Medycyna Wet. 2007, 63 (3) 336
Praca oryginalna Original paper
Bacillus cereus jest jednym z wa¿niejszych gatunków bakterii przetrwalnikuj¹cych obecnych w mleku suro-wym, a tak¿e rodowisku jego pozyskiwania (3, 4). Drob-noustrój ten uwa¿a siê za jeden z najbardziej szkodli-wych zw³aszcza w mleku spo¿ywczym pasteryzowanym, gdy¿ mo¿e wywo³ywaæ zatrucia pokarmowe wskutek wytwarzania enterotoksyn, a tak¿e powodowaæ ró¿ne wady produktów mleczarskich. W warunkach krajowych dotychczas nie prowadzono szerszych badañ nad cha-rakterystyk¹ szczepów Bacillus cereus pochodz¹cych ze rodowiska oraz z surowców przemys³u spo¿ywczego. W zwi¹zku z tym za cel niniejszych badañ przyjêto okre-lenie wybranych cech biochemicznych i fizjologicznych ró¿nych szczepów B. cereus wyizolowanych z mleka surowego oraz rodowiska jego pozyskiwania.
Materia³ i metody
Badania przeprowadzono na 691 szczepach Bacillus ce-reus wyizolowanych z mleka surowego oraz rodowiska jego pozyskiwania, w dwóch etapach. Liczbê szczepów badanych w obu etapach oraz ród³o ich pochodzenia zamieszczono w tab. 1. W etapie I u wszystkich 691 szczepów B. cereus
okrelono: zdolnoæ fermentowania D-glukozy w warunkach wzglêdnie beztlenowych, wytwarzania acetylometylokarbinolu (acetoiny) (reakcja Voges-Proskauera), redukowania azotanów do azotynów (19), wytwarzania kwasu z D-ksylozy,
L-arabi-Charakterystyka szczepów Bacillus cereus
wyizolowanych z mleka surowego
i rodowiska jego pozyskiwania*
)
ANNA BERTHOLD, ANTONI PLUTA, IRENA MOLSKA
Zak³ad Biotechnologii Mleka Katedry Biotechnologii, Mikrobiologii i Oceny ¯ywnoci Wydzia³u Technologii ¯ywnoci SGGW, ul. Nowoursynowska 159c, 02-787 Warszawa
Berthold A., Pluta A., Molska I.
Characteristics of the Bacillus cereus strains isolated from raw milk and the environment of milk production
Summary
The aim of this study was to identify certain biochemical features in 691 B. cereus strains isolated from raw milk and the environment of milk production. At the first stage of the study the following abilities were observed in all the examined strains: the fermentation of D-glucose in facultative anaerobic conditions, the production of acetylmethylcarbinol (Voges-Proskauer reaction), the reduction of nitrates to nitrites, the production of acid from D-xylose, L-arabinose, D-mannitol and galactose, the hydrolysis of casein, gelatine and tributyrin and the ability of haemolysis. At the second stage, 142 chosen strains were subject to a detailed analysis of biochemical features with the application of API 50CH and API 20E tests (BioMerieux Polska Sp. z o.o.).
The study confirmed the occurrence of the typical features for B. cereus as specified in Bergeys taxonomy in all the examined strains: i.e. the ability of gelatine and casein hydrolysis, the fermentation of D-glucose, the production of acetoine, the reduction of nitrates to nitrites, and the lack of the ability of D-xylose and L-arabinose fermentation. 27% of the examined strains had an ability of lactose fermentation, which is untypical for B. cereus. 72% of the strains had the ability of tributyrin hydrolysis.
Keywords: Bacillus cereus, milk
*) Badania wykonano w ramach grantu KBN 6 PO6G 03620.
o k s i w o d o r Liczbabadanychszczepów I p a t E Etap II e w o r u s o k e l M 152 28 ³ a K 221 40 e z s a P 171 19 a k ³ ó i c 126 14 w ó k y z rt s a i n h c z r e i w o P 142 27 h c y w o j o d u w ó k b u k a i n h c z r e i w o P 138 17 a w a r T 119 14 a b e l G 129 15 j e w o j o d u il a h e z rt e i w o P 128 14 n o i m y w a i c y m o d a d o W 125 14 m e z a R 691 1421
Medycyna Wet. 2007, 63 (3) 337 nozy, D-mannitolu i galaktozy
(2), zdolnoæ hydrolizy kazeiny, ¿elatyny (5) i tributyryny oraz zdolnoæ hemolizy.
Zdolnoæ szczepów do hydro-lizy tributyryny okrelono na po¿ywce Tributyrin Agar Base firmy Merck (nr kat. 1.01957). Badane szczepy posiewano ry-sowo ez¹ na podsuszon¹ po¿yw-kê w p³ytkach Petriego i inkubo-wano w temperaturze 30°C ± 1°C przez 3 dni. Po tym czasie kolonie szczepów wykazuj¹cych zdolnoæ do hydrolizy tributyry-ny otoczone by³y przezroczyst¹ stref¹.
W³aciwoci hemolityczne szczepów badano stosuj¹c goto-we p³ytki z pod³o¿em Columbia z dodatkiem 5% krwi baraniej firmy Argenta Sp z o.o. (nr kat. PB 5039A). Szczepy B. cereus posiewano rysowo ez¹ na po-wierzchniê po¿ywki i inkubowa-no w temperaturze 30°C przez 24-48 godzin. Wyst¹pienie kla-rownych przejrzystych stref wo-kó³ wzrostu wiadczy³o o w³a-ciwociach hemolitycznych. Jako wynik negatywny przyjêto brak strefy hemolizy po 48 go-dzinach inkubacji.
W etapie II przeprowadzono szczegó³owe badania cech bio-chemicznych z zastosowaniem testów API 50CH i API 20E (BioMerieux Polska Sp. z o.o.) oraz okrelono miano hemolizyn u wybranych 142 szczepów sporód 691 badanych szczepów zestawionych w tab. 1. Do dru-giego etapu badañ wybrano szczepy w sposób losowy tak,
aby w etapie II znalaz³o siê co najmniej 20% szczepów z ka¿-dego badanego rodowiska, ale nie mniej ni¿ 4 szczepy. Ba-dania przeprowadzono cile wed³ug instrukcji producenta testów API 50CH i API 20E.
Do okrelenia miana hemolizyn zastosowano metodê opra-cowan¹ dla celów niniejszych badañ. Do 25 cm3 bulionu
mózgowo-sercowego firmy Merck (BHI, nr kat. 1.10493) w kolbach Erlenmayera przenoszono ez¹ niewielk¹ iloæ ma-teria³u 24-godzinnej hodowli wybranych szczepów. Kolby z zaszczepionym bulionem inkubowano w ³ani wodnej w tem-peraturze 32-35°C przez 16-18 godzin przy ci¹g³ym wstrz¹-saniu (250 obr./min.). Nastêpnie hodowle przes¹czano przez s¹czki mikrobiologiczne (Minisart, Æ 0,22 µm, Sartopol, nr kat. SM17597K), a z otrzymanego bezkomórkowego prze-s¹czu sporz¹dzano szereg dwukrotnych rozcieñczeñ w roz-tworze fizjologicznym. Z ka¿dej probówki z przes¹czem nie-rozcieñczonym lub nie-rozcieñczonym przenoszono po 0,1 cm3
do kolejnych ja³owych 7 metalowych cylinderków (Æ 7 mm) umieszczonych na powierzchni po¿ywki z agarem Columbia z 5% dodatkiem krwi baraniej (Argenta Sp. z o.o., nr kat. PB 5039A). P³ytki inkubowano w temperaturze 30°C, a wyniki odczytywano po 24 i 48 godzinach inkubacji. Klarowne
stre-fy wokó³ lub pod cylinderkami wiadczy³y o hydrolizie ery-trocytów. Najwiêksze rozcieñczenie filtratu z hodowli, powo-duj¹ce hydrolizê uznano za miano hemolizyn.
Wyniki i omówienie
Wybrane najwa¿niejsze wyniki przeprowadzonych badañ przedstawiono w tab. 2 i 3, które z pozosta³ymi omówiono w skrócie bezporednio w tekcie.
Przeprowadzone badania wykaza³y wystêpowanie w mleku i rodowisku szczepów B. cereus o cechach typowych dla tego gatunku, ale tak¿e w pewnym stop-niu zró¿nicowanych, co charakteryzuje równie¿ inne drobnoustroje.
Wszystkie szczepy badane w etapie I fermentowa³y glukozê, wytwarza³y acetylometylokarbinol (dodatnia reakcja w tecie Voges-Proskauera) i redukowa³y azota-ny do azotynów lub wolnego azotu i na tej podstawie zosta³y zaliczone do B. cereus (19). Cechy, takie jak zdol-noæ do tworzenia kwasu z glukozy (fermentacja), a brak tej zdolnoci w stosunku do ksylozy, L-arabinozy i
D-k e z ¹ i w z y n a d a B y p e z c z S e n a d a b j e z s j e i n i n w y c a r p * B H C 0 5 I P A Bergey's l a u n a M ) 2 ( n a g o L y e l e k r e B i ) 1 1 ( y m a s a g n a R . p s w i ) 3 1 ( l e ff i G . p s w i ) 9 ( s u e r e c . B 1 B.ce2reus k e z ¹ i w z y n a d h c y c ¹ j u t n e m r e f w ó p e z c z s % l o r e c il G 127 144 168 >90 192 b.d. 100 a z o b y R 182 198 193 b.d. 197 192 100 a z o t k a l a G 114 127 121 b.d. 126 123 122 a z o k u l g -D 100 100 100 >90 100 100 100 a z o t k u rf -D 199 199 100 b.d. 198 100 199 a z o n n a m -D 149 123 121 b.d. 120 146 124 l o t y z o n I 120 121 120 <10 124 120 124 a-metylo-D-glukozyd 121 121 120 b.d. 122 120 122 a n i m a o z o k u l g -o l y t e c a -N 199 196 100 b.d. 199 100 100 a n il a d g i m A 118 121 131 b.d. 128 119 140 a n y t u b r A 191 180 185 b.d. 191 192 100 a n il u k s E 100 185 193 >90 100 100 100 a n y c il a S 193 165 168 11-89 187 192 198 a z o i b o l e C 158 156 162 b.d. 184 127 196 a z o tl a M 100 100 100 >90 198 100 100 a z o t k a L 127 125 120 <10 128 115 121 a z o r a h c a S 137 158 156 >90 147 150 121 a z o l a h e r T 100 100 193 >90 198 100 100 a i b o r k S 145 100 120 >90 196 189 198 n e g o k il G 147 196 120 b.d. 192 189 100 b-genitobioza 125 123 121 b.d. 118 120 123 a z o n a r u T 120 123 114 b.d. 115 120 120 n a i n o k u l G 112 133 162 b.d. 129 120 171
Tab. 2. Wybrane cechy biochemiczne szczepów B. cereus okrelone w II etapie metod¹ API 50CH
Objanienia: * dane wed³ug API 50 CHB (Materia³y BioMerieux Polska Sp. z o.o. 2001); b.d. brak danych
Medycyna Wet. 2007, 63 (3) 338
-mannitolu u ponad 99% szczepów oraz zdolnoæ do hyd-rolizy kazeiny, ¿elatyny i do hemolizy u wszystkich ba-danych szczepów s¹ zgodne z opisem gatunku B. cereus w Bergeys Manual (2). W wymienionym podrêczniku brak jest danych, odnonie do uzdolnieñ B. cereus do fermentacji galaktozy. Cechê tê okrelono w niniejszych badaniach i wykazano jej brak u oko³o 99% szczepów.
Stwierdzono, ¿e 59% szczepów B. cereus hydrolizo-wa³o tributyrynê. W Bergeys Manual (2) oraz w ró¿-nych publikacjach dotycz¹cych charakterystyki B. cereus cecha ta nie jest wymieniona i w niniejszych badaniach okrelono j¹ po raz pierwszy.
W II etapie badañ okrelono cechy biochemiczne u wybranych 142 szczepów B. cereus przy u¿yciu meto-dy API 50CH i API 20E oraz miano hemolizyn. Wybra-ne wyniki oznaczeñ oraz dla porównania wyniki uzys-kane przez innych autorów zamieszczono w tab. 2.
Sporód badanych szczepów wszystkie fermentowa-³y D-glukozê, maltozê i trehalozê oraz rozk³adafermentowa-³y esku-linê. Ponad 99% szczepów fermentowa³o D-fruktozê, N-acetyloglukozoaminê, ponad 90% arbutynê i sali-cynê, ponad 80% rybozê, 58% celobiozê. Wyniki te wykazuj¹ du¿¹ zgodnoæ z danymi pimiennictwa (2, 8, 10, 16).
Niektóre zwi¹zki by³y fermentowane przez mniej ni¿ 50% badanych szczepów, np. D-mannoza przez 49%, gli-kogen przez 47%, sacharoza 37%, amigdalina 18%, galaktoza 14%, glukonian 12% i glicerol 7%. Dane dotycz¹ce zdolnoci do fermentacji galaktozy, glicero-lu, sacharozy i glukonianu otrzymane przez ró¿nych au-torów i przedstawione w tab. 2 wskazuj¹ na znaczne roz-bie¿noci w tym zakresie, i nale¿y s¹dziæ, ¿e nie s¹ to cechy charakterystyczne dla B. cereus.
Omówienia wymagaj¹ wyniki dotycz¹-ce skrobi. Uzdolnienia do hydrolizy skro-bi wykazywa³o tylko 48% badanych szczepów. Wynik ten nie jest w pe³ni zgodny z danymi pimiennictwa (1, 2, 8, 10, 13, 16), wed³ug których skrobia by³a hydrolizowana przez co najmniej 90% szczepów. Uzdolnienia do hydrolizy skro-bi zas³uguj¹ na szczególn¹ uwagê, gdy¿ m.in. Shinagawa (11) poda³, ¿e szczepy B. cereus wytwarzaj¹ce toksynê wymiot-n¹ nie hydrolizuj¹ skrobii. Wród szcze-pów wyizolowanych z produktów mle-czarskich przez Te Giffella i wsp. (14) od-setek szczepów zdolnych do rozk³adu skrobi wynosi³ tylko 59%. Jeszcze mniej-szy odsetek szczepów (33%) fermentu-j¹cych skrobiê zaobserwowali Wong i wsp. (16). Trudnoæ w ocenie wyników uzyskanych przez ró¿nych autorów i w niniejszych badaniach mo¿e byæ spowo-dowana tym, ¿e czêæ autorów stosowa-³a metodê API, a inni metody tradycyj-ne, nie okrelaj¹c w metodyce badañ, jak¹ stosowano skrobiê.
Z danych przedstawionych w tab. 2 wynika, ¿e tylko pojedyncze szczepy
fer-mentowa³y L-arabinozê, D-ksylozê, D-mannitol, a-me-tylo-D-mannozyd i a-metylo-D-glukozyd, melibiozê, b-gentiobiozê oraz D-tagatozê. ¯aden badany szczep nie fermentowa³ erytrytolu, D-arabinozy, L-ksylozy, adoni-tolu, b-metylo-ksylozydu, L-sorbozy, ramnozy, dulcyto-lu, inozytodulcyto-lu, sorbitodulcyto-lu, inuliny, melecytozy, rafinozy, ksylitolu, turanozy, D-liksozy, D- i L-fukozy, D- i L-ara-bitolu oraz 2- i 5-ketoglukonianu.
Ze wzglêdu na pochodzenie szczepów, na szczególn¹ uwagê zas³uguje zdolnoæ fermentacji laktozy. W syste-matyce Bergeys Manual (2) podano, ¿e B. cereus nie fermentuje laktozy, natomiast zarówno z danych API 50CHB, jak te¿ z wyników prac autorów zamieszczo-nych w tab. 2 wynika, ¿e niewielki odsetek szczepów B. cereus (do 15%) fermentuje ten cukier. W niniejszych badaniach zdolnoæ fermentacji laktozy wykaza³o a¿ 27% szczepów. Oko³o po³owa tych szczepów zosta³a wyizo-lowana z mleka, natomiast pozosta³e pochodzi³y z po-wierzchni strzyków, popo-wierzchni kubków udojowych, ka³u (oko³o 19% dodatnich) i innych róde³. Te Giffel i wsp. (15) zaobserwowali, ¿e tylko mniej ni¿ 1% szcze-pów pochodz¹cych z mleka surowego i rodowiska fer-mentowa³o laktozê. W póniejszych badaniach tych sa-mych autorów (13, 14), ale nad szczepami B. cereus po-chodz¹cymi z mleka surowego, pasteryzowanego oraz produktów mlecznych 11% do 23% szczepów fermen-towa³o cukier mlekowy. Logan i Berkeley (8) oraz Ran-gasamy i wsp. (10) wykazali tak¹ zdolnoæ u 8% i 15% szczepów B. cereus pochodz¹cych z mleka i produktów mlecznych. Wydaje siê, ¿e zró¿nicowanie wyników w tym zakresie mo¿e wskazywaæ na nabywanie zdolno-ci do fermentacji laktozy przez szczepy B. cereus znaj-Tab. 3. Wybrane cechy biochemiczne szczepów B. cereus okrelone w II etapie metod¹ API 20E
a h c e c a n a d a B y p e z c z S e n a d a b j e z s j e i n i n w y c a r p * E 0 2 I P A Logani y e l e k r e B ) 1 1 ( y m a s a g n a R . p s w i ) 3 1 ( s u e r e c . B 1 B.ce2reus h c i n t a d o d w ó p e z c z s % y z o k u l g -D a j c a t n e m r e F 1001 1001 1001 1001 1001 b-galaktozydaza 13 13 11 10 10 y n i n i g r a a z a l o r d y h i D 58 71 56 60 62 y n y zi l a z a l y s k o b r a k e D 12 10 10 10 10 y n y ti n r o a z a l y s k o b r a k e D 11 10 11 10 10 w ó n a i n y rt y c e i n a t s y z r o k y W 47 38 25 86 92 H e i n a z r a w t y W 2S 10 10 10 b.d. b.d. a z a e r U 13 19 10 10 10 u n a f o t p y rt a z a n i m a e D 10 11 10 10 10 u l o d n i e i n a z r a w t y W 10 11 10 10 10 y n i o t e c a e i n a z r a w t y W ) P -V a j c k a e r( 99 24 25 92 58 y n y t a l e ¿ a zi l o r d y H 1001 98 1001 1001 1001 e i n z c ¹ ³( w ó n a t o z a a j c k u d e R O N e i n a z r a w t y w 2lubN2) 99 55 58 80 1001
Medycyna Wet. 2007, 63 (3) 339 duj¹ce siê w okrelonym rodowisku lub na selekcjê
szczepów maj¹cych ju¿ tê cechê równie¿ w zale¿noci od rodowiska (np. obecnoci laktozy w mleku).
Wybrane wyniki badañ przeprowadzonych przy u¿y-ciu testu API 20E przedstawiono w tab. 3. Nale¿y za-znaczyæ, ¿e test API 20E wprowadzono w niniejszych badaniach jako pomocniczy, choæ przeznaczony jest do charakterystyki przedstawicieli z rodziny Enterobacte-riaceae.
Pod wzglêdem zdolnoci do fermentacji D-glukozy, wytwarzania acetylometylokarbinolu i redukowania azo-tanów potwierdzono ca³kowicie zgodnoæ wyników z otrzymanymi w etapie I. Wród cech, które mo¿na by³o okreliæ tylko metod¹ API 20E, stwierdzono u wielu ba-danych szczepów zdolnoæ hydrolizy argininy, wykorzys-tania cytrynianów oraz u niewielu do wytwarzania ureazy. Odsetek szczepów wykazuj¹cych te cechy by³ zbli¿ony do tego, jaki charakteryzuje B. cereus. Poje-dyncze badane szczepy wytwarza³y dekarboksylazê lizyny i ornityny, a ¿aden szczep nie wytwarza³ H2S, in-dolu i deaminazy tryptofanu. ¯aden szczep nie fermen-towa³ sorbitolu, ramnozy, inozytolu, melibiozy, tym sa-mym wykazano zgodnoæ pod tym wzglêdem wyników otrzymanych przy u¿yciu obu testów API.
Nale¿y zwróciæ uwagê na zdolnoæ fermentacji D-mannitolu przez 4 szczepy B. cereus, co wykaza³y oby-dwa testy API. Brak tej cechy jest podstaw¹ oznaczania B. cereus wed³ug PN-93/A-86034/14 (9). Okazuje siê, ¿e w nielicznych przypadkach metodyka ujêta w Pol-skiej Normie mo¿e daæ b³êdny wynik z powodu wystê-powania nietypowych szczepów B. cereus fermentuj¹-cych D-mannitol; takie przypadki s¹ jednak¿e rzadkie, a pozosta³e testy potwierdzaj¹ce przewidziane w wymie-nionej normie pozwalaj¹ uciliæ wynik.
Wed³ug Bergeys Manual (2), jedn¹ z charakterystycz-nych cech gatunku Bacillus cereus jest zdolnoæ do he-molizy czerwonych krwinek. Wszystkie badane szczepy B. cereus wytwarza³y hemolizyny, co ju¿ wykazano w etapie I, lecz miano hemolizyn by³o zró¿nicowane. Najsilniejsz¹ aktywnoci¹ hemolityczn¹ odznacza³o siê 40% szczepów i ich miano hemolizyn wynosi³o 1/32 i 1/64. Szczepy te pochodzi³y ze wszystkich badanych róde³. S³absz¹ aktywnoæ stwierdzono u 9 szczepów, u których miano hemolizyn wynosi³o 1/16, i u kolej-nych 40 szczepów 1/8. W przypadku 21% szczepów miano wynosi³o zaledwie 1/4, u trzech szczepów 1/2. Tak znaczne zró¿nicowanie intensywnoci wytwarzania hemolizyn przez szczepy B. cereus wystêpuj¹ce w ro-dowisku naturalnym stwierdzono po raz pierwszy. Stec (12) na podstawie przeprowadzonych badañ poda³, i¿ tylko 15% szczepów B. cereus wyizolowanych z pro-duktów spo¿ywczych wykazywa³o siln¹ aktywnoæ he-molityczn¹ wobec krwinek króliczych, natomiast spo-ród szczepów chorobotwórczych silne w³aciwoci he-molityczne wykazywa³o a¿ 42,5% szczepów. Wszystkie szczepy badane w niniejszej pracy wykazywa³y w³aci-woci hemolityczne w stosunku do erytrocytów baranich, podobnie jak szczepy wyizolowane z mleka pasteryzo-wanego przez Te Giffela i wsp. (14).
Podsumowanie
Badania potwierdzi³y wystêpowanie cech typowych dla B. cereus wykazanych w systematyce Bergeya, do których zaliczyæ mo¿na: zdolnoæ do hydrolizy ¿elatyny i kazeiny, fermentowanie D-glukozy, wytwarzanie ace-toiny, redukowanie azotanów do azotynów oraz brak zdolnoci do fermentowania L-arabinozy i D-ksylozy. Ze wzglêdu na pochodzenie badanych szczepów, tj. mle-ko surowe i rodowismle-ko jego pozyskiwania jamle-ko intere-suj¹ce nale¿y uznaæ zaobserwowanie u 27% badanych szczepów, a szczególnie szczepów wyizolowanych z mleka surowego nietypowej dla B. cereus zdolnoci do fermentowania laktozy. Zdolnoæ hydrolizy tributy-ryny, któr¹ oznaczono po raz pierwszy wykazywa³o 72% szczepów. Potwierdzono tak¿e zdolnoci badanego ga-tunku bakterii rozk³adania czerwonych krwinek baranich. Równoczenie wykazano zró¿nicowanie wród szczepów ich aktywnoci hemolitycznej. Bardzo du¿¹ aktywnoci¹ hemolizy charakteryzowa³o siê 41% szczepów, a s³ab-sz¹ 23% szczepów. Stwierdzono, ¿e wród szczepów nale¿¹cych do gatunku B. cereus wystêpuje ogromna ró¿-norodnoæ zdolnoci do metabolizowania ró¿nych zwi¹z-ków, przy czym niektóre zwi¹zki s¹ metabolizowane tyl-ko przez niewielki odsetek szczepów, a wiele zwi¹zków nie jest metabolizowanych w ogóle.
Pimiennictwo
1.Angula L., Lorenzo A., Riveiro M.: Isolation and identification of thermoduric flora of raw cows milk from the province of Pontevedra. Mat. Sesji Modern Microbiological Methods for Dairy Products. Santander, Hiszpania 1989, s. 122-129.
2.Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. Tom 2, (Sneath P. H. A., Mair N. S., Sharpe M. E., Holt J. G. red.). Williams and Willkins, Baltimore 1986, 1104-1139.
3.Berthold A., Molska I.: Wystêpowanie Bacillus cereus w mleku surowym. ¯yw-noæ. Nauka. Technologia. Jakoæ. 2002, 32, Supl., 8-17.
4.Berthold A., Molska I.: Wystêpowanie Bacillus cereus w rodowisku pozyski-wania mleka, Medycyna Wet. 2004, 60, 42-45.
5.Burbianka M., Pliszka A., Burzyñska H.: Mikrobiologia ¯ywnoci, PZWL, War-szawa 1983, s. 460.
6.Cosentino S., Mulargia A. F., Pisano B., Tuveri P., Palmas F.: Incidence and biochemical characteristics of Bacillus flora in Sardinian dairy products. Int. J. Food Microbiol. 1997, 38, 235-238.
7.Kramer J. M., Gilbert R. J.: Bacillus cereus and other Bacillus species, [w:] Doyle M. P. (red.): Foodborne Bacterial Pathogens. Marcel Dekker, Nowy Jork 1989, 21-70.
8.Logan N. A., Berkeley R. C. W.: Identification of Bacillus strains using the API system. J. Gen. Microbiol. 1984, 130, 1871-1882.
9.Polska Norma PN 93/A 86034/14. Mleko i przetwory mleczarskie. Badania mikrobiologiczne. Bacillus cereus oznaczanie liczby metod¹ p³ytkow¹ w tem-peraturze 30°C.
10.Rangasamy P. N., Iyer M., Rogiñski H.: Isolation and characterization of Bacil-lus cereus in milk and dairy products manufactured in Victoria. Austr. J. Dairy Technol. 1993, 48, 93-95.
11.Shinagava K.: Serology and characterization of toxigenic Bacillus cereus. Neth. Milk Dairy J. 1993, 47, 89-103.
12.Stec E.: Intensywnoæ wytwarzania hemolizyn i lecytynazy przez szczepy Bacil-lus cereus wyizolowane z ¿ywnoci. Roczniki PZH 1990, 27, 194-198. 13.Te Giffel M. C., Beumer R. R., Bonestroo M. H., Rombouts F. H.: Incidence and
characterization of Bacillus cereus in two dairy processing plants. Neth. Milk Dairy J. 1996, 50, 479-492.
14.Te Giffel M. C., Beumer R. R., Granum P. E., Rombouts F. M.: Isolation and characterization of Bacillus cereus from pasteurized milk in household refrige-rators in the Netherlands. Intern. J. Food Microbiol. 1997, 34, 307-318. 15.Te Giffel M. C., Beumer R. R., Slaghuis B. A., Rombouts F. M.: Occurence and
characterization of (psychrotrophic) Bacillus cereus on farms in the Nether-lands. Neth. Milk Dairy J. 1995, 49, 125-137.
16.Wong H. C., Chen Y. L., Fan J. Y.: Incidence and characterization of Bacillus cereus isolates contaminating dairy products. Appl. Environ. Microbiol. 1988, 54, 699-702.
Adres autora: dr in¿. Anna Berthold, ul. Nowoursynowska 159C, 02-787 Warszawa; e-mail: anna.berthold@wp.pl
