Mechanizm CRISPR/Cas9

Mechanizm CRISPR/Cas9 został odkryty u bakterii Escherichia Coli (Ishino et al. 1987). Jest to mechanizm, który stanowi system immunologiczny bakterii. Pozwala on na wykorzystanie sygnatury wirusa podczas transkrypcji RNA, w celu uodpornienia się na następne ataki tego samego wirusa. W związku z tym, że CRISPR/Cas9 pozwala na edycję genomu, podjęte zostały również badania, które mają na celu wykorzystanie CRISPR/Cas9, do inżynierii genetycznej (Cong et al. 2013; Wang et al. 2013;

Gaj et al. 2013; Shan et al. 2013; Ran et al. 2013; Hsu et al. 2014; Doudna and Charpentier 2014; Oust-erout et al. 2015).

W mechanizmie CRISPR/Cas9, stosowany jest enzym Cas9, do wykonywania cięć łańcucha DNA.

Istnieją alternatywne mechanizmy, które stosują inne enzymy, na przykład CRISPR/Cpf1. W tym pod-rozdziale przedstawione będą jedynie informacje na temat CRISPR/Cas9, ponieważ badania, które były prowadzone nad zamodelowaniem tego mechanizmu dotyczyły metody korzystającej z enzymu Cas9.

W związku z tym, że zastosowanie mechanizmu CRISPR/Cas9 jest istotnym obszarem badaw-czym w ostatnich latach, prace dotyczące go zostały również uwzględnione podczas badań związanych z niniejszym doktoratem.

W środowisku naturalnym mechanizm CRISPR jest wykorzystywany u bakterii jako mechanizm immunologiczny. Kiedy bakteria zostaje zaatakowana przez wirusa w pierwszym kroku odpowiedzi im-munologicznej następuje próba przechwycenia materiału DNA wirusa. Pozwala to na sprawne wykry-cie podobnych sekwencji w przyszłości w celu ich zniszczenia za pomocą nukleaz.

2.4.1 Sposób wykorzystania przez biologów

CRISPR/Cas9 jest mechanizmem, który może być wykorzystany do edycji genomu. Istnieje sze-reg kroków i uwarunkowań, które podczas realizacji tego procesu muszą zostać spełnione. Rysunek 9 przedstawia schemat mechanizmu CRISPR/Cas9.

Pierwszym krokiem w realizacji procesu jest wybór sekwencji DNA, która ma zostać zmodyfi-kowana. Popularnym sposobem wykorzystania CRISPR/Cas9 jest naprawa sekwencji DNA, w której wy-stępuje uszkodzenie obu nici, czyli tak zwany DSB (ang. Double Strand Break). Dwuniciowe pęknięcia przeważnie naprawiane są poprzez niehomologiczne łączenie końców. DSB jest to niebezpieczny pro-ces, który może doprowadzić do mutacji typu indel lub zmiany pierwotnej sekwencji nukleotydów.

Taka sytuacja może doprowadzić do przesunięcia ramki odczytu i pojawienia się PSC (ang. Premature Stop Codon), czyli przedwczesnych kodonów STOP. Taka sytuacja może prowadzić do nie powstawania funkcjonalnego białka. Istotne zatem jest skuteczne i poprawne wykrycie DSB.

Aby wykryć powstanie DSB w wybranym miejscu z wykorzystaniem mechanizmu CRISPR/Cas9, należy wprowadzić do komórki której genom jest modyfikowany enzym Cas9 i sgRNA. Część sgRNA jest odpowiedzialna za poprawne rozpoznanie fragmentu DNA, które uległo zniszczeniu, enzym Cas9 ma z kolei za zadanie dokonać cięcia sekwencji DNA (Czarnek and Bereta 2016).

Hydroliza DNA z wykorzystaniem Cas9 wymaga obecności motywu PAM (ang. Protospacer ad-jacent motif), który znajduje się za sekwencją DNA, która jest celem cięcia. Sekwencja, która jest celem musi być identyczna z sgRNA (Czarnek and Bereta 2016).

Istnieją jednak przypadki, w których chcemy dokonać podmiany genu, dzięki czemu w miejsce zmutowanego możliwe jest wstawienie genu w postaci poprawnej. W takiej sytuacji mechanizm CRI-SPR/Cas9 może zostać również wykorzystany. Jeżeli stosowany jest mechanizm naprawy poprzez

re-kombinację homologiczną, niezbędne jest wprowadzenie do komórki matrycy, która zawiera po-prawną wersję genu. W takiej sytuacji poprzez mechanizm CRISPR/Cas9 do genu łącznie wprowadzane są sgRNA, który odpowiada za wykrycie odpowiedniej sekwencji, enzym Cas9, który odpowiada za wy-konanie prawidłowego cięcia, a także matryca zawierająca poprawną wersję genu. Najczęściej w takich sytuacjach stosowane jest plazmidowe DNA lub fragmenty jednoniciowego DNA (ssDNA). Stosowanie ssDNA jako matrycy donorowej mimo mniejszej długości ramion homologii może by większa, niż wy-dajność, którą można uzyskać poprzez plazmidowe DNA.

Rysunek 9. Schemat mechanizmu CRISPR/Cas9. Diagram opracowany przez autora pracy.

Wykorzystanie mechanizmu CRISPR/Cas9 nie jest jednakże ograniczone wyłącznie do naprawy mutacji genów. Istnieje szereg zastosowań i sporo badań, które mają na celu weryfikowanie w jakim zakresie możliwe jest wykorzystanie technologii, która jest nadal na bardzo wczesnym etapie rozwoju i nadal niesie za sobą duże nadzieje. Jednym z pomysłów zastosowania mechanizmu CRISPR/Cas9 jest inaktywacja genu CCR5 (Xu et al. 2017, p. 5). Gen ten jest celem terapii związanych z leczeniem wirusa HIV. Jest to spowodowane tym, że ten receptor jest wykorzystywany do zarażania limfocytów T przez wirusa HIV. Istnieją znane sposoby na wyłączenie CCR5, na przykład z wykorzystaniem nukleazy Zinc finger (Holt et al. 2010) i TALEN (Mock et al. 2015). Zastosowanie enzymu Cas9 wraz z mechanizmem CRISPR/Cas9 niesie jednak za sobą nadzieje na zaprojektowanie terapii, która będzie mieć znacznie większą skuteczność w leczeniu wirusa HIV.

Opisany mechanizm swoje podstawowe zastosowanie ma w obszarze inżynierii genetycznej.

Możliwe pokłosia takich zmian rozszerzają zastosowanie mechanizmu na zdecydowanie szersze ob-szary zastosowań. W podrozdziale tym opisany został mechanizm, który jest odpowiedzialny za zmiany, które mogą zachodzić, a także wprowadzone pewne możliwości, które w związku z charakterem

chanizmu są osiągalne. Kolejny podrozdział przedstawia w szerszym ujęciu spektrum zastosowań me-chanizmu CRISPR/Cas9 zarówno na poziomie eksperymentów laboratoryjnych, jak i realnych możliwo-ści, które są już stosowane.

2.4.2 Zastosowania mechanizmu CRISPR/Cas9

Mechanizm CRISPR/Cas9 pozwala na edytowanie genu (Bakondi et al. 2016) (Ousterout et al.

2015). Jest to potężna możliwość w kontekście rozwiązywania licznych problemów zdrowotnych.

Wszelkie badania są jednakże na ten moment na bardzo wczesnych etapach, głównie laboratoryjnych.

Większość sukcesów dotyczy skutecznego zastosowania mechanizmu u zwierząt. W związku z tym, że badania, które są prowadzone na ten moment dają duże możliwości pierwsza podsekcja w tym pod-rozdziale opisze przykładowe sukcesy na poziomie laboratoryjnym. W drugiej podsekcji tego podroz-działu opisane zostaną przykłady skutecznych zastosowań leczniczych CRISPR/Cas9.

Sukcesy, które są związane z praktycznym zastosowaniem CRISPR/Cas9 nadal są liczbowo nie-wielkie, ale jest to w dużej mierze związane z tym, że metoda jest nowa i nadal większość prac prowa-dzonych jest na poziomie laboratoryjnym. Istnieje jednak kilka przykładów sukcesów związanych ze stosowaniem metody CRISPR/Cas9.

W 2013 udało się wyłączyć jednocześnie pięć różnych genów u myszy ze skutecznością 80%

(Wang et al. 2013). W połowie 2015 roku w związku z walką z problemem malarii udało się zmodyfiko-wać DNA komara w taki sposób, że w każdym kolejnym pokoleniu rodziły się wyłącznie samice. Celem było całkowite wyeliminowanie gatunków komarów roznoszących malarię (Hammond et al. 2016). W 2017 roku przy użyciu metody CRISPR/Cas9 udało się otrzymać bakterie, które miały materiał gene-tyczny zaprojektowany przez naukowców, a nie skopiowany z istniejącego organizmu (Zhang et al.

2017). Kolejny przypadek sukcesu laboratoryjnego jest związany z leczeniem osobników z uszkodzo-nym genem dystrofiny. U myszy z taką przypadłością udało się wyleczyć 62% komórek mięśniowych (Ousterout et al. 2015). Innym przykładem zastosowania metody było zwalczanie mutacji genu, która prowadziła do dystrofii siatkówki. Zastosowanie metody CRISPR/Cas9 u szczurów przyniosło poprawę (Bakondi et al. 2016). Badania, w tym obszarze obok badań związanych z nowotworami rodzą duże nadzieje, na możliwe rozwinięcie technik leczenia chorób związanych z upośledzeniem genów, co po-zwoli na zwalczanie chorób, które do tej pory były uznawane za niewyleczalne.

W 2013 roku udało się zmodyfikować DNA roślin uprawnych (Shan et al. 2013). Metoda zatem wpisała się w szerokie spektrum możliwości inżynierii genetycznej, dzięki której może nastąpić po-prawa nie tylko wydajności związanej z rolnictwem, ale także odporności płodów rolnych na choroby, które są dla nich zagrożeniem.

Na początku 2016 roku po raz pierwszy dokonano próby wykorzystania metody CRISPR/Cas9 na ludzkich embrionach w związku z prowadzonym leczeniem raka płuc (Cyranoski 2016). Jest to jedna z najbardziej oczekiwanych ścieżek rozwoju mechanizmu, który może w przyszłości być stosowany jako skuteczny sposób na rozwiązywanie problemu chorób związanych z mutacjami genów. Innym przypad-kiem, który również wpisuje się w tą ścieżkę badawczą jest przypadek z 2015 roku, kiedy udało się dokonać modyfikacji ludzkich komórek pierwotnych (Hendel et al. 2015). Z drugiej strony metoda CRI-SPR/Cas9 jest jedną z budzących największe kontrowersje bioetyczne.