Fluorescencja jest jednym z procesów promienistego oddawania energii na skutek przejść pomiędzy singletowymi stanami elektronowymi cząsteczek. Światło emitowane jest przez molekuły chromoforów, które przechodzą z najniższego stanu singletowego S1 do singletowego stanu podstawowego S0. Generacja fluorescencji, jak i innych możliwych rodzajów luminescencji przedstawiona została na Rys 2.9. za pomocą diagramu Jabłońskiego [77].
Rys. 2.9. Diagram Jabłońskiego pokazujący poziomy elektronowe w cząsteczce i możliwe przejścia pomiędzy stanami. Niebieskie strzałki oznaczają procesy absorpcji (charakterystyczny czas t ~ 10-15s). Czerwone strzałki oznaczają fluorescencję – promieniste przejścia pomiędzy najniższym singletowym stanem cząsteczki a stanem S0. Przerywane linie oznaczają fosforescencję – przejścia ze stanów tripletowych do stanu podstawowego. Mechanika kwantowa zabrania przejść ze zmianą multiplotowości, dlatego prawdopodobieństwo zajścia tego procesu jest niższe i czas życia stanów T1 jest dłuższy (10-6 – 1 s). Przejścia fluorescencyjne są natomiast znacznie szybsze: wynika to z czasu życia stanów singletowych (10-10 – 10-7 s). Możliwe są również bezpromieniste przejścia, zaznaczone na rysunku liniami zielonymi. [77]
Fluorescencja chlorofilu
Spośród wielu metod optycznych pozwalających na badanie procesu fotosyntezy techniki fluorescencyjne pozwalają na nieniszczące badanie fotochemicznych i niefotochemicznych procesów zachodzących w błonach tylakoidów, chloroplastach, tkankach roślinnych czy też całych roślinach. Procesy
fotochemiczne to separacja ładunku w centrach reakcji fotosystemu typu II (PSII) a następnie transport ładunku (elektronów) przez łańcuch przekaźników. Niefotochemiczne procesy to fluorescencja chlorofilu oraz uwalnianie ciepła. Procesy te mają charakter konkurencyjny (antyrównoległe sprzężenie), co oznacza, że wzrost wydajności jednego z nich skutkuje spadkiem dwóch pozostałych. Stąd, pomiar wydajności fluorescencji daje informację o zmianach w wydajności
(efektywności) procesów fotochemicznych i rozpraszania ciepła. [75]
Maksima absorpcji (a co za tym idzie fluorescencji) cząsteczek zależą od rodzaju otaczającego środowiska. W związku z tym dimery chlorofilu w centrum reakcji mają najniższą energię i stanowią pułapki energetyczne, do których przekazywana jest cała zaabsorbowana energia. Zatem całkowita wtórna fluorescencja pochodzi głównie od PSII (90%). Należy zwrócić uwagę na fakt, że większość energii (80%) jest zużywana na procesy fotochemiczne a tylko 2-5% emitowana jest jako światło fluorescencji. [75]
Choć fluorescencja ma tak mały udział w procesie deekscytacji fotosyntetycznych barwników to jednak zmienna w czasie wydajność fluorescencji (time-varying fluorescence yield) pozwala na badanie mechanizmów regulacji 'gospodarowania' zaabsorbowaną przez PSII energią.
Fluorescencję, pochodzącą od roślin możemy podzielić na szybką fluorescencję (prompt fluorescence, PF) oraz opóźnioną fluorescencję (delayed fluorescence, DF). DF stanowi niewielką część tej emisji. W przypadku szybkiej fluorescencji (PF) światło emitowane jest na skutek przejścia elektronu z pierwszego stanu wzbudzonego do stanu podstawowego. Natomiast w przypadku fluorescencji opóźnionej pierwszy singletowy stan wzbudzony osiągany jest przez rekombinację ładunku (nie przez absorpcję) i dopiero po niej następuje przejście do stanu podstawowego. [78]
Rys. 2.7. Schemat pokazujący możliwe procesy, w których wykorzystana zostaje energia wzbudzenia cząsteczki chlorofilu.
PF praktycznie zanika po 5 ns. Sygnał spada wielofazowo z charakterystycznymi czasami życia w zakresie od kilku ps do co najwyżej 2 ns. Spadek DF również ma charakter wielofazowy. Komponenty charakteryzują się różnymi czasami życia: od nanosekund poprzez czasy rzędu mikro- i milisekund po nawet po zakres rzędu minut-godzin.
Fluorescencja opóźniona choć mniej znana niż szybka fluorescencja, pozwala uzyskać użyteczne informacje dotyczące reakcji wstecznych w transferze elektronów w obrębie PSII. Obserwowana jest w roślinach, algach i cyjanobakteriach i ściśle związana z początkowymi procesami konwersji energii świetlnej w centrum reakcji fotosystemu typu II. Rysunek 2.8 schematycznie pokazuje diagram energetyczny PSII oraz przejścia pomiędzy stanami dającymi wkład w sygnał fluorescencji opóźnionej. [78]
Rys. 2.8. Diagram energetyczny PSII, na którym pokazano stany mające udział w generowaniu DF (delayed fluorescence). Wartości ΔG [mV] oznaczają szacowany poziom energii swobodnej stanów redoks uczestniczących w generacji DF. 3P680 jest prezentowane na diagramie jako tryplet. Wartość ΔG wzbudzonego stanu chlorofilu antenowego (Chl*) jest przyjęty za poziom zerowy. Reakcje 'do przodu' pokazane są za pomocą czarnych strzałek, rekcje wsteczne – czerwonych wykropkowanych linii. Ki oznaczają stałe szybkości transferu elektronów wewnątrz PSII: k1 – stała szybkości początkowej separacji ładunku w singletowym wzbudzonym chlorofilu w centrum reakcji PSII; k2 – stała szybkości transferu elektronu ze zredukowanej feofityny do QA; k3 –stała szybkości transferu elektronu z donoru elektronu Z (nazywany również YZ) do P680+; P680+Pheo- jest pierwszą parą rodników. Stałe szybkości k3 i k5 charakteryzują reakcje
transferu energii na donorowej stronie PSII, k4 - szybkość reakcji na akceptorowej stronie PSII. Liczby zaznaczone na niebiesko oznaczają charakterystyczne czasy odpowiadające różnym przejściom. Na czerwono zaznaczono czasy życia dla reakcji wstecznych. Sn odpowiada stanom redoksowym kompleksu manganowego, na którym zachodzi proces wydzielania tlenu na donorowej stronie PSII [fl4]. Diagram pochodzi z [78].
Zgodnie z hipotezą odwracalnej pary rodników (reversible radical pair – RRP hypothesis [81]) :
istnieje równowaga pomiędzy wzbudzonym stanem pierwszego donoru elektronów w PSII – 1P680* a chlorofilem z kompleksu antenowego PSII - Chl,
para rodników P680+Pheo- może zrekombinować jeśli separacja ładunku nie jest stabilizowana przez szybką reoksydację zredukowanej feofityny przez pierwotny plastochinonowy akceptor elektronów QA.
Kwant opóźnionej fluorescencji emitowany jest ze wzbudzonej cząsteczki chlorofilu z kompleksu antenowego na skutek rekombinacji ładunku i szybkiego transferu energii deekscytacji z 1P680 do chlorofilu antenowego:
1P680*Pheo↔P680+Pheo-.
P680+Pheo- jest jedynym bezpośrednim prekursorem który rekombinując wzbudza Chl w centrum reakcji PSII. Pozostałe stany redox fotosystemu odpowiedzialne są za generację DF: P680+QA-, Z+QA-, Z+QB- i SiZQB, gdzie QB jest wtórnym plastochinonowym akceptorem elektronu. Wszystkie drogi generacji fluorescencji są spowodowane wstecznym transferem elektronu, formowaniem się P680+Pheo- i rekombinacją ładunków między nimi. DF emitowana w czasie mikro- i milisekund jest w większości związana ze wstecznym transferem elektronu i rekombinacją ładunków w P680+QA- i Z+QA-. Gdy DF powstaje na skutek rekombinacji Z+QB- kinetyka zależy od następujących 3 reakcji: reoksydacji zredukowanego QA- przez QB ze stałą szybkości k4, redukcji Z+ (stała: k5) i przejścia ze stanu SiZ+QA- do stanu Si+1ZQA-, oraz rekombinacji ładunku pomiędzy Z+ a QA-(patrz Rys.2.11.). [81]
Fluorescencja „steady-state”
W trakcie pomiaru fluorescencji badana próbka wzbudzana jest ciągłym światłem o wybranej długości fali (zazwyczaj jest to długość fali odpowiadająca maximum absorpcji dla badanej molekuły) i mierzone jest widmo emisyjne. Możliwy jest również pomiar widm ekscytacyjnych odpowiadających wybranej długości fali emisji.
Zmienna fluorescencja indukowana (efekt Kautsky'ego)
Pomiary, które wnoszą istotną informację na temat aktywności fotosyntetycznej badanych próbek opierają się na rejestracji krzywych kinetyk fluorescencji (fluorescence induction kinetics). Z przebiegów krzywych uzyskuje się informacje przy ustalonym protokole pomiarowym. Po raz pierwszy efekt zmian zmian fluorescencji w czasie w zależności od oświetlenia próbki zaobserwował Kautsky i Hirsch w 1960 r. Okryli oni, że po przeniesieniu materiału fotosyntetycznego z ciemności do światła wydajność fluorescencji wzrasta w czasie ok 1 s. [78]
Rys. 2.9. Przykładowe znormalizowane widmo fluorescencji indukowanej zmierzone dla PSII BBY przy użyciu protokołu Kautsky'ego
Wzrost wydajności fluorescencji został wyjaśniony jako konsekwencja całkowitej redukcji akceptorów elektronów: szczególnie plastochinonu i QA. Po wzbudzeniu PSII i uruchomieniu liniowego transferu elektronów chinon w miejscu QA ulega redukcji i nie jest w stanie przyjąć kolejnego elektronu dopóki nie przekaże go na następny akceptor elektronu – chinon w miejscu QB. W tym czasie CR jest 'zamknięte'. Obecność pewnego odsetka zamkniętych CR prowadzi do spadku wydajności reakcji fotosyntetycznych czemu towarzyszy wzrost wydajności fluorescencji.
Krzywa Kautsky'ego ma charakterystyczny przebieg. Dwie szybkie składowe odpowiedzialne są za pojawienie się na krzywej fluorescencji modulowanej plateau, którego amplituda określana jest zwykle jako parametr F0, gdzie F0 = A1 + A2. Znormalizowana wartość F0, jest
ściśle związana z ilością „otwartych” centrów reakcji. Wraz ze wzrostem „zamkniętych” centrów reakcji, czyli wzrostem redukcji akceptorów chinonowych w PSII rośnie F0. W szczególności wzrost amplitudy A1 wynika z akumulacji w centrach reakcji (CR) PSII zredukowanego chinonu QA.-. Wpływ na to może mieć brak odbioru elektronu przez wtórny chinonowy akceptor elektronów QB lub znaczne spowolnienie tego procesu. Natomiast wzrost amplitudy A2 związany jest z rosnącą akumulacją zredukowanego chinonu QB.- w CR PSII. Druga część krzywej fluorescencji modulowanej o amplitudzie Fv=1- F0 jest parametrem charakteryzującym efektywność liniowego transferu elektronów w obrębie PSII. Im większa wartość Fv (mniejsza wartość F0) tym PSII wykazuje większą aktywność fotosyntetyczną, czyli zdolność do liniowego transportu elektronów. Poza efektywnym przekazem elektronów pomiędzy QA i QB jest ona zależna także od wielkości dostępnej, utlenionej puli plastochinonów (PQ) oraz łatwości ich wymiany ze zredukowanym PQH2 w miejscu wiązania QB.
Systemy do pomiaru zmiennej fluorescencji indukowanej
Do rejestracji krzywych kinetyk fluorescencji stosuje się fluorymetry pracujące na zasadzie impulsowej modulacji amplitudy (PAM, pulse amplitude modulation). Promieniowanie indukujące fluorescencję ('measuring light') składa się z krótkich, powtarzanych mikrosekundowych impulsów o niskiej intensywności (amplitudzie), nie wnoszą one znaczącego wkładu do wydajności fluorescencji. Powstający mikrosekundowy sygnał fluorescencji mierzony jest przez detektor (fotodioda), sygnał tła odcinany jest przez impulsowy przedwzmacniacz. [75]
Parametry charakteryzujące fluorescencję
Aby ilościowo określać i badać fluorescencję wprowadzono wielkości takie jak: kwantowa wydajność fluorescencji ΦF definiowana jako stosunek całkowitej liczby
emitowanych fotonów (nF) do całkowitej liczby zaabsorbowanych fotonów nA.
A F F n n , (2.2.1)
ΦF określana jest również przy użyciu stałych szybkości odpowiadających poszczególnym konkurencyjnym procesom: fluorescencji, reakcjom fotochemicznym, rozpraszania energii (ciepło) czy gaszenia fluorescencji przez np. obecność karotenoidów lub tlenu tripletowego). [75]
ΦPSII – wydajność kwantowa PSII -najbardziej użyteczny parametr mierzący
efektywność procesów fotochemicznych fotosystemu II, mierzy stosunek zaabsorbowanego przez chlorofil światła użytego w procesach fotochemicznych. Może być użyty do obliczania czynnika (wskaźnika) linearnego transportu elektronów (J). [76]
qP – stosunek otwartych centrów PSII - wydaje się być podobny do ΦPSII, jednak istnieje różnica: wydajność kwantowa to stosunek zaabsorbowanej energii użytej na procesy fotochemiczne, natomiast qP wskazuje na stosunek otwartych centrów reakcji. 1-qP oznacza stosunek zamkniętych centrów reakcji. Zmiana wartości qP spowodowana jest zamknięciem centrów reakcji spowodowanym nasyceniem procesu fotosyntezy przez światło. qP i ΦPSII mogą zostać wzajemnie powiązane poprzez trzeci parametr: Fv/Fm. [76]
Fv/Fm – maksymalna wydajność kwantowa PSII. Wydajność kwantowa PSII, gdy wszystkie centra reakcji są otwarte. Zmiana tego parametru spowodowana jest zmianą efektywności gaszenia niefotochemicznego. [76]
FV Fm= Fm−F0 Fm = ΦPSII qP , (2.2.2)
Podczas gdy ΦPSII jest związana z osiągniętą efektywnością (wydajnością), qP i Fv/Fm dają informacje o procesach leżących u podstaw, mających wpływ na zmianę tej efektywności (wydajności). Wartość Fv/Fm w adaptacji ciemnościowej odzwierciedla potencjalną wydajność kwantową PSII i jest używana jako czuły indykator wydajności fotosyntetycznej (optymalne wartości dla większości roślin to ok 0.83. Wartości niższe wskazują na ekspozycję na stres. Alternatywne wyrażenie to: Fv/Fo. [75, 76]
Wykorzystanie fluorescencji chlorofilu
Metoda badania fluorescencji chlorofilu a używana jest od ok. 80 lat do badania fotosyntezy, szczególnie fotosystemu typu II (od 1961 r). Pomiary dostarczyły kluczowych informacji dotyczących wielu aspektów absorpcji i konwersji światła w procesie fotosyntezy ze szczególnym uwzględnieniem zrozumienia:
• migracji energii ekscytacji wewnątrz kompleksu antenowego i transferu do centrum reakcji,
• energetycznej synchronizacji pomiędzy kompleksami antenowymi a centrami reakcji, • pierwotnych reakcji fotochemicznych i wtórnego transportu elektronów związanego z
nimi.
Fluorescencja pozwala na badanie struktury i funkcji aparatu fotosyntetycznego. Rozwój technologii do zastosowań polowych umożliwia obecnie prowadzenie pomiarów na zewnątrz. Stąd stosowane są w rolnictwie, ochronie środowiska. Wykorzystuje się je do sprawdzania jakości upraw oraz do kontroli procesu przetwarzania owoców i warzyw. Technika ta jest stosowana nawet do identyfikowania deficytów substancji odżywczych w roślinach. Wiele mierzonych i obliczanych parametrów stanowi wskaźniki informujące np. o różnej tolerancji roślin na czynniki stresowe. Pomiar zmiennej fluorescencji indukowanej jest podstawową techniką stosowaną do monitorowania stresu środowiskowego u roślin na skutek np. zmian klimatycznych, czy zanieczyszczenia środowiska.[75-76, 78] W 2011 roku powstał również 'kosmiczny' fluorymetr, wyprodukowany przez NASA – Space Fluorometer System. Pozwolił on na uzyskanie pierwszej tego rodzaju mapy fluorescencyjnej, dającej nowy obraz roślinności na Ziemi [79].