AFM jest być może najbardziej uniwersalną metodą należącą do rodziny mikroskopii ze skanującą sondą (SPM, scanning probe microscope). Rozwój SPM rozpoczął się we wczesnych latach 90-tych od wynalezienia przez G. Binninga i H. Rohrera skaningowego mikroskopu tunelowego (STM) [64]. Zrewolucjonizowało to mikroskopię i zostało wyróżnione Nagrodą Nobla w 1986 roku. Oprócz obrazów szczegółowej topografii badanych próbek AFM dostarcza informacji dotyczących innych charakterystyk, takich jak ich twardości, elastyczności czy lepkości próbek. Unikalne możliwości mikroskopii AFM pozwalają na badanie różnorodnych, także biologicznych obiektów w naturalnym wodnym środowisku z dobrą zdolnością rozdzielczą. AFM pozwala na badanie całej gamy oddziaływań – zarówno przyciągających, jak i odpychających, wliczając w to siły van der Waalsa, odpychające oddziaływania jon-jon, siły elektrostatyczne, magnetyczne, kapilarne, siły adhezji i tarcia. Badania określonych typów oddziaływań doprowadziły do rozwoju wyspecjalizowanych mikroskopów, pracujących w różnych środowiskach: w powietrzu, cieczy i próżni.[65-67]
Zasada działania mikroskopu sił atomowych
Główna idea mikroskopii sił atomowych opiera się na pomiarze oddziaływań pomiędzy badaną powierzchnią a elastyczną dźwignią z ostrą igłą (tzw. tipem) zamontowaną na jej końcu (Rys. 2.1.).
Podczas skanowania wzdłuż równoległych linii tip porusza się nad powierzchnią (lub powierzchnia względem niego) dzięki piezoelektrycznemu skanerowi, umożliwiającemu pozycjonowanie w subnanometrowej rozdzielczości. Zmiana wygięcia dźwigni (deflection) mierzona jest dzięki odbitej od jej tylnej strony wiązki lasera, która następnie pada na kwadranty pozycjoczułego fotodetektora. Możliwe jest odwzorowanie powierzchni próbki dzięki rejestracji pozycji skanera przy użyciu pętli sprzężenia zwrotnego. Kontroluje ona wygięcie dźwigni lub amplitudę oscylacji w zależności od trybu pomiaru. Istnieje kilka metod obrazowania AFM, które często dzielone są ze względu na naturę oddziaływań występujących w poszczególnych przypadkach. Na charakterze tych oddziaływań zatrzymamy się na moment.
Oddziaływania pomiędzy sondą AFM a badaną powierzchnią – potencjał Lennarda-Jonesa
Zmiany potencjału cząstki znajdującej się na końcu tipa z dyskretną cząstką powierzchni opisuje wzór Lennarda-Jonesa:
E (r )=4ε [( σr ) 12 −( σ r ) 6 ] , (2.1.1.)
gdzie: E(r) – energia potencjału, ε i σ są stałymi zależnymi od materiału ( σ jest w przybliżeniu równe średnicy atomów), r - odległość .
Wyrażenie 1/r12 wyjaśnia gwałtowny wzrost E(r) dla małych odległości, gdy r< σ i gdy atomy odpychają się spełniając zakaz Pauliego. Wyrażenie 1/r6 odpowiada za wolniejsze zmiany o charakterze przyciągania gdy r jest stosunkowo duże w obszarze w którym dominują siły van der Waalsa (vdW) (odległość od 1 do kilku dziesiątek nm).
Występujące pomiędzy dwoma atomami lub cząsteczkami oddziaływania mogą być rozseparowane na poniższe składowe:
Siły orientacyjne, które pochodzą od oddziaływania między 2 polarnymi molekułami, posiadającymi stałe momenty multipolowe;
Siły indukcyjne, pochodzące od interakcji molekuł polarnych z neutralnymi, gdy molekuły polarne indukują polarności w tych ostatnich;
Siły dyspersji, które dominują nad siłami orientacyjnymi i indukującymi poza przypadkami silnie polarnych molekuł.
Siły dyspersji i siły van der Waalsa są zazwyczaj przyciągające i gwałtownie wzrastają gdy molekuły zbliżają się do siebie. Dla odległości większych od kilku nm siły dyspersji wykazują efekt osłabienia, co prowadzi do silniejszego zaniku oddziaływania. Te osłabione oddziaływania nazywa się siłami Casimira, gdy nieosłabione: siłami Londona. [65, 67-68] Zależność sił od odległości ilustruje poniższy Rys. 2.2.
Rys. 2.2. Gdy czyste, niefunkcjonalizowane ostrze z dużej odległości zbliża się do próbki znajduje się najpierw w obszarze przyciągających sił związanych z oddziaływaniami van der Waalsa, które rosną do osiągnięcia maximum, po czym wraz z dalszym zbliżaniem się do próbki zmniejszają się stopniowo, w końcu ostrze znajduje się w polu oddziaływań odpychających (odpychanie Pauliego).
Podwójna warstwa elektryczna
Oddziaływanie pomiędzy ostrzem AFM a powierzchnią próbki w warunkach wysokiej próżni może być uproszczone jako suma długozasięgowych oddziaływań van der Waalsa i krótkozasięgowych oddziaływań chemicznych. Jednak w cieczy powierzchnia próbki często jest naładowana z powodu jonizacji grup powierzchniowych i/lub absorpcji jonów. W rezultacie lokalna siła elektrostatyczna komplikuje sytuację. Ładunek powierzchni jest balansowany przez jony o przeciwnym znaku znajdujące się w jej pobliżu.
Rys. 2.3. Schemat przedstawiający rozmieszczenie ładunków i zanik potencjału w miarę oddalania się od naładowanej powierzchni.[67]
Powstaje tzw. podwójna warstwa elektryczna (EDL , electric double layer,), której potencjał elektrostatyczny zanika eksponencjalnie wraz z oddalaniem się od powierzchni (Rys. 2.3.). EDL może być odpychająca lub przyciągająca w zależności od ładunku powierzchni i pH buforu a także od stężenia elektrolitów [67]. (Więcej w rozdziale 2.4).
Obrazowanie AFM – tryby pomiaru
Z uwagi na rodzaj oddziaływań, którym poddana jest sonda AFM możemy wyróżnić 3 główne tryby obrazowania: (i) kontaktowy (CM, contact mode), (ii) przerywanego kontaktu ( intermittent contact mode (IC), lub tapping mode (TM)) oraz (iii) tryb bezkontaktowy (non-contact mode (NC ).
Rys. 2.4. Schematyczne przedstawienie sil oddziaływania występujących pomiędzy ostrzem a powierzchnią próbki w zależności od ich wzajemnej odległości. Zaznaczono zakresy, w których możliwy jest pomiar w wybranym trybie.
Tryb kontaktowy
W trybie kontaktowym tip sondy AFM znajduje się w bezpośrednim kontakcie z powierzchnią badanej próbki. W obszarze tym dominują kulombowskie oddziaływania jon-jon o charakterze odpychającym, które gwałtownie zanikają wraz ze zwiększaniem się odległości. Ta silna zależność oddziaływania od odległości jest źródłem wysokiej przestrzennej zdolności rozdzielczej, osiąganej w mikroskopii AFM w trybie kontaktowym. Pomiar może być przeprowadzany zarówno w powietrzu jak i w cieczy. Siły nacisku
mieszczą się w przedziale: 10-6 – 10-10 N. Tryb ten realizowany jest na dwa sposoby: przy zachowaniu stałej siły lub stałej wysokości. W obrazowaniu CM ze stałą siłą wychylenie dźwigni, poprzez pętlę sprzężenia zwrotnego, utrzymywane jest na stałym poziomie. Sygnał wyjściowy z pętli: Uz używany jest do aktualizowania pozycji próbki lub skanera, tak by zachowane było stałe ugięcie dźwigni (stała siła). Sygnał ten rejestrowany jest w funkcji położenia (x,y). Natomiast położenie określone jest dzięki przyłożeniu napięcia Ux i Uy do odpowiednich piezoelektryków skanera. Tak otrzymane Uz(Ux,Uy) może być ostatecznie przekonwertowane na obraz topografii z(x,y) pod warunkiem, że znane są czułości piezoelektryków. Zgodnie z procedurą eksperymentu w tym trybie mierzone są powierzchnie o równej sile. W obrazowaniu CM ze stałą wysokością ustalana jest odległość sondy od powierzchni próbki i bezpośrednio mierzone jest wygięcie belki pomiarowej [67].
Choć praca trybie CM umożliwia uzyskanie wysokiej rozdzielczości, może powodować uszkodzenia próbek, gdyż w trakcie pomiaru obecne są znaczne siły tarcia i intendancyjne. Ponadto punktowy kontakt końcówki ostrza sondy AFM o małym promieniu krzywizny na powierzchni badanej próbki stanowi idealny zarodek nukleacji. W warunkach normalnej względnej wilgotności warstwa wody kondensuje na powierzchni próbki. W związku z tym tip znajdujący się blisko powierzchni próbki jest 'ściągany' w jej kierunku przez duże siły kapilarne. Ich obecność sprawia, że całkowite siły oddziaływania podczas obrazowania mogą okazać się na tyle duże, że spowodują zniszczenie lub przemieszczenie delikatnej próbki. Wyeliminowanie tych sił jest możliwe poprzez pomiar w kontakcie w cieczy lub zamknięcie głowicy pomiarowej w atmosferze suchego powietrza, co jednak ogranicza łatwy dostęp do próbki.[67]
Tryb bezkontaktowy (NC) i przerywanego kontaktu (TM)
Wiele z opisanych wcześniej przeszkód można ominąć, stosując tryby dynamiczne: bezkontaktowy lub przerywanego kontaktu, w których dźwignia oscyluje z częstotliwością bliską swojej częstotliwości rezonansowej nad powierzchnią próbki. Zmiana w amplitudzie drgań (metoda z modulacją amplitudy (AM)) lub w częstotliwości (metoda z modulacją częstotliwości (FM)) używana jest do monitorowania odległości próbka - ostrze dzięki pętli sprzężenia zwrotnego. W trybach tych mamy do czynienia z długozasięgowymi siłami przyciągającymi pomiędzy tipem a badaną próbką. Oddziaływania te są słabsze niż odpychające siły w trybie kontaktowym: mieszczą się w granicach od 10-12 do 10-9 N.
W trybie przerywanego kontaktu centralna pozycja tipu znajduje się w obszarze oddziaływań przyciągających i dotyka co jakiś czas powierzchni podczas skanowania. Nie powoduje to znacznych uszkodzeń i rozdzielczość obrazu jest wystarczająco wysoka, dlatego tryb ten jest często stosowany do obrazowania próbek biologicznych. Tapping mode w powietrzu pozwala na uniknięcie 'złapania' tipu przez siły kapilarne. Dźwignia jest wprawiana w oscylacje o amplitudach do ok. 100 nm. Oprócz eliminowania sił kapilarnych w trybie tym redukowane są także siły lateralne, gdyż kontakt tipu z powierzchnią próbki jest zmniejszony.
W trybie bezkontaktowym tip właściwie nigdy nie dotyka powierzchni próbki, stąd tryb ten jest nieniszczący. Dźwignia oscyluje z amplitudą o wartości kilku nm w odległości 10 – 100 nm od badanej powierzchni, podczas gdy względnie długozasięgowe przyciągające siły van der Waalsa wywierają tłumiący wpływ na drgania. Sprawia to, że amplituda oscylacji jest redukowana wraz ze zbliżaniem się tipa do powierzchni. Rozdzielczość przestrzenna w trybie non-contact zależy silnie od geometrii tipa i jego odległości od powierzchni. Wielkość mierzonych sił vdW jest determinowana nie tylko przez promień tipa, jego odległość r, ale także przez przenikalności dielektrycznej tipa, próbki i otaczającego medium.
Metoda pomiaru w trybach dynamicznych jest czuła raczej na gradienty niż na wartości siły. Obecność gradientu siły F' = ∂F/∂z skutkuje zmianą efektywnej stałej sprężystości dźwigni: keff = k – k' (k – stała sprężystości dźwigni przy braku oddziaływań pomiędzy ostrzem a próbką). Oddziaływania pomiędzy ostrzem a próbką o charakterze przyciągającym (F'>0) osłabiają efektywną stałą sprężystości, natomiast oddziaływania odpychające ją wzmacniają. Zmiana keff z kolei skutkuje zmianą częstotliwości rezonansowej: ω= (keff/m)1/2 = ω0(1- F'/k)1/2, ω0- częst. rezonansowa przy braku gradientu sił.[67]
Inne, przykładowe metody pomiaru, gdyż nie sposób wymienić tu wszystkich to:
Mikroskopia sił elektrostatycznych (EFM, electrostatic force microscopy) - badania długozasięgowych oddziaływań kulombowskich. Pomiędzy próbkę i tip przyłożone jest napięcie bias. Ostrze/próbka wprowadzane jest w drgania – detekcja częstotliwości i przesunięcia fazy daje informacje o gęstości ładunku i jego znaku na powierzchni próbki. Mikroskopia sił magnetycznych (MFM, magnetic force microscopy) – badania
oddziaływań pomiędzy ferromagnetycznym tipem i ferro- lub paramagnetyczną próbką. Uzyskiwane są informacje na temat domen magnetycznych
Spektroskopia sił - eksperymenty polegające na wywieraniu nacisku na próbkę za pomocą ostrza, jak i na rozciąganiu molekuł pomiędzy podłożem a tipem. W niektórych stosuje się funkcjonalizowane ostrza. Dźwignia z tipem przemieszczana w kierunku prostopadłym do powierzchni próbki w cyklu podchodzenie-kontakt-odejście podczas którego monitorowane jest odgięcie dźwigni w zależności od jej położenia (odległości od powierzchni). W ten sposób rejestrowana jest krzywa zależności siły od odległości, z której można uzyskać informacje dotyczące oddziaływania tip-próbka. Krzywa podchodzenia może posłużyć do pomiaru elastycznych właściwości próbki natomiast krzywa odchodzenia –adhezji. Zakres sił, mierzonych przez AFM zawiera się w przedziale do dziesiątek pN do dziesiątek nN. Znaczenie pomiarów krzywych siłowych polega na tym, że może zostać wybrany konkretny punkt, w którym chcemy znać dokładną wartość zaaplikowanej siły. Można dodatkowo lokalnie uzyskać takie informacje jak: maksimum siły przyciągania i maximum siły adhezji, lokalne własności mechaniczne, siły powierzchniowe. Możliwe jest mapowanie pozwalające na zebranie serii krzywych z określonego obszaru w trybie tzw. force volume mapping. W biologicznych zastosowaniach tego trybu najpowszechniej używane jest mapowanie adhezji i elastyczności. [65-68]
Pomiary AFM z próbnikami fukcjonalizowanymi specyficznymi molekułami wyewoluowały do pomiarów TREC (Topography and Recognition Imaging ) – jednoczesnego rejestrowania topografii i sił w każdym miejscu badanej powierzchni i co za tym idzie - do rozpoznawania określonych molekuł na powierzchni. [66]
Wpływ elementów mikroskopu na rozdzielczość i precyzję mikroskopii AFM
O rozdzielczości i precyzji mikroskopii sił atomowych decydują: (i) sonda pomiarowa, (ii) skaner piezoelektryczny oraz (iii) precyzyjny układ kontrolujący pozycję sondy względem próbki.
Sonda AFM
Bezpośrednio dotyka badanej próbki lub pośrednio wyczuwa siły oddziaływania pochodzące od powierzchni. Stąd jest to jeden z najważniejszych elementów mikroskopu AFM, od którego zależy jakość zebranych danych. Składa się z elastycznej dźwigni, na której zamocowany jest tip, oddziałujący z badaną powierzchnią. Sondy otrzymywane są przy
użyciu technik rozwiniętych do tworzenia zintegrowanych obwodów scalonych, takich jak np. fotolitografia, wytrawianie czy osadzanie z fazy gazowej. Dźwignie i tipy są prawie zawsze wykonane z krzemu lub azotku krzemu - obojętnych dla większości próbek biologicznych. Mogą być przewodzące lub nieprzewodzące, są więc często pokryte innym materiałem. Jeśli stosuje się optyczny pomiar odchylenia dźwigni pokryta jest ona cienką warstwą złota lub aluminium by zwiększyć współczynnik odbicia lub, gdy wymagana jest czułość magnetyczna stosuje się pokrycie materiałem ferromagnetycznym. Sondy zwykle należą do jednego z 2 typów geometrii- o belce w kształcie litery V oraz o belce prostokątnej. Niezależnie od geometrii belki zależność siły od ugięcia dźwigni oddziałującej z próbką oddaje wzór, opisujący prawo Hooke'a: F = -k·s, gdzie s – przemieszczenie , k – stała sprężystości dźwigni, proporcjonalna do jej grubości i odwrotnie proporcjonalna do jej długości. [66-67] Tipy mają najczęściej kształt piramidalny lub stożkowy i mogą charakteryzować się wysokim lub niskim współczynnikiem kształtu- stosunkiem długości ostrza do jego promienia lub kąta rozwarcia (tzw. aspect ratio). Specyfikacja dźwigni poza wymiarami geometrycznymi dotyczy jej częstotliwości rezonansowej, stałej sprężystości i współczynnika Q. Dźwignie o wysokim ν0 i k są odpowiednie do pomiarów biologicznych próbek w trybach bezkontaktowym lub przerywanego kontaktu, podczas gdy dźwignie o najmniejszych wartościach k są najlepsze do trybu kontaktowego. Sondy używane zazwyczaj do trybu „tapping mode” mają dł. ~100 um, szer. ~50 um i częstotliwość rezonansową 5 – 500 kHz (dostępne są oczywiście sondy w szerszym zakresie parametrów).[66-67]
Skaner piezoelektryczny
Kolejnym kluczowym elementem AFM-u jest piezoelektryczny przetwornik. Wykorzystuje się tutaj odwrotny efekt piezoelektryczny, który polega na zmianie wymiarów piezoelektrycznego kryształu po przyłożeniu do jego przeciwległych ścian różnych potencjałów. W skanerach AFM jako element piezoelektryczny używane są zwykle materiały ceramiczne, tzw. PZT (lead zirconate titanates). Ruch próbki lub ostrza może być kontrolowany dzięki temu w 3 ortogonalnych kierunkach. Najczęściej stosowanym rozwiązaniem jest skaner w postaci piezoelektrycznej tuby. Poprzez przyłożenie napięcia do wewnętrznej i wszystkich zewnętrznych elektrod można spowodować wydłużenie lub skrócenie tuby (ruch w kierunku z), jeśli napięcie przyłożone jest do jednej z zewnętrznych elektrod, spowoduje to zgięcie tuby skanera i w konsekwencji ruch w kierunku x lub y. [65]
Rys. 2.5. a) i b) Sondy do pomiarów AFM [69], c) Schemat przedstawiający skaner w postaci piezoelektrycznej tuby. Na przekroju poprzecznym skanera zaznaczono elektrody [68].
Układ detekcji ruchu sondy
Podczas rozwoju AFM-u używanych było kilka różnych metod detekcji ruchu sondy pomiarowej, które można podzielić na 2 kategorie: optyczne i elektryczne.
Najbardziej powszechnie używaną metodą w nowoczesnych komercyjnych systemach AFM jest detekcja odchylenia wiązki lasera. Jest to metoda najprostsza, najtańsza i najbardziej uniwersalna. Funkcję fotodetektora spełnia zazwyczaj prosta fotodioda półprzewodnikowa, zamieniająca padające światło na sygnał elektryczny. Fotodioda podzielona jest na 4 sekcje, umożliwiające rozróżnienie normalnych i lateralnych ruchów dźwigni. Źródłem wiązki padającej na dźwignię jest zazwyczaj laser, jednak w nowych wysoce wydajnych systemach AFM (high performance AFM) diody SLD (super-luminescent diodes) stają się standardem. Inną optyczną metodą detekcji ruchu dźwigni jest interferometria, której zaletą jest bardzo dobry stosunek sygnału do szumu, jednak wadą – konieczność izolacji systemu od drgań akustycznych, wibracyjnych.
Wśród elektrycznych metod detekcji wymienić można tunelowanie elektronów (sensor STM mierzący wychylenie dźwigni pokrytej przewodzącą warstwą). Jednak ta metoda ma minusy -sensor STM jest czuły na nierówności na powierzchni belki sondy AFM, więc końcowy obraz jest złożeniem właściwej powierzchni próbki z topografią tylnej powierzchni belki. Inne elektryczne metody detekcji to detekcja pojemnościowa, detekcja przy użyciu dźwigni wykonanej z lub pokrytej materiałem piezoelektrycznym.[66-68]
Rodzaje obrazów otrzymywanych podczas pomiarów AFM
Topografia jest zdecydowanie najczęstszym sposobem zapisu obrazów AFM. Informacja użyta do ich zapisu to przemieszczenie skanera w kierunkach x, y i z. Ten typ obrazów AFM umożliwia pomiar wysokości badanych struktur. Choć jest to dość oczywiste, jest jednak warte odkreślenia, gdyż w innych typach obrazów używane są inne metody kontrastu i ta informacja nie jest rejestrowana.
Obrazowanie sił tarcia (frictional force, lateral force imaging), zwane też obrazowaniem sił lateralnych – wykorzystywana jest tutaj informacja o różnicy intensywności sygnału pochodzącego z kwadrantów po lewej i prawej stronie fotodiody, odzwierciedlających skręcanie belki pod wpływem sił lateralnych. Ten typ obrazów ujawnia czasem informacje niedostępne np. dla topografii.
Obraz z kontrastem fazy – faza, a dokładniej opóźnienie fazowe jest wielkością, która może być mierzona w trybach dynamicznych. Gdy ostrze uderza o próbkę faza jego oscylacji ulega zaburzeniu i nie są one już zgodne w fazie z sygnałem podawanym przez oscylator. Dzieje się tak, ponieważ ostrze uderzając o próbkę przekazuje jej małą porcję energii, ilość tej energii zależy od lepkości i elastyczności próbki. Dobry kontrast w obrazie fazy otrzymuje się dla próbek, dla których co najmniej 2 składniki różnią się znacznie własnościami wiskoelastycznymi. [68]
W trakcie pomiaru na lateralne wymiary obrazowanych obiektów wpływa promień ostrza R (Rys. 2.6.). Rejestrowana szerokość obiektów w związku z tym wynosi w= 4√(rR) (wzór 2.1.2) [66]. Zmierzona wysokość obiektów odpowiada rzeczywistej wysokości o ile nie badamy próbek ulegających zniekształceniu przez skanujące ostrze. Wpływ rozmiarów ostrza jest szczególnie widoczny w przypadku badania małych próbek. [66]
Rys. 2.6. Wpływ rozmiarów ostrza na otrzymane wielkości obiektów