży napylonych zlotem do badań. Dr inż Agnieszki Jamrozik i mgr inż Dominiki Augustyńskiej za wspaniałą atmosferę podczas całych studiów doktoranckich, za wskazówki i pomoc w czasie gdy stawiałam pierwsze kroki w pomiarach metodą mikroskopii sił atomowych. Dr Aleksandry Orzechowskiej i dr Renaty Szymańskiej za życzliwą atmosferę w trakcie pracy cenne wskazówki oraz izolację błon BBY PSII, które zostały wykorzystane w badaniach w niniejszej pracy. Dr Magdaleny Kaczmarskiej za życzliwość, cenne wskazówki i pomoc na początku pracy laboratoryjnej. Pozostałych członków Zespołu Biofizyki i Bioenergetyki, t. j. dr Joanny Fiedor, dr. Michała Sarny i dr Agnieszki Hałas za pomoc i przyjazną atmosferę podczas wspólnych spotkań i prac. Dla mgr Karoliny Podgórnej i mgr Marty Szczęch z Instytutu Katalizy i Fizykochemii Powierzchni PAN w Krakowie za życzliwą pomoc w przeprowadzeniu badań metodą DLS i w pomiarach potencjału zeta.. Pragnę także gorąco podziękować: Moim wspaniałym Rodzicom za wsparcie i wszelką pomoc, zwłaszcza wtedy, gdy rozpoczynałam studiowanie fizyki. Mojemu Bratu za wsparcie i motywację. Przyjaciołom za życzliwość, dzielenie radosnych chwil i inspirację. W szczególności dziękuję Iwonce Sputowskiej i Ojcu Stanisławowi Wysockiemu. Marysi Kuboń i panu Piotrowi Bolechale za trzymanie kciuków. Leszkowi Hajdudze za wsparcie, cierpliwość, motywację i wszelką pomoc..

(6)

(7) Spis treści. Spis użytych w tekście skrótów................................................................................................9 Cel pracy..................................................................................................................................11 1.Wprowadzenie......................................................................................................................13 1.1.Błony biologiczne ..........................................................................................................13 1.2.Błony fotosyntetyczne....................................................................................................16 1.3.Układy fotosyntetyczne typu II......................................................................................19 1.3.1.1.Fotosystem typu II (PSII) w fotosyntezie tlenowej........................................21 1.3.1.2.Przestrzenna organizacja fotosystemów typu II kompleksów antenowych w błonach........................................................................................................................24 1.4.Nanocząstki tlenku tytanu..............................................................................................27 1.4.1.Własności fizykochemiczne TiO2...........................................................................27 1.4.2.Wpływ domieszkowania jonami żelaza na strukturę i własności fizykochemiczne nanocząstek TiO2.............................................................................................................30 1.4.3.Oddziaływanie nanocząstek TiO2 na organizmy roślinne......................................31 1.5.Nanorurki węglowe........................................................................................................34 1.5.1.Własności fizykochemiczne nanorurek węglowych...............................................34 1.5.2.Funkcjonalizowanie nanorurek węglowych...........................................................36 1.5.3.Oddziaływanie nanorurek węglowych na organizmy roślinne...............................40 2.Metody badawcze.................................................................................................................43 2.1.Mikroskopia sił atomowych...........................................................................................43 2.2.Metody spektrofotometryczne........................................................................................53 2.3.Termoluminescencja......................................................................................................61 2.4.Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) i potencjał zeta..............................................68 3.Materiał badawczy i przebieg pomiarów...........................................................................79 3.1.Przygotowanie modelowych błon biologicznych ..........................................................79 3.2.Naturalne błony roślinne, wzbogacone w fotosystem typu II .......................................79 3.3.Nanocząstki tlenku tytanu wykorzystane w badaniach .................................................80 3.4.Nanorurki węglowe........................................................................................................81 3.5.Protokoły pomiarowe.....................................................................................................82.

(8) 4.Wyniki ..................................................................................................................................91 4.1.Wpływ procedury przygotowania sztucznych błon biologicznych na ich organizację przestrzenną..........................................................................................................................91 4.2.Oddziaływania nanocząstek TiO2 z izolowanymi błonami fotosyntetycznymi.............97 4.2.1.Badania przestrzennej organizacji układów BBY PSII+TiO2 ...............................97 4.2.2.Wpływ nanocząstek TiO2 na efekt Kautsky'ego ..................................................112 4.2.3.Wpływ nanocząstek TiO2 na transfer energii w obrębie BBY PSII.....................128 4.2.4.Wpływ nanocząstek TiO2 na widmo termoluminescencyjne...............................155 4.2.5.Wpływ nanocząstek TiO2 na rozmiar i potencjał zeta cząstek w układach hybrydowych BBY PSII + TiO2....................................................................................168 4.3.Oddziaływania wielościennych nanorurek węglowych z izolowanymi błonami fotosyntetycznymi..............................................................................................................175 4.3.1.Badania przestrzennego rozkładu układów BBY PSII + MWCNT.....................175 4.3.2.Wpływ wielościennych nanorurek węglowych na efekt Kautsky'ego.................181 5.Podsumowanie....................................................................................................................187 6.Wnioski...............................................................................................................................199 Bibliografia............................................................................................................................203.

(9) Spis użytych w tekście skrótów NADPH –dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (zredukowana forma);. AFM (Atomic Force Microscopy) –mikroskopia sił atomowych; AH – stała Hamakera; ATP – adenozynotrifosforan; BChl – bakteriochlorofil; Chl – chlorofil; CR – centrum reakcji; cyt - cytochrom CM AFM (Contact Mode AFM) – tryb kontaktowy w mikroskopii AFM; CVD (Chemical Vapour Deposition) – chemiczne osadzanie z fazy gazowej; DF (delayed fluorescence)- opóźniona fluorescencja; DLS (Dynamic Light Scattering) – dynamiczne rozpraszanie światła; EDL ( electric double layer) – podwójna warstwa elektryczna;. NC mode (non-contact mode) – tryb bezkontaktowy w mikroskopii AFM; OEC (Oxygen Evolving Complex) – kompleks wydzielania tlenu; P690 – centrum reakcji PSII; P700 – centrum reakcji PSI; PC – plastocyjanina ; PCS (Photon Correlation Spectrosopy) – spektroskopia korelacji fotonów; PdI – polidyspersyjność; Pheo – feofityna; PQ – plastochinon; PSI – fotosystem typu I; PSII – fotosystem typu II; RH – promień hydrodynamiczny; QA – pierwotny chinonowy akceptor EFM (electrostatic force microscopy) elektronu; – miksoskopia sił elektrostatycznych; QB – wtórny chinonowy akceptor elektronu; Fd – ferrodoksyna; SWCNTs (Single Walled Carbon Nanotubes) FL – fluorescencja; -jednościenne nanorurki węglowe; FNR - reduktazę ferrodoksyna-NADP+ ; SOD - dysmutaza ponadtlenkowa; HEPES (ang.4-(2-hydroxyethyl)-1PF (prompt fluorescence) – piperazineethanesulfonic acid) szybka fluorescencja; – kwas piperazynoetanosulfonowy; SPM (Scanning Probe Microscopy) – IC mode (Intermittent Contact mode) – tryb mikroskopia ze skanującą sondą; przerywanego kontaktu w mikroskopii AFM; STM (Scanning Tunneling Microscopy) – LHC (Light Harvesting Complex) skaningowa mikroskopia tunelowa; – kompleks antenowy; TiO2 – tlenek tytanu; MFM (magnetic force microscopy) TL – termoluminescencja; – mikroskopia sił magnetycznych; TM (tapping mode) –tryb przerywanego MWCNTs (Multiwalled Carbon Nanotubes) kontaktu w mikroskopii sił atomowych; – wielościenne nanorurki węglowe; TyrZ lub YZ – reszta aktywnej tyrozyny Z; MGDG UV – ultrafiolet; – monogalaktozylodiacyloglicerol; vdW – van der Waals (oddziaływanie van der Waalsa); NADP+ –dinukleotyd nikotynamidoadeninowy VIS – światło widzialne; (utleniona forma);. 9.

(10) 10.

(11) Cel pracy Wraz z rozwojem nanotechnologii w różnych dziedzinach życia rośnie zagrożenie akumulacji nanocząstek w organizmach żywych zarówno w wyniku ich celowego stosowania jak i niekontrolowanego uwalniania się do środowiska naturalnego. Nanocząstki wykorzystywane są m. in. w: nano-medycynie zarówno w terapii, jak i diagnostyce (np. leki celowane, środki kontrastowe, materiały opatrunkowe), rolnictwie (jako dodatki do nawozów lub środki ochronne), w elektronice, czy też w przemyśle kosmetycznym, tekstylnym, chemicznym. Stanowią produkt uboczny m.in. w procesie spalania, spawania, obróbki mechanicznej twardych materiałów. Niniejsza praca dotyczy badań wpływu nanocząstek tlenków tytanu i nanorurek węglowych na aktywność fotosyntetyczną izolowanych błon tylakoidów wzbogaconych w fotosystem II (BBY PSII). Dotąd, głównie zajmowano się podobnymi badaniami na całych roślinach, uzyskując często sprzeczne rezultaty, co wynikało z różnorodności gatunków traktowanych w odmienny sposób nanocząstkami o różnym pochodzeniu i stężeniu. Prowadzone badania były zazwyczaj zorientowane na sprawdzenie stymulującego bądź hamującego działania nanocząstek na wzrost roślin wyższych odnosząc się do aktywności aparatu fotosyntetycznego. W tego typu eksperymentach nie ma jednak możliwości kontrolowania ilościowego stosunku nanocząstek do badanego materiału, a tym bardziej znalezienia relacji stosowanych stężeń względem układów fotosyntetycznych. Celem pracy było badanie in vitro bezpośredniego wpływu wybranych nanocząstek tlenków tytanu i nanorurek węglowych na aktywność fotosystemu II (PSII), organizacji utworzonych układów hybrydowych oraz znalezienie korelacji między wydajnością liniowego transferu elektronów i przekazem energii a wielkością formowanych struktur. Istotnym aspektem prowadzonych prac było sprawdzenie, jak powyższe efekty zależą od typu tlenku tytanu (anataz, rutyl, anataz z domieszką brukitu), ich wielkości (porównanie anatazu A11 i A11-S) i domieszkowania jonami żelaza (TiO2 zawierające 1 %, 5% i 15% Fe) oraz ładunku grup funkcyjnych wielościennych nanorurek węglowych (posiadających dodatnio naładowane grupy aminowe albo ujemnie naładowane grupy karboksylowe). W badaniach wykorzystano komplementarne metody fizyko-chemiczne, takie jak: mikroskopię sił atomowych (AFM), dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) i pomiar potencjału zeta, spektroskopię fluorescencyjną „steady-state” i szybką Kautsky'ego) oraz termoluminescencję. 11. fluorescencję modulowaną (efekt.

(12) 12.

(13) 1. Wprowadzenie 1.1. Błony biologiczne Błony biologiczne to struktury wspólne dla wszystkich żywych organizmów, stanowiące granicę pomiędzy zawartością komórek a środowiskiem zewnętrznym oraz oddzielające poszczególne kompartmenty wewnątrz komórek. Błony biologiczne formowane są głównie przez lipidy i białka. Większość budujących błony lipidów to fosfolipidy. Ich cząsteczki utworzone są z hydrofilowego ugrupowania zawierającego glicerol z grupami fosforanowymi oraz 2 hydrofobowe łańcuchy stanowiące reszty kwasów tłuszczowych o długości 12 – 14 atomów węgla. W środowisku wodnym tworzą one spontanicznie dwuwarstwę lipidową, której struktura jest identyczna we wszystkich żywych organizmach a grubość wynosi ok. 4 – 5 nm [1-2]. Rodzaj lipidów budujących błonę wpływa na formowanie się dwuwarstwy lub tworzenie się krzywizn w jej obrębie, co schematycznie pokazane zostało w poniższej tabeli. Tab. 1.1. Struktury formowane przez różne rodzaje lipidów. Tabela na podstawie [3].. 13.

(14) Przykładem. lipidu,. który. wpływa. na. przestrzenną. organizację. błon. jest. monogalaktozylodiacyloglicerol (MGDG) występujący w błonach tylakoidów. Obecność tej molekuły w błonie może wpływać na organizację gran (patrz Rys. 1.4.) [4-5]. Białka membranowe Białka występujące w błonach biologicznych możemy podzielić na. białka integralne –. zanurzone w błonie oraz białka peryferyjne, dołączone do niej przez oddziaływania elektrostatyczne lub hydrofobowe. Skład białkowy błon biologicznych jest bardzo zróżnicowany w zależności od pełnionej przez nie funkcji. Zawartość białek w błonach jest różna: od 18% w komórkach mielinowych do 76% w wewnętrznych błonach mitochondrium. Warto dodać, że 25-30% wszystkich białek stanowią właśnie białka membranowe. Własności błon biologicznych Ważną cechą błon biologicznych jest ich asymetria. Zarówno skład lipidowy błony od strony zewnętrznej i wewnętrznej komórki różni się, jak i orientacja białek membranowych jest ściśle określona. Ponadto istnieją różnice pomiędzy błonami zwierzęcymi a roślinnymi. Te. pierwsze. w. głównej. mierze. zbudowane. są. z. fosfatydylocholiny. (PC). i. fosfatydyloetanolaminy (PE). Zawierają również fosfatydyloinozytol (PI), fosfatydyloserynę (PS), sfingomielinę (SM), kwas fosfatydowy. i. kardiolipinę (CL). Błony tych samych. organelli w komórkach roślin różnią się składem procentowym. Przykładowo błony mitochondriów zwierzęcych, zbudowane są z PC (ok. 44%), PE (ok. 34%), PI (ok. 5%), CL (ok. 14 ), PA ( <1%) i SM (ok, 1%) [4][7-8]. Błony chloroplastów są typowymi błonami roślinnymi, których skład lipidowy istotnie różni się od składu błon zwierzęcych. Oprócz fosfolipidów występują tu również galaktolipidy (MGDG i DGDG (digalaktozylodiacyloglicerol). i sulfolipidy (SQDG:. diacyloglicerol sulfochinowozylu). W samych chloroplastach istnieją istotne różnice w składzie lipidowym pomiędzy błoną zewnętrzną a wewnętrzną otoczki chloroplastu oraz tylakoidami. Dodatkowo błona zewnętrzna i wewnętrzna tylakoidów ma zróżnicowany skład. Dla przykładu błona tylakoidów szpinaku średnio zawiera 57 % MGDG, 27 % DGDG, 7 % SQDG, 7 % PG i 1 %PI.[b11] Z tego 95% SQDG znajduje się w wewnętrznej błonie tylakoidów , podczas gdy MGDG, DGDG i PG głównie w zewnętrznej błonie [4-7]. Skład błon determinuje ich własności fizyczne, wśród których wyróżnić możemy płynność 14.

(15) błon. Lipidy w błonach poruszają się: są to ruchy rotacyjne wokół osi długiej molekuł lub dyfuzja w kierunku lateralnym błony. Poza tym możliwe są przeskoki lipidów, tzw. flip-flop z jednej warstwy do drugiej. Płynność błon zależy od długości i nasycenia węglowodorowych łańcuchów lipidów. Warto zauważyć że w błonach biologicznych występują tylko nienasycone wiązania typu „cis”, gdyż jedynie one wprowadzają zmianę właściwości błony. Dłuższe. łańcuchy. skutkują. silniejszymi. oddziaływaniami. pomiędzy. sąsiadującymi. molekułami lipidów, co wpływa na usztywnienie błony. Białka membranowe również ulegają dyfuzji w obrębie błony. Nie zaobserwowano natomiast zmian ich orientacji w błonach.[11] Modele błon biologicznych Koncepcja, zgodnie z którą błony to 2-wymiarowe mozaiki lateralnie ruchliwych lipidów i białek znana jest jako model płynnej mozaiki [9].. Rys. 1.1. Modele błony biologicznej: a) Model płynnej mozaiki z zaznaczoną asymetrią błony. Rysunek zaadaptowany z [www.britannica.com].. Dzięki obecności wyspecjalizowanych białek, tzw. flipaz błony biologiczne są asymetryczne. Ponadto charakteryzują je również niejednorodności w kierunku lateralnym, które nazwano mikrodomenami lub „tratwami lipidowymi” (lipid rafts), w obrębie których białka i lipidy zorganizowane są w funkcjonalne kompleksy, które cechują się wysoką dynamiką (czas życia domen jest dłuższy niż czas reakcji) [10]. Tratwy lipidowe charakteryzują się zwiększoną zawartością sfingolipidów i steroli, które tworzą uporządkowaną fazę (Rys. 1.2.a). Otaczają je 15.

(16) lipidy tworzące nieuporządkowaną fazę (Rys. 1.2.b). Typowe rozmiary mikrodomen to 10 – 200 nm [10, 24].. Rys. 1.2. a) Uporządkowana faza lipidów w „tratwie lipidowej, b) nieuporządkowana faza lipidów.. Funkcje błon biologicznych Błony biologiczne spełniają wiele ważnych funkcji. Są to m.in.: (i) transport jonów, wody, dużych molekuł (np. białka) poprzez błonę, (ii) utrzymanie bariery pomiędzy wnętrzem komórki a środowiskiem zewnątrzkomórkowym oraz wydzielenie organelli wewnątrz komórki, (iii). utrzymanie odpowiedniego składu jonowego oraz ciśnienia. osmotycznego wnętrza komórki. Zachodzące dzięki błonie biologicznej procesy transportu pozwalają m.in. na komunikację z sąsiednimi komórkami i odbieranie bodźców. [11]. 1.2. Błony fotosyntetyczne Fotosynteza jest fizykochemicznym procesem przemiany energii świetlnej w energię chemiczną, która wykorzystywana jest przez autotrofy do tworzenia swojej biomasy po uprzednim zasymilowaniu dwutlenku węgla. Jest to proces, który zapoczątkował rozwój życia na Ziemi ok. 3.8 miliarda lat temu. Fotosynteza jest bezpośrednio bądź pośrednio odpowiedzialna za całą biomasę na naszej planecie. Proces ten zachodzi w wysoko wyspecjalizowanych strukturach. W przypadku bakterii są to chromatofory, natomiast u roślin – chloroplasty. Pojawienie się fotosyntezy tlenowej, której produktem ubocznym jest tlen cząsteczkowy, skutkuje utrzymywaniem odpowiedniego dla życia na Ziemi składu atmosfery. Proces fotosyntezy można podzielić na 2 etapy: fazę jasną oraz fazę ciemną. Wysokoenergetyczne związki. (ATP - adenozynotrifosforan i NADPH – dinukleotyd 16.

(17) nikotynamidoadeninowy) wytworzone w fazie jasnej uwalniane są do stromy i wykorzystywane w fazie ciemnej (cykl Calvina-Bensona). W fazie jasnej uczestniczą wysoce wyspecjalizowane białkowo-lipidowo-barwnikowe kompleksy, które dzieli się na typ I i typ II ze względu na rodzaj akceptora elektronów. W fotosystemach typu I białka żelazowosiarkowe pełnią rolę akceptorów. Takie fotosystemy posiadają m.in. zielone bakterie siarkowe i heliobakterie. Fotosystemy typu II wykorzystują chinony jako akceptory elektronów i zaliczamy do nich m. in. bakterie purpurowe i zielone. W cyjanobakteriach, glonach i roślinach wyższych, gdzie zapotrzebowanie na energię jest większe, oba fotosystemy współdziałają w liniowym transferze elektronów. W zależności od typu donora elektronów fotosyntezę dzieli się na tlenową (donorem elektronów jest woda) lub beztlenową (donorem elektronów może być wodór, siarkowodór, jony metali lub związki organiczne). Na uwagę zasługuje fakt, że tylko w tych fotosystemach typu II, w których pojawia się kompleks manganowy (patrz. Rys. 1.5) możliwe staje się pobieranie elektronów z wody, gdyż tylko one posiadają odpowiednio. duży potencjał redoks (~ 1.2 V). Rys. 1.3 i 1.5. Wyłącznie. cyjanobakterie, glony i rośliny wyższe posiadają takie fotosystemy II (PSII). [12-14].. Rys. 1.3. Schematyczne przedstawienie porównania potencjałów redoks centrów reakcji fotosystemów typu II i I aktywowanych światłem oraz kofaktorów uczestniczących w transporcie elektronów. Na rysunku przedstawiono kolejno od lewej centra reakcji występujące u: a) bakterii purpurowych i zielonych, b) roślin wyższych i cyjanobakterii (współdziałające fotosystemy PSII i PSI), c) u zielonych bakterii siarkowych i heliobakterii. Linie kropkowane obrazują zmianę potencjałów redoks w wyniku absorpcji światła przez pierwotne donory elektronów – dimery bakteriochlorofili (BChl 2) lub tetrametry chlorofili Chl 4); linie ciągłe – liniowy transfer energii w obrębie poszczególnych fotosystemów; linie przerywane - transfer. 17.

(18) elektronów, w którym uczestniczą przenośniki elektronów niezwiązane z samymi centrami reakcji. Pozostałe skróty użyte na schemacie: Y Z - reszta tyrozyny związanej na białku rdzeniowym D1 fotosystemu II, BChl – bakteriochlorofil, BPheo – bakteriofeofityna, Chl – chlorofil, Pheo - feofityna, QA i QB -chinony związane w miejscu QA i QB, Q – chinon, Fx, FA, FB białka żelazowo-siarkowe. Rysunek zaadaptowany z [14].. W dalszym opisie szczególną uwagę zwrócimy na fazę świetlną fotosyntezy w roślinach wyższych, ponieważ w pracy badane są fragmenty błon tylakoidów pochodzących z tytoniu. Przestrzenna organizacja błony tylakoidów W roślinach i glonach fotosynteza zachodzi w wewnętrznych błonach chloroplastów, tzw. tylakoidach, tworzących ciągłą 3-wymiarową sieć zorganizowaną przestrzennie w charakterystyczny sposób. W konsekwencji tylakoidy roślin wyższych i niektórych glonów są strukturalnie niejednorodne. Składają się z dwóch głównych struktur (Rys. 1.4.a): . gran, czyli tylakoidów zorganizowanych w stosy dysków o średnicy 300-600 nm;. . lamelli stromy - nieupakowanych tylakoidów, łączących poszczególne grana.. Rys.1.4. a) Chloroplast wraz z zaznaczonymi wewnątrz tylakoidami, b) schemat przedstawiający przestrzenną organizację błon tylakoidów oraz rozmieszczenie kompleksów białkowych w błonach. Kolory oznaczają odpowiednio: jasnozielony – kompleksy antenowe LHCII, ciemnozielony – kompleks PSII-LHCII, pomarańczowy – cytochrom b 6f, niebieski – fotosystem PSI, czerwony – syntazę ATP. Rysunki zostały zaadaptowane z[www.biologydiscusion.com/chloroplasts] i [15].. 18.

(19) Upakowanie błon tylakoidów w grana pozwala najprawdopodobniej na przekazywanie energii ekscytacji nie tylko lateralnie w obrębie błony, ale także w kierunku wertykalnym. Przyspiesza to dostarczenie energii do 'otwartych' CR, czyli zdolnych do przyjęcia energii, oraz pozwala na wstępną adaptację układu do warunków oświetlenia (oczywiście istnieje wiele mechanizmów regulujących wydajność wzbudzeń fotosystemów).[16]. 1.3. Układy fotosyntetyczne typu II W fazie jasnej fotosyntezy u roślin wyższych pośredniczą 4 duże białkowe kompleksy, zanurzone w błonie tylakoidów znajdujących się w chloroplastach. Są to fotosystem typu I, fotosystem typu II, cytochrom b 6/f i syntaza ATP. PSII głównie znajdują się w granach, podczas gdy PSI i syntaza ATP – w przeważającej mierze w lamellach stromy, kompleks cytochromu b6/f rozłożony jest równomiernie w obydwu typach błon (patrz Rys. 1.4.b) [16]. Współdziałanie w/w kompleksów w obrębie błony tylakoidów zostało schematycznie przedstawione na Rys.1.5.. Rys. 1.5. Schemat błony tylakoidów z kompleksami biorącymi udział w fotosyntezie: od lewej: 1) PSII, 2) Cytochrom b6/f, 3) PSI, 4) Syntaza ATP. Oznaczenia na rysunku: P680 – centrum reakcji PSII D1, D2 – podjednostki białkowe, Q A i QB – chinony związane w miejscu Q A i QB, Pheo – feofityna, Mn4OxCa – kompleks manganowy, CP43 i CP47 – wewnętrzne kompleksy antenowe PSII, LHC-II, peryferyjne kompleksy antenowe PSII, PQ -plastochinon, cyt b6 i cyt b7 – podjednostki cyt b6/f, PC – plastocyjanina, LHCI – kompleksy antenowe PSI, P700 – centrum reakcji PSI, A0 – chlorofil a, A1 -filochinon, FeS – klaster żelazowo-siarkowy, Fd – ferredoksyna,. FNR. –. reduktaza. ferrodoksyna-NADP +,. NADP+. -. dinukleotyd. nikotynamidoadeninowy, CF0 i CF1 – podjednostki syntazy ATP, ATP- adenozynotrifosforan, ADP -adenozynodifosforan. Rysunek pochodzi z [17].. 19.

(20) Fotosystem II jest kompleksem złożonym z ponad 20 podjednostek białkowych. Rdzeń PSII stanowią 2 podjednostki białkowe D1 (PsbA) i D2 (PsbD), które wiążą 6 Chl a i 2 Pheo a. Cztery Chl a stanowią fotoaktywne centrum, które pułapkuje energię przekazywaną z kompleksów antenowych (LHC – Light Harvesting Complexes). Maksimum absorpcji przypada na 680 nm i stąd jego oznaczenie zwyczajowe jako P680. Aktywacja światłem PSII powoduje przekaz elektronów poprzez ruchomy, wewnątrzbłonowy nośnik elektronów, plastochinon (PQ), na kompleks cytochromu b6/f oraz pobranie elektronów z wody. Cytochrom b6/f to dimeryczny kompleks białkowy o wielkości ok. 220 kDa, złożony z ok. 8 – 9 białkowych podjednostek. Przekazuje on dalej elektrony na plastocyjaninę (PC – ruchomy nośnik białkowy na zewnątrz błony po stronie lumen), która oddaje je na PSI, który wcześniej musi ulec aktywacji światłem (maksimum absorpcji 700 nm). PSI jest również złożonym kompleksem białkowo-lipidowo- barwnikowym jak PSII, a jego rdzeń stanowią dwa białka: PsaA i PsaB. Elektron z PSI przenoszony jest przez ferredoksynę (Fd) na reduktazę ferrodoksyna-NADP+ (FNR), która katalizuje oddanie 2 elektronów na NADP +. Po przyłączeniu H+ tworzy się NADPH (dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy). Podczas transportu elektronów przez PQ jednoczenie wytwarzany jest gradient protonów H +, który stanowi napęd dla syntazy ATP, odpowiedzialnej za produkcję ATP (adenozynotrifosforanu) z ADP (adenozynodifosforanu) i grup fosforanowych. Syntaza ATP, zwana jest również F1F0-ATP syntazą, gdyż składa się z dwóch jednostek CF0 i CF1, z których pierwsza jest wbudowana z błonę tylakoidów, a druga znajduje się po ich stronie zewnętrznej, w tzw. stromie. [24] We wszystkich organizmach zdolnych do fotosyntezy tlenowej fotosystemy PSII i PSI współdziałają, jak wyżej to opisano, w liniowym transferze elektronów. Obecność dodatkowych kompleksów antenowych (LHC, Light Harvesting Complexes – zawierają dodatkowe barwniki: chlorofile i karotenoidy) zbierających energię świetlną zwiększa efektywność jej wykorzystania przez kompleksy PSII i PSI. Przesyłają one energię w postaci superpozycji spójnych stanów wzbudzonych nazywanych ekscytonami do centrów reakcji PSII i PSI. Na rysunku 1.5. zaznaczono dodatkowe kompleksy zbierające światło LHCII oraz CP43 i CP47 w przypadku PSII i LHCI w przypadku PSI. Wewnętrzne kompleksy antenowe, wspomagane przez peryferyjne kompleksy antenowe, możemy podzielić na 2 typy: trimeryczne CP43 i CP47 oraz monomeryczne kompleksy antenowe Lhcb4 (CP29), Lhcb5 (CP26), Lhcb6 (CP24).[15-16] Wiążą one różne ilości chlorofili, 20.

(21) karotenoidów, luteiny, violaksantyny i neoksantyny, co podsumowano w tabeli 1.2, sporządzonej na podstawie [18-20]. Tab. 1.2. Zawartość molekuł barwników w kompleksach PSII i kompleksach antenowych. (liczba molekuł/mg protein).. D1/D2 CP47 CP43 LHCII CP29 CP26 CP24. Chl a. Chl b. 6 16 13 7 6—9 6—8 3—7. 5 2—3 3—4 2—5. Karoteny 11 0,1—0,15 0,1 – 0,15 0,2 – 0,5. Ksantofile 0,4 1 2,42 – 3,05 2,8 – 4,2 2,2 – 2,9 1,7 – 4,1. Fotosystem typu II (PSII) w fotosyntezie tlenowej. 1.3.1.1.. Fotosystem II zlokalizowany jest głównie w granach tylakoidów, Rys. 1.6. To od jego wzbudzenia rozpoczyna się proces liniowego transferu elektronów w fazie świetlnej fotosyntezy.. Obecnie. najdokładniejsza. znana. struktura. PSII. została. określona. z. rozdzielczością 1.9 Å dla Thermosynchococcus vulcanus dzięki rentgenowskiej krystalografii [19]. Rysunek 1.6 pokazuje schemat PSII wraz z zaznaczonymi komponentami aktywnymi w procesie transportu elektronów w jego obrębie. Strzałki wskazują kierunek transferu elektronów.. 21.

(22) Rys. 1.6. Schemat pokazujący strukturę PSII oraz drogę liniowego transferu elektronów jego obrębie. Separacja ładunku pomiędzy P680+· i Phe-· (krok 1) stabilizowana jest przez sprzężone szybkie procesy transportu elektronów po stronie donorowej i akceptorowej PSII. Na stronie akceptorowej elektron ze zredukowanej feofityny przenoszony jest dalej na pierwotny chinonowy akceptor związany w miejscu Q A (krok 2), a następnie na wtórny chinonowy akceptor związany w miejscu Q B (krok 5). Chinon w miejscu Q A jest trwale związany i może przyjąć 1 elektron, natomiast chinon w miejscu Q B po przyjęciu 2 elektronów jest uwalniany do wnętrza tylakoidów po uprzednim przyłączeniu dwóch protonów, H +. W jego miejsce wchodzi plastochinon utleniony z zewnętrznej puli chinonowej. Na stronie donorowej kation rodnikowy P680·+ jest redukowany przez Tyr-Z, aktywną redoksowo tyrozynę zlokalizowaną na podjednostce D1 (krok 3). Z kolei Tyr-Z ·+ jest redukowana przez elektron pochodzący z kompleksu manganowego, tzw. OEC – Oxygen Evolving Complex (krok 4), gdyż jest on odpowiedzialny za pobieranie elektronów z wody. Strona donorowa działa w 4-cyklu, gdyż kompleks manganowy może oddać do 4 elektronów pod wpływem czterech kwantów światła absorbowanych przez P680. W pełnym cyklu jest zdolny do pobrania czterech elektronów z dwóch cząsteczek wody. Stany utlenienia kompleksu manganowego tworzącego OEC nazywane są Si. ,. gdzie indeks i oznacza zakumulowaną liczbę dodatnich ładunków (i=1,...,4). Tlen. wydzielany jest podczas przejścia S3 → S4 → S0, gdzie S4 jest krótkożyciowym stanem. Strona akceptorowa pracuje w dwucyklu, ponieważ plastochinon w miejscu Q B może przyjąć tylko 2 elektrony[5, 24] Rysunek pochodzi z [21]. 22.

(23) Kierunek liniowego transferu elektronów w procesie tlenowej fotosyntezy ilustruje tzw. schemat Z (Rys. 1.7), na którym zostały zaznaczone zmiany redoksowe PSII i PSI oraz potencjały redoks pozostałych komponent pośredniczących w tym procesie.. Rys. 1.7. Schemat pokazujący transfer elektronu w procesie fotosyntezy tlenowej. Na osi y zaznaczono potencjały redoks dla poszczególnych komponent uczestniczących w liniowym przekazie elektronów (czarne ciągłe strzałki). Jak widać w stanie podstawowym kompleks chlorofili P680 w PSII posiada wysoki potencjał dodatni (~ 1.2 eV). Pod wpływem wzbudzenia P680* staje się silnie elektroujemne i dlatego chętnie oddaje elektron do najbliższego możliwego akceptora o nieco mniej ujemnym potencjale. W PSII jest nim feofityna - Pheo (Rys.1.6). Zredukowana Pheo.- z kolei przekazuje elektron na najbliższy możliwy akceptor o nieco wyższym potencjale, którym jest plastochinon Q A, a ten z kolei przekazuje elektron na plastochinon w miejscu QB, Plastochinon PQB po zaakceptowaniu dwóch ładunków ujemnych przyłącza dwa protony ze stromy (niebieska ciągła strzałka), które uwalnia po stronie lumen (wewnętrznej stronie tylakoidów), podczas przekazu elektronów na kompleks cyt. b 6/f (potencjał tego kompleksu wynosi ok. 0.2-0.3 eV). Plastocjanina PC, poruszająca się w lumen jest nośnikiem elektronów na PSI. Kompleks chlorofili P700 w PSI jest zdolny do zaakceptowania elektronu dopiero po uprzednim wzbudzeniu. Podobnie, jak miało to miejsce w PSII o kierunku przekazu elektronów na kolejne redoksowo aktywne komponenty decyduje ich potencjał i odległość (patrz Rys. 1.6.). Symbole A0, A1, FX, FA/FB i FD oznaczają odpowiednio chlorofil a, filochinon, żelazowo-siarkowy klaster FeSx, żelazowo-siarkowe klastry [Fe4S4] i ferredoksynę.. 23.

(24) Końcowym akceptorem w liniowym transferze elektronów sterowanych światłem jest NADP +, który przy udziale FNR (reduktazy ferrodoksyna-NADP+) jest redukowany do postaci NADPH (dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy). Niebieską linia przerywaną jest zaznaczony jeden z wielu cyklicznych transferów elektronów, który staje się kluczowy, gdy odbiór elektronów z PSI jest ograniczony. Schemat Z pokazuje także dlaczego PSII jest jedynym fotosystemem zdolnym do utleniania wody dzięki obecności kompleksu manganowego, gdyż tylko on posiada odpowiednio wysoki potencjał redoks (potencjał redoksowy wody wynosi ok. 0.8 eV). Rysunek pochodzi z [22].. 1.3.1.2. Przestrzenna organizacja fotosystemów typu II kompleksów. antenowych w błonach Fotosystemy PSII zorganizowane są w duże superkompleksy: dimery a nawet tetramery [15], otoczone są dodatkowo wspomagającymi je w absorbowaniu energii kompleksami antenowymi. Organizacja dimerów PSII została pokazana na Rys. 1.8.. Rys. 1.8. Organizacja fotosystemów PSII w superkompleksy. a) obraz superkompleksu PSII-LHCII: C2S2M2 uzyskany za pomocą techniki single particle electron microscopy. Podjednostki białkowe D1 i D2 tworzące rdzeń PSII oznaczono przez C (obrysowany czerwonym konturem), CP24, CP26, CP29, trimery LHCII, monomery LHCb zostały schematycznie oznaczone po prawej stronie kompleksu, a ich kontury – po lewej; b) schematyczne przedstawienie podjednostek z rys a); c) rysunek, na którym zaznaczone zostały: z lewej - podjednostki zlokalizowane po stronie lumen kompleksu (psbO, psbU, psbV), po prawej – podjednostki zlokalizowane wewnątrz kompleksu (CP47, CP43, D1/D2). Rysunki zaadaptowane z: a) [15]; b) i c) [16].. Przestrzenny rozkład superkompleksów w granach może być różny: od losowej, 24.

(25) nieuporządkowanej. organizacji. po. semikrystaliczne. domeny. tworzące. często. charakterystyczne rzędy. Warunki, w jakich następuje organizacja nie są do końca wyjaśnione. Krystaliczne 2-wymiarowe sieci kompleksów PSII zaobserwowane zostały po raz pierwszy dzięki mikroskopii elektronowej a obecnie mikroskopia sił atomowych pozwala na badanie błon tylakoidów w warunkach zbliżonych do natywnych. [15-16] Na Rys. 1.9 pokazane zostały przykłady zaobserwowanych form megakompleksów tworzonych przez dimery PSII.. Rys. 1.9. Przykłady różnych typów zaobserwowanych w roślinach wyższych i zielonych glonach megakompleksów utworzonych z superkompleksów PSII-LHCII. Dimery PSII (C2) i anteny peryferyjne silnie (S) lub pośrednio (M) związane z PSII mogą tworzyć co najmniej 3 rodzaje superkompleksów: C 2S2, C2S2M i C2S2M2. Na rysunku pokazany jest przykład dla C 2S2M2 (A). Jednym ze sposobów ich organizacji jest tworzenie dimerów superkompleksów. Najczęściej występującym rodzajem jest megakompleks typu I (Rys.1.8.b). Rysunek pochodzi z pracy [16].. Tworzenie się superkompleksów i megakompleksów ma niezwykle istotne znaczenie ze względu na efektywność transferu energii. Transfer energii w obrębie superkompleksów PSII-LHCII W obrębie każdego monomeru PSII istnieją dwie główne drogi transferu energii: z CP47 do CR i z CP43 do CR, zaznaczone na Rys. 1.10. przez żółte strzałki. W obrębie. 25.

(26) superkompleksu dwie główne drogi transferu wiodą z anten peryferyjnych poprzez anteny wewnętrzne do centrum reakcji: . z S-LHCII i/lub CP26 do CP43 i następnie do CR (monomer PSII po lewej stronie Rys. 1.10). . z M-LHCII i CP24 poprzez CP29 do CP47 i następnie do CR (monomer PSII po prawej stronie Rys. 1.10).. Również kompleksy antenowe mogą przesyłać w swoim obrębie oraz pomiędzy sobą wzbudzenia, co zostało zaznaczone niebieskimi strzałkami na Rys. 1.10.. Rys. 1.10. Transfer energii w obrębie superkompleksów PSII-LHCII C 2S2M2. Strzałki jasnozielone pokazują transfery energii z/do zewnętrznych anten, niebieskie strzałki dotyczą przekazu wzbudzeń w obrębie bliższych centrów reakcji kompleksów antenowych lub pomiędzy nimi, a żółte pokazują drogę przekazu energii w/z kierunku centrów reakcji. Rysunek pochodzi z [15].. Po obu stronach dimeru PSII można zauważyć białkowe otoczenie pozbawione pigmentu (na Rys. 1.10. zaznaczone jako szare prostokąty), które zapobiega bezpośredniemu bliskiemu sąsiedztwu dimerów i zmniejsza prawdopodobieństwo przekazu energii pomiędzy nimi. Oznacza to, że transfer energii odbywa się przede wszystkim za pośrednictwem anten peryferyjnych, nie pomiędzy dimerami PSII. [15]. 26.

(27) 1.4. Nanocząstki tlenku tytanu 1.4.1. Własności fizykochemiczne TiO2 Tlenek tytanu należy do grupy tlenków metali przejściowych. W naturze występuje w 4 strukturach: anatazu (tetragonalnej), brukitu (ortorombowej), rutylu (tetragonalnej) i TiO2 (B) (jednoskośnej). Dwie dodatkowe wysokociśnieniowe uzyskano w syntezie z rutylu: TiO 2 (II) o strukturze PbO2 i TiO2 (H) o strukturze holandytu. Różnice w sieci krystalicznej anatazu i rutylu są powodem różnic w ich gęstości i strukturze pasm energetycznych, prowadząc do przerwy 3.20 eV dla anatazu i 3.02 eV dla rutylu (bulk), co odpowiada progom absorpcji odpowiednio: 384 i 410 nm (w przypadku pojedynczych kryształów lub dobrze skrystalizowanych. próbek).. Wyższe. wartości. uzyskuje. się. zwykle. dla. słabo. skrystalizowanych cienkich filmów. Przesunięcie w kierunku krótszych fal obserwowane jest dla struktur o rozmiarach rzędu „nano”. [25]. Rys. 1.11. Rodzaje struktur krystalicznych TiO2 [25] oraz przykładowe zdjęcia [wirtualne Muzeum Uniwersytetu Iluelva]. Od lewej: a) anataz, b) rutyl, c) brukit.. Termodynamiczne obliczenia na bazie pomiarów kalorymetrycznych przewidują, iż rutyl jest najbardziej stabilną fazą we wszystkich temperaturach i ciśnieniach do 60 kbar ( powyżej 60 kbar TiO2 (II) staje się najbardziej preferowaną termodynamicznie fazą). W poniższej tabeli zebrane zostały niektóre własności dla 3 form TiO2: anatazu, rutylu i brukitu (wszystko dla formy bulk): 27.

(28) Tabela 1.3. Własności wybranych form TiO2 [25].. Rutyl. Anataz. Brukit. Struktura krystaliczna. tetragonalna. tetragonalna. romboedryczna. Stałe sieciowe:. A: 0,4584 b: c: 0,2953 c/a: 0,644. a: 0,3733 b: c: 0,937 c/a: 2,51. a: 0,5436 b: 0,9166 c: c/a: 0,944. Gęstość [kg/m3]. 4240. 3830. 4170. Stała dielektryczna. ┴ do osi c: 80 ║ do osi c: 160. Szerokość przerwy energetycznej [eV]:. 3,05. 3,26. Współczynnik załamania:. ng: 2,9467 np: 2,6506. 2,5688 2,6584. 2,809 2,677. TiO2 może zostać przygotowany w formie proszku, kryształów lub cienkich filmów. Zarówno proszki jak i filmy mogą być zbudowane z krystalitów o rozmiarach od kilku nm do kilku µm. Warto zaznaczyć, że cząstki o rozmiarach rzędu nm mają tendencję do tworzenia aglomeratów. Metody wykorzystywane od uzyskiwania cząstek TiO 2 to między innymi metoda strącania, metody sol-gel, metody mikroemulsyjne, metody spalania, synteza elektrochemiczna, chemiczne osadzanie z fazy gazowej (CVD), fizyczne osadzanie z fazy gazowej. Syntezowane nanostruktury TiO2 mogą mieć różne rozmiary i kształty. Zaliczyć do nich możemy więc także nanopręty, nanopłytki, nanodruty, nanościany, nanorurki, nanowstążki, uporządkowane struktury mezoporowate, fraktale. Obecnie roczna produkcja TiO2 przekracza 4.5 miliona ton [26]. Używany jest jako biały pigment farb (51% całkowitej produkcji), tworzyw sztucznych i papieru, co reprezentuje główny sektor zastosowania tego tlenku. Zużycie TiO2 w mniejszych sektorach obejmuje jego wykorzystanie w przemyśle tekstylnym, spożywczym (dopuszczony w Unii Europejskiej do stosowania np. w barwieniu żywności), skórzanym, farmaceutycznym (pokrycie tabletek, składnik past do zębów, kremów z filtrami chroniącymi przed UV). TiO 2 jest tak szeroko stosowany m.in. ze względu na jego chemiczną stabilność, nietoksyczność i niski koszt. Ze względu na wysoki współczynnik odbicia używany jest w antyrefleksyjnych warstwach w krzemowych ogniwach słonecznych i w wielu optycznych urządzeniach opartych na cienkich filmach. Z powodzeniem stosowany jest również jako czujnik gazów dzięki zależności przewodności elektrycznej od składu otaczającego gazu. Ze względu na biokompatybilność używany jest jako biomateriał w protezach kości i elementach wzmacniających kości. Szeroko stosowany jest również w reakcjach katalitycznych jako ich promotor, nośnik metali 28.

(29) i tlenków metali lub jako katalizator. [25] Fotochemiczne i fotofizyczne zastosowania TiO2 Wszystkie fotoindukowane procesy związane są z reakcjami redoks na powierzchni mikro- lub nanocząstek TiO2. Jak dotąd najbardziej aktywnym polem dotyczącym fotokatalizy TiO2 jest fotodegradacja związków organicznych. TiO2 stał się fotokatalizatorem w środowiskowych procesach dekontaminacji (odkażania) dla szerokiej gamy związków organicznych, wirusów, bakterii, grzybów, glonów, komórek nowotworowych, które mogą zostać całkowicie zdegradowane i zmineralizowane do CO2, H2O i nieszkodliwych anionów nieorganicznych. [25] Ważne odkrycia, „kamienie milowe” w rozwoju badań nad fotoaktywowanymi procesami związanymi z TiO2 to np. pierwsze ogniwo fotoelektrochemiczne rozszczepiające wodę [27] czy efektywne ogniwo słoneczne w którym zastosowano nanocząstki TiO2 [28].. Rys. 1.12. Fotoindukowane procesy zachodzące z udziałem TiO2 [25].. Dla zastosowań w ogniwach słonecznych struktura anatazu jest bardziej preferowana niż rutyl ze względu na większą ruchliwość elektronów, niższą stałą dielektryczną i mniejszą gęstość. W przypadku tych zastosowań anataz jest więc szczególnie intensywnie badany. Innym ciekawym fotofizycznym zastosowaniem TiO2 jest indukowana światłem superhydrofilowość. Zarówno anataz jak i rutyl są powszechnie stosowane jako fotokatalizatory; anataz wykazuje przy tym większą aktywność fotokatalityczną dla większości reakcji [25]. Sugeruje się, że jego zwiększona fotoreaktywność spowodowana jest troszkę wyższym poziomem Fermiego, 29.

(30) niższą zdolnością do absorpcji tlenu i wyższym stopniem hydroksylacji. Jednak pisano również o reakcjach, w których obydwie fazy miały taką samą fotoreaktywność, lub rutyl – wyższą. Co więcej istnieją również badania stwierdzające, że mieszanka anatazu (70-75%) i rutylu (30-25%) jest bardziej efektywna niż czysty anataz. Te niezgodności mogą wynikać ze współdziałania innych czynników, takich jak powierzchnia właściwa, rozkład porów, rozmiar kryształów i metoda przygotowania. Podejmowane są badania w kierunku ulepszenia aktywności fotokatalitycznej TiO 2 w dwóch kategoriach: 1) by przesunąć pasmo absorpcji w kierunku czerwieni i tym samym zwiększyć aktywność w widzialnym zakresie widma, 2) by zwiększyć fotoaktywność TiO 2 w bliskim UV i VIS. [25]. 1.4.2. Wpływ domieszkowania jonami żelaza na strukturę i własności fizykochemiczne nanocząstek TiO2. Niska absorpcja w zakresie widzialnym widma słonecznego stanowi główną wadą w praktycznych zastosowaniach czystego TiO2. Domieszkowanie TiO2 kationami metali przejściowych było opisywane jako dobry sposób na zwiększenie jego właściwości fotokatalitycznych i wzmocnienie odpowiedzi w świetle widzialnym [31-33] Nanocząstki TiO2 wzbogacone Fe wykazywały lepszą aktywność fotokatalityczną niż czyste nanocząstki w wielu reakcjach fotochemicznych takich jak fotochemiczna synteza amoniaku z N 2 i wody, redukcja CCl4 i utlenienie CHCl3 oraz degradacja kwasów (dichlorooctowego, mrówkowego, maleinowego) będących modelowymi zanieczyszczeniami [29].. Zwiększenie krawędzi. absorpcji TiO2 z 380 nm do wyższych długości fali w zakresie 400 – 650 nm w porównaniu z czystym TiO2 zostało pokazane m.in. w [32-33]. Wielkość przesunięcia ku czerwieni zależy od ilości i rodzaju implantowanych jonów metali w następującej kolejności: V > Cr > Mn > Fe > Ni [25]. Jednorodność dyspersji Fe w sieci krystalicznej TiO 2 , jak również strukturalne i fotokatalityczne własności domieszkowanego Fe tlenku tytanu zależą silnie od rodzaju prekursora Fe oraz metody przygotowania nanocząstek. Pokazano, ze wzbogacenie Fe zmniejsza stopień krystalizacji prowadząc do powstania mniejszych cząstek oraz zwiększa hydrofilowy charakter katalizatora [29].. Dla przykładu w pracy [31] pokazano, że. nanocząstki TiO2 domieszkowane Fe charakteryzują się znakomitą fotoaktywnością w obecności światła UV, co umożliwiło zniszczenie komórek nowotworowych SCVII. Postawiono tam hipotezę, że wzmocniona fotoaktywność domieszkowanych ultradrobnych. 30.

(31) nanocząstek tlenku tytanu w obecności UV pochodzi od rozpuszczania Fe i stąd generowania rodników hydroksylowych poprzez reakcje Fentona i reakcję katalizowaną przez żelazo: Habera-Weissa. Domieszkowanie przez podstawienie koloidalnego TiO 2 jonami Fe3+ ma kontrowersyjny wpływ na rekombinację ładunków. Jedne badania sugerują, że Fe(III) zachowuje się jak centrum rekombinacji elektronów i dziur, inne wskazują, że domieszkowanie na poziomie 0.5 at% Fe3+ drastycznie przedłuża czas życia ładunków do minut a nawet do godzin (średni czas życia pary elektron-dziura dla TiO 2 wynosi ok 30 ns) [25].. 1.4.3. Oddziaływanie nanocząstek TiO2 na organizmy roślinne Gwałtowny rozwój i szerokie zastosowanie nanotechnologii zwiększyło ilość nanomateriałów uwalnianych nieodwracalnie do ekosystemu. Badania dotyczące wpływu nanomateriałów na rośliny pokazują, że niektóre z nich w małych dawkach są zdolne do aktywowania fizjologicznych procesów, podczas gdy inne mogą wykazywać także toksyczne działanie. Odpowiedź roślin na działanie tlenków metali zależy od rodzaju tlenków a także od gatunku rośliny oraz etapu jej wzrostu. W wielu pracach wskazuje się na stymulujący wpływ nanocząstek tlenku tytanu, dzięki którym zwiększona jest masa roślin, ilość chlorofilu, wyższe są wskaźniki wydajności fotosyntetycznej w porównaniu z próbkami kontrolnymi [Q.Mingfang et al. 2013]. Pokazywany jest również odwrotnie proporcjonalny do wielkości nanocząstek wpływ na tempo kiełkowania nasion np. szpinaku. W pracy [34] autorzy sugerują, że nano-TiO2 może wchodzić do komórek i wiązać się do PSII lub chlorofilu. Część elektronów pochodzących z reakcji oksydoredukcyjnych TiO 2 jest wtedy przekazywana do PSII i następnie na dalsze nośniki elektronów, co zobrazowane zostało na Rys. 1.13.. Rys. 1.13. Nano-TiO2 biorący udział w procesie fiksacji azotu i wydzielania tlenu w tylakoidach szpinaku. Na rysunku widoczny jest fotosystem PSII, cytochrom cytb 6f i plastocyjanina (PC). Ilustracja pochodzi z [34].. 31.

(32) Wiele badań dotyczy wpływu nanocząstek TiO2 na absorpcję i fluorescencję, stopień wydzielania tlenu w chloroplastach izolowanych z roślin traktowanych tlenkami tytanu. W większość tych badań wykorzystano tlenek tytanu o strukturze anatazu. W pracy [35] autorzy stawiają hipotezę, że nano-anataz może przyspieszać przemianę energii świetlnej w energię elektronów i ich transfer w procesie fotosyntezy. Sugerują również, że nano-anataz TiO2 może wiązać się do. PSII i wspomagać funkcjonowanie donorów. elektronów. Wyniki badań pokazały, że waga świeżych i suszonych liści oraz stężenie chlorofilu wzrosło transfer elektronów w obrębie PSII i wydzielanie tlenu zostało przyspieszone po tym, jak próbki potraktowane zostały nano-anatazem TiO 2. Absorpcja w zakresie UV-VIS wzrosła, pik w widmie emisyjnym fluorescencji przesunął się w kierunku dłuższych fal o 2 nm i jego intensywność zmalała. Wyniki pomiarów dichroizmu kołowego wskazały na to, iż drugorzędowa struktura PSII dla próbek traktowanych nano-anatazem nie zmieniła się, a zatem wiązanie TiO2 miało mały efekt na konformację kompleksu PSII izolowanego ze szpinaku. W pracy [36] badano efekt działania nanocząstek TiO2 o strukturze rutylu na reakcje fotochemiczne w chloroplastach szpinaku. Podobnie jak w przypadku anatazu wzrost roślin potraktowanych TiO2 był zwiększony oraz wzrosła ilość syntezowanego chl a i chl b o 44.5 i 27.69% w porównaniu do próbek kontrolnych. Zaobserwowano optymalne stężenie TiO 2, dla którego wzrost masy i ilości chlorofilu był największy co sugeruje że odpowiednio dobrane stężenia TiO2 mogą znacząco wspomagać fotosyntezę. Wskaźnik fotosyntezy (mg CO2 dm-2h1. ) wzrósł 3.13 razy, natomiast dla stężeń większych niż 4% spadał. Wskaźnik wydzielania. tlenu także wzrósł w stosunku do kontroli a największy efekt osiągnięty został dla stężenia 0.25% (1.58 razy). Wyniki. wskazały na optymalną koncentrację TiO 2 która może. przyspieszyć transport elektronów w chloroplastach. Autorzy sugerowali, że nano-TiO 2 może wchodzić do chloroplastów i przyspieszać transfer elektronów i wydzielanie tlenu poprzez fotokatalizowane reakcje oksydoredukcyjne. Pod wpływem światła mają miejsce ciągłe reakcje utleniania i redukcji na powierzchni TiO 2, w tym procesie walencyjność Ti zmienia się ciągle pomiędzy 3+ i 4+. Zwiększone wydzielanie tlenu może być spowodowane wchodzeniem pojawiających się przy zmianie walencyjności elektronów w kompleks OEC. Dzięki temu mogłyby one zmieniać stopień utlenienia Mn. Wyniki badań wpływu TiO2 na stres oksydacyjny spowodowany działaniem promieniowania UV-B przedstawione zostały w [37].. Potraktowanie szpinaku nano-anatazem znacząco. zmniejszyło akumulację rodników O2·-, H2O2 i malonyldialdehydu (MDA), ściśle związanego 32.

(33) z peroksydacją lipidów. Rośliny posiadają aktywny system enzymów chroniących przed działaniem RFT, dzięki którym produkcja i eliminacja RFT pozostaje w równowadze. Możemy tutaj zaliczyć dysmutazę ponadtlenkową (SOD), katalazę CAT, peroksydazy APX i GPX, eliminujące H2O2 i O2·-. Dla próbek potraktowanych nano-anatazem aktywności tych enzymów były wyższe niż w przypadku kontroli czy bulk-TiO 2. Stopień wydzielania tlenu może bezpośrednio wskazywać na wydajność fotosyntetyczną. W badaniach autorów dla próbek oświetlonych UV-B zawsze ulegał on redukcji, jednak próbki traktowane nanoanatazem charakteryzowały się znacząco większym wskaźnikiem niż kontrole. Autorzy stwierdzili, iż wyniki ich badań wskazują na możliwość, iż nano-anataz wzmacnia działanie antyutleniaczy. i. stabilizuje. fotosyntezę. w. chloroplastach. poddanych. działaniu. promieniowania UV-B. W pracy [38] zasugerowano, że zwiększenie wzrostu szpinaku jest związane z wiązaniem azotu dzięki obecności nano-anatazu TiO2. Zarówno świeża, jak i sucha masa oraz całkowita ilość azotu, NH4+, wydzielonego tlenu, chlorofilu i białek w przypadku szpinaku traktowanego TiO2 zwiększyła się w porównaniu z próbką kontrolną. Efekt ten nie był tak znaczący w przypadku 'bulk' TiO2 (tutaj stosowany był rutyl). Również w przypadku roślin hodowanych w środowisku zubożonym o związki azotu zahamowanie wzrostu roślin nie było tak wielkie, gdy potraktowano je TiO2 (zwłaszcza nano-anatazem). Postawiono więc wniosek, iż nano-TiO2 może przyczyniać się do absorpcji azotu, przyspieszania przemiany nieorganicznego azotu (grupy NO3-, NH4+) w organiczny (białka, chlorofil) a co za tym idzie do zwiększania plonów. Oprócz stymulującego wpływu na organizmy roślinne obserwowano również szkodliwe działanie TiO2 . Zaobserwowano m.in. toksyczne działanie na zielone glony Desmodesmus subspicatus [39]. Podsumowując pragnę zauważyć, że szkodliwe działanie TiO 2, związane m.in. z powstawaniem reaktywnych form tlenu uważane jest zwykle za niskie a większość publikowanych prac dotyczy stymulującego działania TiO 2 na całe rośliny lub izolowany materiał fotosyntetyczny.. 33.

(34) 1.5. Nanorurki węglowe 1.5.1. Własności fizykochemiczne nanorurek węglowych. Odkrycie nanorurek węglowych na elektrodach używanych do przygotowywania fullerenów przez S. Iijimę miało miejsce w 1991 r. Wielościenne nanorurki węglowe, złożone z cylindrów o powierzchniach wysoce zorganizowanych (atomy węgla w strukturach 'plastra miodu' sp2) były pierwszymi, jakie zaobserwował. Nanorurki węglowe, razem z fullerenami reprezentują trzecią alotropową krystaliczną odmianę węgla. W zasadzie są one zwiniętymi cylindrycznie płatami grafitu, zakończonymi strukturami podobnymi do połowy fullerenu C60. Dwa główne typy to jednościenne nanorurki węglowe (Single Walled Carbon Nanotubes, SWCNTs), zwinięte w cylinder z pojedynczej warstwy grafenu i wielościenne nanorurki węglowe (Multiwalled Carbon Nanotubes, MWCNTs), stanowiące układ koncentrycznie zagnieżdżonych nanorurek podobnie jak kolejne warstwy w pniu drzewa. Odległość pomiędzy warstwami to ok 0.34 nm. Średnica SWCNT to 0.4 - 2 nm, natomiast dla MWCNT: 1.4 – 100 nm, podczas gdy długość osiąga rozmiary kilku µm dla obu typów. Wysoka gęstość elektronowa czyni nanorurki węglowe łatwo obserwowalnymi przy użyciu TEM-u. SWCNT widziane są zwykle jako wiązki z uwagi na silne oddziaływania van der Waalsa, MWCNT obserwowane są jako monodyspersyjne. [40-41]. Rys. 1.14. Obraz TEM wielościennych nanorurek węglowych MWCNT-COOH, strzałki pokazują obecność klastrów żelaza. [42].. 34.

(35) Z względu na geometrię możemy wyróżnić nanorurki ze strukturą typu „armchair”, „zigzag” lub chiralną. Pomimo strukturalnego podobieństwa do grafitu, który jest półprzewodnikiem nanorurki mogą być metaliczne (zawierają się w tej klasie wszystkie nanorurki ze strukturą typu „armchair” i niektóre typu „zigzag”) lub półprzewodzące. Z powodu praktycznie 1-wymiarowej struktury elektronicznej transport ładunków w metalicznych nanorurkach ma charakter balistyczny (tzn. bez rozpraszania) w odległościach rzędu długości nanorurek, umożliwiając uzyskanie wysokich napięć bez znacznej utraty ciepła. Również fonony mogą być łatwo propagowane wzdłuż nanorurek. Nanorurki węglowe charakteryzują się także wysoką wartością modułu Younga i odpornością na wysokie siły naprężeń. Istnieje wiele metod wytwarzania nanorurek węglowych, między innymi wyładowania łuku elektrycznego, ablacja laserowa, chemiczne osadzanie z fazy gazowej (CVD, chemical vapor deposition), często wykorzystywana jest obecność katalizatorów, najczęściej w postaci nanocząstek lub metali przejściowych. Wszystkie dotychczas znane metody syntezy nanorurek prowadzą do otrzymania produktów z pewną zawartością zanieczyszczeń – katalizatorów (Rys. 1.14), innych form węgla. Zanieczyszczenia te są usuwane (np. dzięki potraktowaniu kwasem), jednak wprowadza to inne zanieczyszczenia, degraduje długość i strukturę nanorurek oraz podnosi ich cenę. Dodatkowo nanorurki węglowe mogą być również funkcjonalizowane różnymi grupami chemicznymi. Źródłem wyjątkowego zainteresowania badaczy nanorurkami węglowymi jest ich możliwe zastosowanie w wielu różnych dziedzinach, takich jak elektronika, inżynieria materiałowa a nawet medycyna. Zaproponowanych zostało wiele potencjalnych zastosowań nanorurek węglowych, m. in. przewodzące i odporne mechanicznie kompozyty, urządzenia do magazynowania i konwersji energii, czujniki, wyświetlacze (field emission displays), źródła. promieniowania. (źródła. elektronów),. magazynowanie. wodoru,. urządzenia. półprzewodnikowe o rozmiarach rzędu nanometrów, sondy i złącza. Niektóre z tych zastosowań zostały już wdrożone, inne demonstrowane są w mniej lub bardziej zaawansowanym stopniu. Koszt nanorurek, ich polidyspersja i ograniczenia w przetwarzaniu oraz organizacji stanowią ważne bariery dla niektórych aplikacji. [40-41, 43]. 35.

(36) a.5.2.. Funkcjonalizowanie nanorurek węglowych. Unikalne. własności. strukturalne,. mechaniczne. i. elektryczne. nanorurek. wykorzystywane były najpierw głównie w inżynierii materiałowej. Później rozpoczęto badania ich interakcji głównie z białkami w celu rozwoju wydajnych biosensorów. Kombinacja nanorurek węglowych z białkami, kwasami nukleinowymi, polisacharydami utorowała ścieżkę badaniom nanorurek w połączeniu z biologicznymi systemami. Największą trudnością w badaniach biologicznych jest ich mały stopień dyspersji w środowisku wodnym. Jednym z rozwiązań jest ich funkcjonalizacja. Może być ona kowalencyjna i niekowalencyjna. Ta ostatnia przeprowadzana jest przy użyciu surfaktantów, kwasów nukleinowych, peptydów, polimerów. Zaletą tej metody jest fakt, iż zachowana zostaje elektroniczna struktura powierzchni nanorurek, co jest ważne w przypadku stosowania ich jako biosensorów. Użycie surfaktantów, choć wydajne, niesie z sobą również ograniczenia. Na przykład w przypadku badań biologicznych, mogą one przenikać przez błony biologiczne i charakteryzować się toksycznością [41].. Rys. 1.15. a) Mechanizm separacji nanorurek poprzez użycie surfaktantów oraz sonikacji; b) Zaproponowane modele adsorpcji molekuł surfaktanta na powierzchni nanorurek: (i) (ii) model cylindrycznych miceli, (iii) model półmiceli oraz (iv) model losowej adsorpcji. Rysunek na podstawie [44].. Druga metoda funkcjonalizacji polega na kowalencyjnym dołączaniu różnych grup funkcyjnych do zewnętrznej powierzchni nanorurek.. Wprowadzają one odpychanie. pomiędzy nanorurkami i pozwalają na ich łatwą dyspersję w rozpuszczalniku. W konsekwencji możliwa jest szeroka gama zastosowań w badaniach biologicznych: od użycia nanorurek jako substratu do wzrostu neuronów, podłoża dla liposacharydów, jako blokerów kanałów, czy też nośników substancji (leków, peptydów, białek, kwasów nukleinowych). [41] 36.

(37) Interesującym przedmiotem badań jest funkcjonalizacja nanorurek węglowych fosfolipidami i badanie oddziaływań nanorurek z błoną fosfolipidową czy też liposomami. Można tutaj wymienić badania, w których pokazano sposób funkcjonalizacji SWCNT przez błonę fosfolipidową [45]. Powierzchnia nanorurek węglowych była najpierw modyfikowana warstwą hydrofilowego polimeru, wokół której formowała się lipidowa warstwa. Możliwe okazało się również wstawienie białkowego oligomeru tworzącego por w dwuwarstwie. Utworzone struktury wg. autorów mogą zostać użyte m. in. jako biokompatybilne sondy wewnątrz komórek. W pracy [46] zaproponowano hybrydowy nanosensor oparty o działanie tranzystora polowego, w którym zintegrowane zostały: sieć jednościennych nanorurek węglowych i sztuczna dwuwarstwa lipidowa (patrz Rys. 1.16.) Pokazano, że utworzona struktura może specyficznie wykrywać obecność i aktywność dynamiczną jonoforow (na przykładzie gramicydyny i kalcymycyny) w błonie lipidowej. Wskazano na potencjalne użycie nanosensora w badaniach innych białek membranowych (np. kanałów jonowych bramkowanych ligandem, receptorów, toksyn wbudowujących się w błony, peptydów o działaniu przeciwbakteryjnym).. Rys. 1.16. Nanosensor oparty o działanie tranzystora polowego, w którym zintegrowane zostały: sieć jednościennych nanorurek węglowych i sztuczna dwuwarstwa lipidowa zbudowana z lipidów DOPC, DOPA i cholesterolu. a) obraz SEM sieci nanorurek, b) zależność przewodności układu od przyłożonego napięcia bramki w tranzystorze, c) schemat układu. Rysunek pochodzi z [46]. 37.

(38) Układy liposomów kowalencyjnie związanych z nanorurkami węglowymi zaproponowane zostały jako system dostarczania leków [47]. Nanorurki, mogące łatwo przenikać przez błony mogą przyspieszyć dostarczenie leku do określonego miejsca. Dzięki temu unika się utraty leku w naczyniach krwionośnych, co ma miejsce, gdy używane są tylko liposomy. Tworzone są również symulacje mające dać odpowiedź na pytania o interakcje nanorurek węglowych z błonami fosfolipidowymi. W pracy [48] symulowano przejście nanorurki węglowej przez błonę złożoną z POPC lub POPC z domieszką cholesterolu. Obliczono siłę potrzebną na przebicie błony, zależną od prędkości. nanorurki oraz energię swobodną,. związaną z przeniknięciem nanorurki przez błonę. Zostało to zilustrowane graficznie na Rys.1.17.. Rys. 1.17. Ilustracja, pokazująca nanorurkę węglową, przenikającą przez dwuwarstwę lipidową. Rysunek pochodzi z [48].. Wyniki. symulacji. przemieszczenia. przez. błonę. fosfolipidową. krótkich. (5. µm),. jednościennych nanorurek węglowych przedstawione zostały w [49]. Obliczenia pokazały, że nanorurki mają tendencję do pasywnego opartego na dyfuzji przechodzenia przez błony fosfolipidowe. Zaproponowano różne modele dla nanorurek z otwartymi lub zamkniętymi końcami, funkcjonalizowanych i bez funkcjonalizacji. Przykładowe ilustracje symulowanych procesów pokazane są na Rys. 1.18.. 38.

(39) Rys. 1.18. Ilustracja przenikania przez błonę nanorurki węglowej z a) zamkniętymi, b) otwartymi końcami. Rysunek pochodzi z [49].. Badano również organizację cząsteczek DPPC wokół SWCNT [50]. Symulacje dla niskiej koncentracji DPPC pokazały organizację molekuł w dwie cylindryczne warstwy wokół nanorurki. Hydrofobowe łańcuchy fosfolipidów zaadsorbowane zostały na powierzchni nanorurki, natomiast części hydrofilowe zorientowane były w kierunku fazy wodnej (Rys. 1.19).. Rys. 1.19. a) i b) Samoorganizacja molekuł DPPC wokół SWCNT przypadku niskiej koncentracji fosfolipidów (46 molekuł), c) Obserwowano maksima adsorpcji dla 11.01 i 15.41 A, co pokazuje istnienie 2 warstw wokół SWCNT na rys a). Pierwsza warstwa powstaje na skutek oddziaływania van der Waalsa pomiędzy łańcuchami DPPC a nanorurką węglową. Rysunki pochodzą z [50].. 39.

(40) W przypadku większego stężenia fosfolipidów formowały one wielowarstwowe struktury wokół nanorurki(Rys. 1.20). W punkcie nasycenia obserwowano samoorganizację w strukturę podobną do błony o szerokości 41.4 Å. Autorzy stwierdzają również, że wyniki ich symulacji są zgodne z eksperymentalnymi obserwacjami, w których na nanorurkach pokrytych DPPC obserwowano regularne prążki.. Rys. 1.20. W przypadku wysokiej koncentracji fosfolipidów wokół nanorurki samoorganizuje się struktura podobna do błony, w której środku znajduje się nanorurka, przypominająca nanoigłę, przebijającą błonę. Rysunki pochodzą z [50].. a.5.3.. Oddziaływanie nanorurek węglowych na organizmy roślinne. Pozytywny wpływ nanorurek węglowych na wzrost roślin opisywany był przez kilka grup badawczych. Zwiększenie wzrostu korzeniu w przypadku cebuli, ogórka i żyta opisane zostało m. in. w pracach [52-53]. W pracy [54] pokazano, że nanorurki węglowe mogą przemieszczać się do owoców, liści i korzeni pomidora.. Wywołało to silną interakcję. nanorurek z sadzonkami tych roślin i skutkowało znacznymi zmianami w ekspresji genów. Rośliny potraktowane nanorurkami węglowymi miały 2-krotnie więcej kwiatów i owoców w stosunku do roślin kontrolnych (patrz Rys. 1.21.). W pracy [55] pokazano, że SWCNT mogą przechodzić przez ścianę komórkową i błony komórek tytoniu. Niektóre badania wskazują, iż MWCNT przenikają do nasion zwiększając ich kiełkowanie [56-57]. Wielu badaczy wskazuje jednak także na negatywne efekty traktowania nasion, komórek roślinnych czy całych roślin nanorurkami węglowymi. Są to np.: (i) redukcja biomasy w przypadku badania cukinii [58], (ii) zmniejszenie długości korzeni sałaty [59], (iii). 40.

(41) uszkodzenia komórek ryżu– kondensacja chromatyny w cytoplazmie i śmierć komórek [60], (iv) opóźnione kwitnienie, zmniejszona wydajność [61]. Część prac wskazywała również na brak wpływu nanorurek na kiełkowanie, długość korzeni czy też inne cechy badanych roślin [52-53, 61].. Rys. 1.21. Wpływ węgla aktywowanego (AC) i nanorurek węglowych (CNT) na niektóre cechy fenotypowe pomidorów. AC i CNT dostarczano do roślin w trakcie podlewania. Stężenie CNT: 50 i 200 µg/ml a) Średnia wysokość roślin, b) po lewej roślina kontrolna, po prawej: traktowana nanorurkami o stężeniu 200 µg/ml, c) średnia liczba owoców, średnia liczba kwiatów. Rysunki pochodzą z pracy [54].. 41.

(42) 42.

(43) 2. Metody badawcze 2.1. Mikroskopia sił atomowych AFM jest być może najbardziej uniwersalną metodą należącą do rodziny mikroskopii ze skanującą sondą (SPM, scanning probe microscope). Rozwój SPM rozpoczął się we wczesnych latach 90-tych od wynalezienia przez G. Binninga i H. Rohrera skaningowego mikroskopu tunelowego (STM) [64]. Zrewolucjonizowało to mikroskopię i zostało wyróżnione Nagrodą Nobla w 1986 roku. Oprócz obrazów szczegółowej topografii badanych próbek AFM dostarcza informacji dotyczących innych charakterystyk, takich jak ich twardości, elastyczności czy lepkości próbek. Unikalne możliwości mikroskopii AFM pozwalają na badanie różnorodnych, także biologicznych obiektów w naturalnym wodnym środowisku z dobrą zdolnością rozdzielczą. AFM pozwala na badanie całej gamy oddziaływań – zarówno przyciągających, jak i odpychających, wliczając w to siły van der Waalsa, odpychające oddziaływania jon-jon, siły elektrostatyczne, magnetyczne, kapilarne, siły adhezji i tarcia. Badania określonych typów oddziaływań doprowadziły do rozwoju wyspecjalizowanych mikroskopów, pracujących w różnych środowiskach: w powietrzu, cieczy i próżni.[65-67] Zasada działania mikroskopu sił atomowych Główna idea mikroskopii sił atomowych opiera się na pomiarze oddziaływań pomiędzy badaną powierzchnią a elastyczną dźwignią z ostrą igłą (tzw. tipem) zamontowaną na jej końcu (Rys. 2.1.).. Rys. 2.1. Schemat pokazujący zasadę działania mikroskopu AFM.. 43.

(44) Podczas skanowania wzdłuż równoległych linii. tip. porusza się nad powierzchnią (lub. powierzchnia względem niego) dzięki piezoelektrycznemu skanerowi, umożliwiającemu pozycjonowanie w subnanometrowej rozdzielczości. Zmiana wygięcia dźwigni (deflection) mierzona jest dzięki odbitej od jej tylnej strony wiązki lasera, która następnie pada na kwadranty pozycjoczułego fotodetektora. Możliwe jest odwzorowanie powierzchni próbki dzięki rejestracji pozycji skanera przy użyciu pętli sprzężenia zwrotnego. Kontroluje ona wygięcie dźwigni lub amplitudę oscylacji w zależności od trybu pomiaru. Istnieje kilka metod obrazowania AFM, które często dzielone są ze względu na naturę oddziaływań występujących w poszczególnych przypadkach. Na charakterze tych oddziaływań zatrzymamy się na moment. Oddziaływania pomiędzy sondą AFM a badaną powierzchnią – potencjał LennardaJonesa Zmiany potencjału cząstki znajdującej się na końcu tipa z dyskretną cząstką powierzchni opisuje wzór Lennarda-Jonesa: 12 6 E (r )=4 ε [( σ ) −( σ ) ] r r ,. gdzie: E(r) – energia potencjału, ε i. (2.1.1.). σ są stałymi zależnymi od materiału ( σ jest w. przybliżeniu równe średnicy atomów), r - odległość . Wyrażenie 1/r12 wyjaśnia gwałtowny wzrost E(r) dla małych odległości, gdy r< σ i gdy atomy odpychają się spełniając zakaz Pauliego. Wyrażenie 1/r 6 odpowiada za wolniejsze zmiany o charakterze przyciągania gdy r jest stosunkowo duże w obszarze w którym dominują siły van der Waalsa (vdW) (odległość od 1 do kilku dziesiątek nm). Występujące pomiędzy dwoma atomami lub cząsteczkami oddziaływania mogą być rozseparowane na poniższe składowe: . Siły orientacyjne, które pochodzą od oddziaływania między 2 polarnymi molekułami, posiadającymi stałe momenty multipolowe;. . Siły indukcyjne, pochodzące od interakcji molekuł polarnych z neutralnymi, gdy molekuły polarne indukują polarności w tych ostatnich;. . Siły dyspersji, które dominują nad siłami orientacyjnymi i indukującymi poza przypadkami silnie polarnych molekuł.. 44.

(45) Siły dyspersji i siły van der Waalsa są zazwyczaj przyciągające i gwałtownie wzrastają gdy molekuły zbliżają się do siebie. Dla odległości większych od kilku nm siły dyspersji wykazują efekt osłabienia, co prowadzi do silniejszego zaniku oddziaływania. Te osłabione oddziaływania nazywa się siłami Casimira, gdy nieosłabione: siłami Londona. [65, 67-68] Zależność sił od odległości ilustruje poniższy Rys. 2.2.. Rys. 2.2. Gdy czyste, niefunkcjonalizowane ostrze z dużej odległości zbliża się do próbki znajduje się najpierw w obszarze przyciągających sił związanych z oddziaływaniami van der Waalsa, które rosną do osiągnięcia maximum, po czym wraz z dalszym zbliżaniem się do próbki zmniejszają się stopniowo, w końcu ostrze znajduje się w polu oddziaływań odpychających (odpychanie Pauliego).. Podwójna warstwa elektryczna Oddziaływanie. pomiędzy. ostrzem. AFM. a. powierzchnią próbki w warunkach wysokiej próżni może być uproszczone jako suma długozasięgowych oddziaływań van der Waalsa i krótkozasięgowych oddziaływań. chemicznych.. Jednak. w. cieczy. powierzchnia próbki często jest naładowana z powodu jonizacji grup powierzchniowych i/lub absorpcji. jonów.. elektrostatyczna. W. rezultacie. lokalna. komplikuje sytuację. Ładunek. Rys. 2.3. Schemat przedstawiający rozmieszczenie ładunków i zanik powierzchni jest balansowany przez jony potencjału w miarę oddalania się od przeciwnym znaku znajdujące się w jej pobliżu. naładowanej powierzchni.[67]. 45. siła o.

(46) Powstaje tzw. podwójna warstwa elektryczna (EDL , electric double layer,), której potencjał elektrostatyczny zanika eksponencjalnie wraz z oddalaniem się od powierzchni (Rys. 2.3.). EDL może być odpychająca lub przyciągająca w zależności od ładunku powierzchni i pH buforu a także od stężenia elektrolitów [67]. (Więcej w rozdziale 2.4). Obrazowanie AFM – tryby pomiaru Z uwagi na rodzaj oddziaływań, którym poddana jest sonda AFM możemy wyróżnić 3 główne tryby obrazowania: (i) kontaktowy (CM, contact mode), (ii) przerywanego kontaktu ( intermittent contact mode (IC), lub tapping mode (TM)) oraz (iii) tryb bezkontaktowy (noncontact mode (NC ).. Rys. 2.4. Schematyczne przedstawienie sil oddziaływania występujących pomiędzy ostrzem a powierzchnią próbki w zależności od ich wzajemnej odległości. Zaznaczono zakresy, w których możliwy jest pomiar w wybranym trybie.. Tryb kontaktowy W trybie kontaktowym tip sondy AFM znajduje się w bezpośrednim kontakcie z powierzchnią badanej próbki. W obszarze tym dominują kulombowskie oddziaływania jonjon o charakterze odpychającym, które gwałtownie zanikają wraz ze zwiększaniem się odległości. Ta silna zależność oddziaływania od odległości jest źródłem wysokiej przestrzennej zdolności rozdzielczej, osiąganej w mikroskopii AFM w trybie kontaktowym. Pomiar może być przeprowadzany zarówno w powietrzu jak i w cieczy. Siły nacisku 46.