Pomiar efektu Kautsky-ego
Pomiary indukowanych krzywych fluorescencyjnych zarejestrowanych dla układów PSII BBY modyfikowanych nanocząstkami TiO2 lub nanorurkami węglowymi o różnych stężeniach przeprowadzono przy użyciu fluorymetru Fast Fluorometer FL 3500-F firmy Photon System Instruments. Pozwala on na pomiary o rozdzielczości czasowej rzędu 1 µs. W celu zbadania wpływu nanocząstek tytanu lub nanorurek węglowych na aktywność fotosyntetyczną PSII do ich zawiesiny o określonym stężeniu [µg/ml] dodawano 2 – 5 µl świeżo rozmrożonej i inkubowanej w temperaturze 0 ºC próbki zawierającej PSII BBY. Końcowa objętość próbki wynosiła zawsze 3 ml. Tak otrzymana próbka była wytrząsana i inkubowana przez 6 min w temperaturze 0 ºC. Następnie po ponownym wytrząsaniu umieszczano próbkę w kuwecie i już we fluorymetrze poddawana była dodatkowo adaptacji w ciemności przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie wykorzystując protokół Kautsky-ego mierzono zmiany indukowanej fluorescencji w czasie. W poniższej tabeli zestawiono zakresy stężeń poszczególnych nanocząstek lub nanorurek węglowych wykorzystanych w badaniach.
Tab. 3.2.
Rodzaj nanomateriału Zakres stężeń zawiesin TiO2 lub MWCNT [µg/ml], do których dodawano BBY PSII
Stosunek TiO2 lub MWCNT do ChlBBY PSII [mg : mg] TiO2 (A11) 0.00067 - 2 0.0005 – 1.5 TiO2 (A11-S) 0.0033 – 2.33 0.003 - 1.75 TiO2 (RD5) 0.0017 – 2 0.0013 – 1.5 TiO2 (TM) 0.0017 – 13.3 0.0013 - 10 TiO2-Fe 1% 0.0017 – 1 0.0013 – 0.75 TiO2-Fe 5% 0.0017 – 13.3 0.0013 - 10 TiO2-Fe 15% 0.0017 – 13.3 0.0013 - 10 MWCNT-COOH 0.00033 - 1 0.00025 – 0.75 MWCNT-COONH4 0.00033 - 1 0.00025 – 0.75
Pomiar fluorescencji „steady-state”
Pomiary ekscytacyjnych widm fluorescencyjnych czystych BBY PSII oraz inkubowanych w obecności nanocząstek TiO2 (Tab. 3.2)posłużyły dobadania efektywności przesyłu energii w obrębie PSII. W eksperymentach tych wykorzystano spektrofotometr
fluorescencyjny Cary 4000 (Varian).
Próbki przygotowano w taki sam sposób jak do pomiarów efektu Kautsky’ego dla wybranych zakresów stężeń, dla których obserwowano istotne zmiany zależności parametrów charakteryzujących krzywe fluorescencji modulowanej w funkcji stężenia nanocząstek. Próbki po przygotowaniu były wytrząsane, inkubowane w ciemności w temperaturze 0ºC przez 6 min. Po zakończeniu inkubacji i ponownym wytrząsaniu, próbki umieszczano w kwarcowej kuwecie o długości drogi optycznej 10 mm. Widma ekscytacyjne mierzono przy emisji o długości fali 683, 690 i 677 nm w zakresie od 230 do 630 nm.
Badania termoluminescencyjne
Pomiary formowania się metastabilnych stanów na stronie akceptorowej PSII dla nietraktowanych BBY PSII i traktowanych wybranymi stężeniami TiO2 badano wykorzystując termoluminescencję. Koncentrowano się przede wszystkim na stężeniach nanocząstek tlenków tytanu, dla których obserwowano istotne zmiany efektu Kautsky’ego. Eksperymenty te przeprowadzono za pomocą aparatury Thermoluminescence System TL 300/HT (Photon System Instruments), umożliwiającej rejestrację widm w zakresie od -80ºC do 60ºC w wersji niskotemperaturowej lub od -10ºC do 180ºC w wersji wysokotemperaturowej.
Rys. 3.1. Aparatura do pomiarów termoluminescencji. Na Rys. a) widać: 1: głowicę pomiarową, 2: jednostkę kontrolną Fluorometer FL 3500, 3: termoregulator TR 2000, 4: jednostkę kontrolną TFPE1, sterującą jednostką chłodzącą AC-88, pokazaną na Rys. c).
b) widok z góry na głowicę pomiarową. Zdjęcia pochodzą ze strony Photon System Instruments
Ze względu na ograniczoną objętość próbki, którą można nałożyć na elektrodę głowicy termoluminescencyjnej, w przypadku pomiarów TL dopracowano nieco odmienną procedurę, która jednak zapewniała identyczny stosunek stężeń nanocząstek TiO2 względem chlorofilu w BBY PSII, jaki był stosowany w pomiarach fluorescencyjnych. Do zawiesiny nanocząstek tlenków tytanu o objętości 20 μl dodawano taką samą objętość świeżo rozmrożonej i trzymanej w temperaturze 0ºC próbki PSII BBY, a następnie całość po wytrząśnięciu inkubowano przez 6 min w temp. 0ºC w ciemności. Przed nałożeniem na elektrodę próbka była ponownie wytrząsana. Zawsze nakładano 20 μl. Natychmiast po nałożeniu próbki zamykano głowicę i uruchamiano protokół pomiarowy. Wszystko odbywało się w zaciemnionym pomieszczeniu laboratoryjnym.
Próbki po rozpoczęciu protokołu pomiarowego były adaptowane w ciemności przez 120 s w temperaturze 20 ºC, następnie schłodzone do -4 ºC i poddane działaniu pojedynczego błysku światła aktynowego. Po zastosowaniu błysku następowało stopniowe ogrzewanie próbki i pomiar intensywności termoluminescencji. Prędkość grzania wynosiła 1ºC/s. Widma mierzone były w zakresie od -4 do 80 ºC.
Pomiary DLS i potencjału zeta
Pomiary rozmiaru i potencjału zeta czystych nanocząstek TiO2 oraz nietraktowanych BBY PSII, jak i stworzonych z nich układów hybrydowych przeprowadzono przy użyciu analizatora Nano ZS (Malvern Instruments) w Instytucie Katalizy i Fizykochemii Powierzchni PAN w Krakowie. Zastosowany sprzęt pozwala na pomiary rozmiaru nanocząstek w zakresie od 0.3 nm do 10 µm, a potencjału zeta jedynie dla nanocząstek o wielkości od 5 nm do 100 um. Długość fali lasera wynosiła 633 nm, a kąt, pod jakim mierzono rozproszone światło 173º. Próbki przygotowano w taki sam sposób jak do pomiarów efektu Kautsky’ego dla wybranych stężeń TiO2. Próbki po przygotowaniu były wytrząsane, inkubowane w ciemności w temperaturze 0 ºC przez 6 min. Po zakończeniu inkubacji i ponownym wytrząsaniu próbki umieszczano w kuwecie o długości drogi optycznej 10 mm w przypadku DLS lub w dedykowanej do pomiarów zeta potencjału poliwęglanowej celce pomiarowej.
Badania topografii metodą AFM
Pomiary topograficzne nanocząstek tlenków tytanu, nanorurek węglowych, modelowych błon lipidowych, tylakoidów wzbogaconych w PSII oraz nano-układów
mieszanych, a także podłoży wykorzystanych w różnych konfiguracjach pomiarowych prowadzono metodą mikroskopii sił atomowych przy użyciu mikroskopu Agilent 5500 firmy Agilent Technologies (Rys. 3.2).
Pomiary wykonywano zarówno w powietrzu (głównie podłoża, nanocząstki TiO2 i nanorurki węglowe), jak i w buforze (BBY PSII, układy hybrydowe). Korzystano z trybów kontaktowego i przerywanego kontaktu. W trakcie pomiarów AFM używane były 2 rodzaje sond:
(a) sondy z azotku krzemu Si3N4 (MLCT, Bruker) o piramidalnym kształcie ostrza i promieniu nominalnym 20 nm zawieszonym na belce w kształcie litery V. Stała sprężystości używanych belek wynosiła 0.01 N/m (tryb kontaktowy) lub 0.1 N/m (tryb przerywanego kontaktu).
(b) krzemowe sondy (Multi75Al-G, Budget Sensors), których ostrze o kształcie stożka i promieniu nominalnym <10 nm zawieszone było na belce prostokątnej o wymiarach (225 x 28 x 3) μm. Nominalna stała sprężystości belki wynosiła 3 N/m, nominalna częstość rezonansowa: 75 kHz.
Obrazy STM powierzchni krzemu pokrytego złotem wykonane zostały przy użyciu platynowo-irydowego drucika o średnicy 0.25 nm. Wartości napięcia bias i natężenia prądu były optymalizowane dla każdego pomiaru, gdyż są one silnie zależne od warunków pomiarowych, m.in. temperatury i wilgotności powietrza.
Przygotowanie próbek do pomiarów AFM Próbki BBY PSII
Badania przestrzennego rozkładu izolowanych błon fotosyntetycznych, wzbogaconych w PSII na mice oraz na złotym podłożu przeprowadzono przy użyciu mikroskopu sił atomowych. W pomiarach (w trybie „tapping mode”) wykorzystano ostrza Multi75Al-G lub MLCT. Próbki do badań przygotowano w następujący sposób. Na powierzchnię miki lub złota nakładano objętość buforu, która pokrywała całą powierzchnię, tworząc menisk
Rys. 3.2. Mikroskop Agilent 5500, pozwalający na wykonanie zarówno pomiarów AFM, jak i STM.
wypukły. Następnie do buforu, tuż przy powierzchni dodawano od 10 do 20 µl próbki zawierającej błony wzbogacone w BBY PSII o stężeniach: od 1 µg Chl/ml do 1.5 mg Chl/ml. Po inkubacji, która trwała zazwyczaj od 30 minut do 1.5 h (w temperaturze 4 °C w ciemności) próbkę przepłukiwano w buforze HEPES I (pH 6.5). Podłoże umieszczano w szalce lub w komorze dedykowanej do pomiarów w cieczy i wypełnionej tym samym buforem.
Próbki MWCNT oraz BBY PSII + MWCNT
Pomiary samych nanorurek na złotym podłożu wykonano w powietrzu, natomiast pomiary nanorurek z materiałem biologicznym przeprowadzono w buforze. W obydwu przypadkach zastosowano tryb „tapping mode” oraz ostrza Multi75Al-G. Na świeżo napylone złote powierzchnie nałożono po 20 µl zsonikowanej (25 °C, 15 min) zawiesiny nanorurek węglowych o stężeniu 100 µg/ml ( w wodzie destylowanej) i pozostawiono do wyschnięcia. Mierzono rozkład przestrzenny i rozmiar cząstek zdeponowanych na złotej powierzchni. Następnie na złotą powierzchnię z nanorurkami nakładano 20 µl próbki zawierającej BBY PSII o stężeniu chlorofilu 1 µg/ml. Tak przygotowany układ inkubowano 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności a następnie próbkę i przepłukano w buforze HEPES I (pH 6.5). Próbkę umieszczano w szalce wypełnionej tym samym buforem.
Próbki TiO2 oraz BBY PSII + TiO2
Badania AFM układów BBY PSII + TiO2 na złotym podłożu wykonano w trybie „tapping mode” stosując ostrza Multi75Al-G. Na złotą powierzchnię nakładano ściśle określoną objętość TiO2 (10 µg/ml) zawieszonego w buforze Hepes I i pozostawiono do wyschnięcia. Następnie przepłukano podłoże z nałożonymi nanocząstkami. Przykładowe obrazy rozkładu TiO2 na złotej powierzchni pokazane zostały w Rozdziale 4.3. Na dalszym etapie pomiarowym całe podłoże pokrywano taką objętością buforu, aby utworzyć menisk wypukły. Tuż przy powierzchni wkrapiano od 10 µl do 20 µl próbki zawierającej błony tylakoidów wzbogacone w PSII o stężeniu chlorofilu 1 µg/ml. Po 30 min. inkubacji w ciemnościach, w temperaturze 4 °C próbkę przepłukiwano buforem HEPES I (pH 6.5) i umieszczano w szalce wypełnionej tym samym buforem.
Charakterystyka podłoży wykorzystanych w badaniach AFM
Do pomiarów układów fotosystemów z nanocząstkami tlenków tytanu i nanorurkami węglowymi wykorzystywano mikę typu muscovite (typ V) i złote powierzchnie, powstałe przez napylenie warstwy złota (Au(111) o grubości 280 lub 300 Å na warstwę MgO w Zespole Nanostruktur Powierzchniowych Katedry Fizyki Ciała Stałego AGH, kierowanym przez prof. J. Koreckiego. Mika wybrana została ze względu na łatwość otrzymywania czystych powierzchni o dużym stopniu gładkości i charakterze hydrofilowym (odpowiednim do badania struktur biologicznych). Złoto zostało wybrane jako powierzchnia przewodząca do pomiarów STM. Na Rys. 3.3. przedstawiono obraz topografii AFM świeżo napylonej powierzchni złota, wykorzystanej w badaniach. Na podstawie otrzymanego obrazu obliczono wartość średniej kwadratowej chropowatości RMS.
Rys. 3.3. A) Topografia AFM świeżo napylonej powierzchni złota o orientacji (111) i wartości średniej kwadratowej chropowatości RMS: 0.487 ± 0.033 nm (średnia wartość zmierzona dla 24 obszarów o powierzchni 0.5 μm2; B) Przekroje wzdłuż linii 1 i 2. Skan o wymiarach (4.5 x 4.5) µm.
Obrazy uzyskane metodą STM pokazano na Rys. 3.4 – 3.7. Na powierzchni o wymiarach (750 x 750) nm widoczne są po lewej stronie niedoskonałości powierzchni a po prawej charakterystyczne tarasy. Na kolejnych obrazach o mniejszych rozmiarach w szczegółowy sposób uwidoczniono zarówno zagłębienia w powierzchni jak i strukturę tarasów. Zamieszczone przekroje poprzeczne dają informację o wielkości obserwowanych struktur.
Rys. 3.4. Obraz STM świeżo napylonej powierzchni złota o wymiarach ok. 750 x 750 nm, z widocznymi po lewej stronie niedoskonałościami powierzchni i po prawej charakterystycznymi tarasami – fragmentami powierzchni o większej regularności
Rys. 3.5. A) Obraz STM fragmentu napylonej powierzchni złota z widocznymi zagłębieniami bądź wybrzuszeniami powierzchni. Skan o wymiarach (500 x 500) nm. B) Profile zaznaczone na obrazie STM. Wysokości (h) i głębokości (g) zaznaczonych za pomocą przekrojów struktur wyniosły odpowiedniodla 1: h do 17.2 nm i g= 14.5 nm; 2: hśr=0.96 nm i gśr= 0.78 nm, 3: gśr= 8.5 nm; 4: g= 6.2 nm; 5: h= 9 nm.
Rys. 3.6. Obrazy STM obszarów zaznaczonych na Rys. 3.4. niebieskimi strzałkami. Widać wyraźnie uporządkowaną strukturę powierzchni. Skany o wymiarach (230 x 230) nm i (130 x 130) nm.
Rys. 3.7. A i B. Obrazy STM świeżo napylonej powierzchni złota z widocznymi tarasami. Fragmenty powierzchni o dużym stopniu jednorodności. Wymiary skanów: A): (555 x 555) nm i B) (150 x 150) nm. C) Przekroje poprzeczne zaznaczone na rys. B. Wysokości, wskazane na rys. C przez niebieskie linie: h1: 0.802 nm; h2: 0.596 nm. W większości przypadków mierzone wysokości tarasów widocznych na obrazach wynosiły poniżej 1 nm.