Wirusy

Wirus jest agentem biologicznym, który reprodukuje się wewnątrz komórek żywych organi-zmów. Infekcje wirusowe mogą dotykać wszystkich form żywych, wliczając bakterie (Koonin et al.

2006). Jedną z cech charakterystycznych wirusa jest bezkomórkowość. Oznacza to, że nie składają się z komórek, w związku z czym nie mogą się reprodukować przez podział. Zamiast tego, wykorzystują one metabolizm komórki gospodarza do własnych celów reprodukcyjnych. Znajdując się wewnątrz ko-mórki gospodarza tworzą wiele kopii samych siebie.

Wirus w ogólnej postaci ma prostą budowę. Rysunek 4 przedstawia poglądowy szkic budowy wirusa. Z zewnątrz widoczna jest zewnętrzna otoczka wirusa, która składa się z białka, które na Rysunku 4 oznaczone jest szarym kolorem, a także struktur lipidowych, które przedstawione są za pomocą ko-loru fioletowego. Pod zewnętrzną otoczką wirusa znajduje się otoczka rdzenia. Oznaczona jest ona

genetyczna wirusa. Niektóre wirusy przechowują informacje za pomocą DNA. Inne wirusy przechowują informacje w RNA. Elementy oznaczone na Rysunku 4 kolorem żółto-zielonym oznaczają zatem łańcuch RNA lub DNA w zależności od typu wirusa.

Rysunek 4. Budowa wirusa. Źródło: http://www.animalresearch.info/fr/avancees-medicales/prix-no-bel/the-role-of-hpv-and-hiv-causing-disease/

Cykl życia wirusa składa się z sześciu podstawowych faz. Po pierwsze jest to adsorpcja. Proces ten polega na powiązaniu białek kapsułki wirusa z powierzchnią komórki gospodarza. Kolejnym kro-kiem jest penetracja komórki. Dochodzi do niej w efekcie działania wirionów, czyli pojedynczych i kom-pletnych cząstek wirusa, które zdolne są do przetrwania poza komórką. Wiriony wnikają do komórki gospodarza poprzez endocytozę, fuzję lub wiropeksję. Kolejny krok to odpłaszczenie, czyli uwolnienie materiału genetycznego wirusa. Następnie następuje replikacja wirusa. Obejmuje ona głównie zwielo-krotnienie genomu. W kolejnym kroku zachodzi proces składowania wirionów, podczas którego do-chodzi do wytworzenia nukleokapsydów. Ostatnim krokiem jest uwalnianie wirionów z komórki. Pro-ces ten następuje poprzez lizę, czyli proPro-ces który prowadzi do zniszczenia komórki gospodarza poprzez dezintegrację błony komórkowej. Rysunek 5 przedstawia schemat replikacji wirusa w komórce.

Rysunek 5. Schemat replikacji wirusa w komórce.

Istotne jest, że budowa zewnętrzna jak i wewnętrzna wirusa jest zależna od typu wirusa i w przypadku różnych typów wirusów może przybierać ona różną postać. W podrozdziale tym przedsta-wiony jest schemat uogólniony, którego rolą jest zwizualizowanie poszczególnych elementów struk-tury wirusa odpowiadających za konkretne funkcje związane z cyklem życiem wirusa, a także z infek-cjami wirusowymi.

Do Infekcji wirusowej dochodzi, gdy zakaźne cząsteczki wirusa przyłączają się i penetrują po-datne na to komórki. Jest to kluczowy moment, ponieważ od niego może rozpocząć się rozprzestrze-nianie się wirusa. Poziom i tempo rozprzestrzeniania się zależy zarówno od możliwości zakaźnych wi-rusa, miejsca, w którym miało początek rozprzestrzenianie się, jak i stanu zdrowia organizmu zainfeko-wanego.

Infekcje atakują różne typy organizmów żywych włączając w to między innymi zwierzęta, ro-śliny, czy nawet bakterie. Mogą dotykać całych organizmów lub specyficznych typów komórek, do pe-netracji których są przystosowane biologicznie. Przykładowo infekcja wirusa HCV skupia się na hepa-tocytach, czyli komórkach wątroby, do których penetracji zdolne są wiriony wirusa HCV. Możliwości zwalczania wirusa są oparte na odpowiedzi immunologicznej, czyli na potencjale do odpierania pene-tracji komórek zdrowych przez wiriony. W przypadku wirusa HIV przebieg infekcji składa się z trzech faz (Hernandez-Vargas and Middleton 2013). Na początku występują objawy ostrej infekcji. W fazie tej wirus atakuje i niszczy komórki CD4 odpowiadające za odporność. Następnie przychodzi okres bezob-jawowy, który trwać może nawet 10 lat. Jest to okres, w którym wirus rozmnaża się w organizmie.

Ostatnia faza, to faza AIDS. W fazie tej organizm ma uszkodzony układ odpornościowy na skutej działań

Rysunek 6 przestawia przykładowy wykres symulacji przebiegu infekcji wirusa HCV. Symulacja uwzględniała trzy rodzaje komórek. Były to niezainfekowane hepatocyty, zainfekowane hepatocyty i wiriony. W pierwszej fazie przebiegu symulacji następuje gwałtowny spadek liczby wirionów, co jest związane z odpowiedzią immunologiczną organizmu. Następnie następuje powolny spadek liczby za-infekowanych hepatocytów i wirionów. Po dziesięciu dniach na skutek wyniszczania wirionów i zainfe-kowanych hepatocytów niezainfekowane hepatocyty zaczynają się rozmnażać w znaczącym tempie. W ostatniej fazie symulacji system się stabilizuje.

Rysunek 6. Wykres przebiegu symulacji infekcji wirusa HCV wykonany w ramach prowadzonych prac.

Obecnie istnieje olbrzymia liczba typów aktywnych wirusów. Dla samego wirusa HCV istnieje sześć głównych genotypów oraz ponad 80 podtypów na całym świecie (Wasik et al. 2014). Rodzi to zatem różnego rodzaju problemy związane z interpretacją wyników. Jednocześnie daje duże możliwo-ści badawcze w ramach tego samego wirusa. W związku z tym prace badawcze, które zostały opisane w tej rozprawie skupione zostały wyłącznie na wykorzystaniu przykładów infekcji wirusów HCV i HIV.

2.3 Bakterie

Temat bakterii stał się istotny z punktu widzenia prowadzonych badań poprzez uwzględnienie w nich analizy mechanizmu CRISPR/Cas9. Podstawy teoretyczne związane z mechanizmem CRI-SPR/Cas9 są omówione w podrozdziale 2.4, natomiast w tym podrozdziale przedstawione zostały pod-stawowe informacje dotyczące budowy i funkcjonowania bakterii.

2.3.1 Cykl życia populacji bakterii

Cykl życia populacji bakterii składa się z kilku faz (Kunicki-Goldfinger 1982). Pierwszą fazą roz-woju kultury bakteryjnej jest faza zastoju. Jest ona okresem, kiedy następuje adaptacja do nowego środowiska. Po fazie zastoju następuje faza młodości fizjologicznej. Jest to faza, kiedy rozpoczyna się powolny wzrost liczby komórek bakterii. Następnie następuje faza wzrostu wykładniczego. Jest to okres wzmożonego i najbardziej intensywnego wzrostu. Następuje on pod wpływem optymalnego przystosowania do podłoża i dostępności zasobów pozwalających na rozwój. Kolejną fazą jest faza sta-cjonarna. W pierwszej kolejności w fazie stacjonarnej tempo wzrostu spada, w stosunku do fazy wzro-stu wykładniczego. Następnie następuje faza równowagi, w której liczba żywych bakterii nie zmienia się. Ostatnim etapem jest faza zamierania, kiedy liczba żywych komórek spada. Rysunek 7 przedstawia poglądowy wykres przedstawiający cykl życia populacji bakterii.

Rysunek 7. Poglądowy wykres cyklu życia populacji bakterii w środowisku o ograniczonej pojemności.

2.3.2 Budowa bakterii

Bakteria ma strukturę komórkową. W przeciwieństwie do komórek eukariotycznych nie po-siada jądra komórkowego. Zamiast niego wewnątrz bakterii znajduje się genofor i plazmidy. Z zewnątrz bakteria jest otoczona otoczką bakteryjną. Otoczka pełni funkcję szkieletową. Pod otoczką znajduje się ściana komórkowa, która pełni funkcję ochronną. Wewnątrz ściany komórkowej znajduje się błona ko-mórkowa, która ma za zadanie oddzielenie wnętrza komórki od struktur zewnętrznych. Jest to półprze-puszczalna błona biologiczna. Pełni przy tym wiele ról na przykład związanych z regulacją transportu substancji pomiędzy komórką i światem zewnętrznym. Wewnątrz błony komórkowej znajduje się cy-toplazma. W cytoplazmie znajdują się rybosomy i plazmidy. Z zewnątrz oprócz otoczki obserwowalne są rzęski i wici. Rysunek 8 przedstawia wygenerowany komputerowo obraz bakterii –pałeczki ropy błę-kitnej.

Rysunek 8. Wygenerowany komputerowo trójwymiarowy obraz pałeczki ropy błękitnej. Źródło:

https://news.umanitoba.ca/new-weapon-in-fight-against-antibiotic-resistance-discovered/, autor:

James Archer.

Kształt bakterii jest zróżnicowany. Pierwszą grupą bakterii, są bakterie o kształcie pałeczkowa-tym. Należą do nich pałeczki, laseczki, maczugowce i prątki. Kolejną grupą kształtów są bakterie o kształcie kulistym. Należą do nich ziarenkowce, gronkowce, paciorkowce, dwoinki i pakietowce. Trzecią grupą bakterii w podziale na kształt są bakterie o kształcie spiralnym. Należą do nich śrubowce, prze-cinkowce i krętki.

Istnieje również klasyfikacja bakterii, rozróżniająca bakterie ze względu na barwienie. Jedną z technik barwienia bakterii jest metoda Grama. Pod wpływem stosowania tej techniki bakterie przybie-rają różne kolory. Kolor ciemnofioletowy oznacza bakterie, które określone są jako Gram-dodatnie.

Bakterie, które pod wpływem etanolu odbarwiają się na kolory różowe określane są jako Gram-ujemne. Istnieją też bakterie, które nie barwią się standardową metodą Grama. Ponadto wyróżniamy grupę bakterii, które oznaczone są jako Gram-Zmienne. Bakterie Gram-dodatnie charakteryzują się

grubszą ścianą i brakiem zewnętrznej błony komórkowej. Metoda Grama jest często stosowana jako wstępna metoda diagnostyczna, która pozwala na określenie czy w próbce klinicznej znajduje się duża ilość bakterii (Madigan et al. 2018).

2.3.3 Współżycie z innymi organizmami

Bakterie żyją wraz z innymi organizmami w relacjach, które można podzielić na trzy główne typy. Po pierwsze jest to symbioza. Polega ona na czerpaniu obustronnych korzyści przez organizmy, które biorą w niej udział. Przykładem symbiozy może być stosunek bakterii beztlenowych i archeonów.

Bakterie beztlenowe potrzebują kwasów organicznych, po otrzymaniu których produkują wodór. Ar-cheony metanogenowe z kolei potrzebują wodoru, który jest produkowany przez bakterie.

Drugi typ stosunków określany jest jako pasożytnictwo. Jednym z objawów pasożytnictwa ze strony bakterii może być patogenność. Występuje ona w momencie, kiedy bakterie szkodzą innym or-ganizmom, na przykład poprzez wywoływanie u nich chorób. Przykładowo wśród ludzi istnieje duża liczba chorób, które są wywoływane przez bakterie, do których zaliczyć można na przykład trąd, cho-lerę, dżumę czy gruźlicę. Istotny jest również fakt, że nie każda bakteria patogenna powoduje natych-miastowe zachorowanie. Istnieją przykłady bakterii, które mogą występować u ludzi, ale ich obecność nie skutkuje natychmiastową chorobą. Przykładem takiej bakterii jest Hp (łac. Helicobacter pylori) (Su-erbaum and Michetti 2002). Ponadto istnieją bakterie, które znajdują się w jelicie, składając się na jego florę, jednocześnie będąc bakteriami, które mogą wywoływać infekcje. Istnieje również mnóstwo bak-terii, które powodują choroby bakteryjne wśród roślin, na przykład Zarazę ogniową, która jest spowo-dowana bakterią Erwinia amylovora (Gill et al. 2003).

Istnieje również trzeci stosunek międzygatunkowy z udziałem bakterii, czyli komensalizm. Po-lega on na czerpaniu korzyści ze strony jednego z uczestników, przy stosunku obojętnym drugiego z nich. Przykładem takiej sytuacji może być występowanie gronkowca złocistego w organizmie czło-wieka. W wielu przypadkach jego obecność prowadzi do stanów patogennych, w których powinien być zaliczany do pasożytów, jednakże jego obecność często nie powoduje stanów chorobowych, a zatem czerpane są korzyści przez bakterię przy obojętnym stosunku do tych interakcji ze strony organizmu.

2.3.4 Ochrona genomu

Bakterie, podobnie jak inne organizmy komórkowe są podatne na ataki ze strony wirusów. Atak zgodnie z mechanizmami funkcjonowania wirusa polega na wprowadzaniu własnego materiału gene-tycznego. Bakterie w związku z tym wypracowały własny system odporności, który pozwala bronić się przed zainfekowaniem. Polega on na degradowaniu obcego DNA i rozbijaniu go na pojedyncze nukle-otydy. System wykorzystuje także mechanizm CRISPR, dzięki któremu może zapamiętywać cechy szcze-gólne DNA, które należało do infekującego organizmu, aby w przyszłości móc skuteczniej bronić się przed infekcją (Bhaya et al. 2011). CRISPR jest w związku z tym bardzo istotnym mechanizmem w funk-cjonowaniu bakterii, ponieważ w oparciu o niego bakteria potrafi budować odporność na infekcje wi-rusowe. Opisanie CRISPR okazało się bardzo istotnym odkryciem badawczym, nie tylko ze względu na zrozumienie, w jaki sposób działa system immunologiczny bakterii, ale dlatego, że płynące z niego moż-liwości związane z modyfikacją sekwencji DNA otworzyły nowe możmoż-liwości związane z inżynierią gene-tyczną.

Szczegóły opisujące metodę CRISPR/Cas9, która opiera się na mechanizmie odkrytym u bakterii opisane zostały w podrozdziale 2.4.