Medycyna Wet. 2007, 63 (6) 692
Praca oryginalna Original paper
Dobrze uformowane szkliwo jest u ssaków grub¹, zmineralizowan¹ tkank¹ zapewniaj¹c¹ trwa³oæ zêbów i przez to wywiera wp³yw na zdolnoæ pobierania pokar-mu oraz dobrostan zwierz¹t. Amelogenina jest g³ównym komponentem w organicznej macierzy wytwarzanej w zawi¹zkach zêbowych przez ameloblasty, gdzie stano-wi 90% ogólnej zawartoci bia³ka (4). Najistotniejszym etapem w formowaniu szkliwa jest przekszta³canie ma-cierzy w hydroksyapatytowe kryszta³y. W regulacji tego procesu istotn¹ rolê odgrywa amelogenina, g³ównie po-przez zapewnienie wodnego rodowiska koniecznego do inicjowania i wzrostu kryszta³ów. Szczegó³owe mecha-nizmy tego procesu, a zw³aszcza biologiczna rola poszcze-gólnych domen bia³ka s¹ s³abo rozpoznane. Natywna amelogenina samoorganizuje siê, tworz¹c szeciok¹tne pryzmaty (tzw. nanospheres), które, jak siê uwa¿a, s¹ przestrzennymi komponentami bezporednio oddzia³u-j¹cymi na biomineralizacjê (1). U ssaków ³o¿yskowych amelogeninê opisano jako cz¹steczkê sk³adaj¹c¹ siê z trzech regionów: N-terminalnej sekwencji (ok. 48 ami-nokwasów) bogatej w tyrozynê (TRAP tyrosine-rich amelogenin protein), du¿ej hydrofobowej sekwencji ko-rowej (ok. 114 aminokwasów) i C-terminalnej hydro-filowej sekwencji licz¹cej ok. 25 aminokwasów. Usze-regowanie aminokwasów w cz¹steczce jest podobne, na-wet u taksonów ewolucyjnie od siebie odleg³ych, np. u ssaków ³o¿yskowych, stekowców, p³azów i gadów (16, 18). Dlatego polimorfizm genu i bia³ka amelogeniny wy-korzystuje siê jako model przydatny do datowania oraz
przebiegu ewolucyjnego procesu ró¿nicowania kladów ssaków (2, 3). Celowoæ podjêcia weterynaryjnych ob-serwacji nad genem i bia³kiem amelogeniny wynika z podobieñstwa funkcji tego bia³ka u ró¿nych gatunków, a tak¿e z faktu, i¿ metaboliczne zaburzenia w procesie formowania szkliwa zêbowego mog¹ byæ nastêpstwem mutacji genowych. W sekwencji ludzkiego genu AMEL rozpoznano ju¿ 12 mutacji odpowiedzialnych za ró¿ne formy hypoplazji lub wadliwie zmineralizowanego szkli-wa (10), okrelanych zbiorczym mianem amelogenesis imperfecta (AI). Czêciowo lub ca³kowicie rozpoznano geny AMEL u ssaków nale¿¹cych do siedmiu rzêdów: u czternastu gatunków ssaków ³o¿yskowych, dwóch ga-tunków ssaków jajorodnych oraz u jednego gatunku tor-bacza (3, 17). Uwzglêdniaj¹c fakt, i¿ dotychczas zaak-ceptowano istnienie 26 rzêdów ssaków, w obrêbie któ-rych wyodrêbniono 4629 gatunków (3), dotychczasowy zasób wiedzy o strukturalnych i funkcjonalnych aspek-tach genu i bia³ka amelogeniny uznaæ nale¿y za niewiel-ki. Gen AMEL u ssaków sk³ada siê z 7 eksonów, a sek-wencja koduj¹ca bia³ko zaczyna siê od pierwszego ami-nokwasu eksonu 2 i koñczy siê po pierwszym amino-kwasie eksonu 7 (3). U byd³a, podobnie jak u cz³owieka oraz ma³p cz³ekokszta³tnych, zidentyfikowano dwa geny amelogeniny: AMEL-X i AMEL-Y, których loci znajdu-j¹ siê w chromosomach p³ci (6, 7). Ró¿nice w sekwencji tych kopii, bêd¹ce nastêpstwem ich niezale¿nej ewolu-cji, sta³y siê podstaw¹ opracowania rozmaitych testów molekularnych wykorzystywanych do rozpoznawania p³ci osobników na podstawie analizy ladów biologicz-nych (13). U byd³a mo¿liwe jest prowadzenie na tej
pod-Nowy wariant genu amelogeniny u byd³a*
)
GRZEGORZ GRZYBOWSKI, BEATA PRUSAK, JAN TRELA*
Instytut Genetyki i Hodowli Zwierz¹t PAN w Jastrzêbcu, 05-552 Wólka Kosowska, ul. Postêpu 1 *Instytut Zootechniki, ul. Krakowska 1, 32-083 Balice k. Krakowa
Grzybowski G., Prusak B., Trela J.
New variant of the amelogenin gene in cattle Summary
The aim of this work was to search for a sequence polymorphism in the amelogenin gene (AMEL-X) in the region of exon 6. The material covered 653 cows and bulls of variable breeds, typical for their karyotype. The cows used in this study belong to Polish Red (150), Polish Whiteback (72), Red-and-White (72), Black--and-White with Holstein-Friesian blood share (69). The male material used in this study covered 269 sires (Black-and-White with Holstein-Friesian blood share 125, Polish Red 12, pure breed Holstein-Friesian 67, Red-and-White 30, Simmental 27 and different meat breeds 7). Six young bulls of Polish Whiteback and 15 young bulls of Polish Red were also tested. The polymerase chain reaction (PCR) primers used in this study were given by Ennis and Gallagher. The PCR products were separated on ABI PRISM 377 DNA sequencer (AB). For the AMEL-X gene copy the specific PCR product of 278bp was amplified and for the AMEL-Y gene copy the specific PCR product was 215bp long. This typical pattern was observed in cows and bulls of all tested cattle breeds except for the Polish Red. In addition to the typical signal for the chromosome X in 24 cows and 2 bulls of Polish Red a signal for the PCR product of 269bp was detected. This result shows that in an amplified region of AMEL gene in copy on chromosome X the sequence polymorphism is present and its molecular origin is a deletion of 9bp.
Keywords: cattle, amelogenin gene
*) Praca wykonana w ramach projektu badawczego P06D 01827
Medycyna Wet. 2007, 63 (6) 693 stawie m.in. seksowania zarodków (8, 11, 15). U ssaków
³o¿yskowych przypuszczalnie aktywna jest tylko kopia genu AMEL-X, natomiast charakter zmian w kopii genu AMEL-Y (u byd³a i cz³owieka pozbawiony jest on ekso-nu 4) upodabnia go do pseudogeekso-nu. Opisany u ludzi zwi¹-zek miêdzy mutacjami w sekwencji genu amelogeniny a wystêpowaniem wad szkliwa zêbowego (amelogene-sis imperfecta) nie jest jedynym elementem wskazuj¹-cym na znaczenie tego bia³ka u ssaków (19). G³ównym mechanizmem decyduj¹cym o biologicznej funkcji ame-logeniny jest molekularny proces alternatywnego sk³a-dania macierzystego transkryptu mRNA (3). W jego wy-niku generowane s¹ fragmenty LRAP (leucine-rich ame-logenin peptide), którym przypisuje siê rolê cz¹stek re-gulatorowych niezbêdnych w procesie wzrostu koci i chrz¹stek. G³ówne miejsce akceptorowe alternatywne-go sk³adania mRNA zidentyfikowano u byd³a w obrêbie eksonu 6 (2, 3). Jest to region szczególnie wa¿ny w ewolu-cji ssaków oraz w badaniach zwi¹zku miêdzy struktur¹ a funkcj¹ genu. Centralny rejon sekwencji tego eksonu uwa¿a siê za tzw. gor¹ce miejsce mutacji w amelogeni-nie ssaków (3, 16). Wyniki analiz ewolucyjnych wska-zuj¹, ¿e przypuszczalnie powsta³ on w wyniku serii nie-zale¿nych insercji lub delecji nukleotydowych, co w cz¹s-teczce bia³ka manifestuje siê obecnoci¹ tandemowo u³o-¿onych trójpeptydów: Pro-X-Glu lub Pro-X-X (2, 3, 15). Ze wzglêdu na wspomniany charakter polimorfizmu, bêd¹cy analogi¹ do polimorfizmu mikrosatelitów DNA, najskuteczniejsz¹ technik¹ prowadzenia analiz przesie-wowych pod k¹tem rejestrowania ewentualnych mutacji w tym regionie genu jest analiza wielkoci fragmentów DNA.
Celem niniejszych badañ by³o poszukiwanie insercji i delecji w eksonie 6 genu AMEL-X u byd³a.
Materia³ i metody
Badaniami objêto 653 kariotypowo normalnych krów (XX) i buhajów (XY) ró¿nych ras z krajowej hodowli. Materia³ ¿eñ-ski obejmowa³ byd³o rasy pol¿eñ-skiej czerwonej (150 krów) i byd-³o biabyd-³ogrzbiete (72 krowy) objête krajowym programem ochro-ny zasobów genetyczochro-nych oraz krowy rasy czerwono-bia³ej (72 szt.) i czarno-bia³ej (69 szt.) z udzia³em genów byd³a hf, utrzymywane w ró¿nych orodkach hodowlanych. W grupie osobników mêskich analizami objêto 269 buhajów utrzymy-wanych w zak³adach unasienniania (buhaje rasy czarno-bia³ej z ró¿nym udzia³em genów byd³a rasy hf 125 szt., polskie czerwone 12 szt., czystorasowe hf 67 szt., czerwono-bia³e 30 szt., simental 27 szt. oraz buhaje ró¿nych ras miêsnych 7 szt.). W grupie m³odych samców badaniom poddano 6 zwie-rz¹t bia³ogrzbietych ze stada Akademii Rolniczej w Uhrusku (woj. lubelskie) objêtego krajowym programem ochrony zaso-bów genetycznych byd³a oraz 15 buhajków rasy polskiej czer-wonej zakupionych w Stacji Badawczej Rolnictwa Ekologicz-nego i Hodowli Zachowawczej PAN w Popielnie (zwierzêta te utrzymywano w Zak³adzie Dowiadczalnym IGiHZ PAN w Je¿ewicach jako materia³ dowiadczalny w badaniach pro-jektu PBZ-KBN 113/P06/2005/01).
Genomowy DNA ekstrahowano z próbek pe³nej krwi wy-korzystuj¹c zestaw Wizard® Genomic DNA Purification Kit
(Promega). Uzyskane próbki rozcieñczano w 50 µl roztworu rehydruj¹cego (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA (pH 8,0)) i wykorzystywano do analiz bezporednio po ekstrakcji b¹d po d³u¿szym okresie przechowywania w temperaturze 4°C.
Reakcje PCR przeprowadzano w termocyklerze GeneAmp PCR System 9600 (Applied Biosystems) z wykorzystaniem starterów o sekwencjach podanych przez Ennis i Galagher (5) i wed³ug parametrów podanych przez Lubienieck¹ i wsp. (12). Mieszanina reakcyjna mia³a objêtoæ 10 µl, a w jej sk³ad wcho-dzi³o: 0,2 mM ka¿dego z nukleotydów (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 10 × PCR bufor (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2), 1 jednostka polimerazy AmpliTaqGold (Applied Biosystems), 5-20 ng genomowego DNA oraz 0,05--0,18 µM starterów. Produkty PCR rozcieñczano steryln¹ wod¹ w stosunku 1 : 2. 0,5 µl rozcieñczonego produktu PCR miesza-no z 2,0 µl mieszaniny sk³adaj¹cej siê z dejonizowanego for-mamidu, wewnêtrznego standardu wielkoci (GeneScan-500 znakowanego barwnikiem ROX) oraz buforu obci¹¿aj¹cego w stosunku 29 : 6 : 5. Tak przygotowane próbki denaturowano w 95°C przez 3-5 minut, po czym nak³adano na 5% ¿el poli-akryloamidowy (6 M mocznik, roztwór polipoli-akryloamidowy Long Ranger® o stosunku akrylamidu do bisakrylamidu 19 : 1). Rozdzia³ elektroforetyczny produktów PCR prowa-dzono przy u¿yciu automatycznego sekwenatora DNA ABI PRISM 377 (Applied Biosystems). Elektroforezê przeprowa-dzano przez 2,5 godziny w temperaturze 51°C przy napiêciu 3000 V, natê¿eniu 60 mA, mocy 200 W i mocy lasera 40 mW. Dane zbierano przy u¿yciu programu Data Collection v2.11. Analizê wielkoci fragmentów DNA przeprowadzono z wy-korzystaniem programu GeneScan Analysis v3.1 (Applied Bio-systems).
Wyniki i omówienie
Wykorzystywane w badaniach startery reakcji PCR flankowa³y region sekwencji (ok. 300 pz), w obrêbie któ-rego znajduje siê w kopii bydlêcego genu AMEL-Y cha-rakterystyczna delecja 63 pz (GenBank, numer dostêpu Q99004). Dlatego graficzny wynik seksowania przybie-ra³ formê odmienn¹ dla p³ci homogametycznej (XX) i heterogametycznej (XY). Typowy obraz amplifikowa-nych fragmentów dla osobników o kariotypie XX oraz XY przedstawiono na rycinie 1a, 1b. Dla kopii genu AMEL-X amplifikowany by³ specyficzny produkt PCR o wielkoci 278 pz, a dla kopii AMEL-Y produkt o wiel-koci 215 pz. Zatem jednoczesne wyst¹pienie w analizo-wanej próbce sygna³ów detekcji dla dwóch produktów ró¿ni¹cych siê wielkoci¹ (278 pz i 215 pz) oznacza, ¿e pochodzi ona od osobnika mêskiego (XY), natomiast obecnoæ pojedynczego sygna³u dla produktu o wielko-ci 278 pz (w istowielko-cie s¹ to dwa nak³adaj¹ce siê na siebie produkty PCR o identycznej wielkoci) oznacza, ¿e prób-ka pochodzi od osobniprób-ka p³ci ¿eñskiej. Taprób-ka wyk³adnia wynika z istoty podstawowego, molekularnego testu sek-sowania próbek biologicznych byd³a, wprowadzonego do praktyki hodowlano-weterynaryjnej w po³owie lat 90. (5). Opisany powy¿ej, typowy obraz wyników seksowa-nia stwierdzono u osobników ¿eñskich i mêskich wszyst-kich ras, z wyj¹tkiem byd³a rasy polskiej czerwonej. U 24 krów rasy polskiej czerwonej, obok sygna³u detekcji dla produktu PCR o wielkoci 278 pz, wystêpowa³ silny spe-cyficzny sygna³ dla produktu o wielkoci zmniejszonej o 9 pz (ryc. 1c). Podobn¹ sytuacjê zanotowano w przy-padku analizy DNA od dwóch buhajków rasy polskiej czerwonej, u których obok sygna³u detekcji dla produk-tu typowego dla kopii AMEL-Y (215 pz) ujawnia³ siê sygna³ specyficzny dla kopii AMEL-X, ale o wielkoci zmniejszonej o 9 pz (ryc. 1d). Takich przypadków do-tychczas nie notowano w badaniach sekwencji
bydlêce-Medycyna Wet. 2007, 63 (6) 694 c p y w o r K ) n ( il e ll a a j c n e w k e r F Frekwencja w ó p y t o n e g y p y t o n e G 8 7 2 269 278/278 278/269 269/269 0 5 1 0,920 0,080 Obserwowana 0,840 0,160 0,000 a n a w i k e z c O 0,846 0,147 0,006
Tab. 1. Frekwencja alleli i genotypów genu AMEL-X w badanej grupie krów rasy polskiej czerwonej
go genu AMEL. Wynik ten wskazuje, ¿e w obrêbie am-plifikowanego fragmentu genu AMEL, w kopii umiej-scowionej w chromosomie X wystêpuje polimorfizm sek-wencji, a jego molekularnym pod³o¿em jest delecja nu-kleotydowa 9 pz. Nowo zidentyfikowany wariant sekwen-cji oznaczono jako AMEL-X(269). Poniewa¿ jego obec-noæ stwierdzono tylko u byd³a rasy polskiej czerwonej, mo¿e to wskazywaæ i¿ jest to marker charakterystyczny dla tej rasy. Wybrana stawka byd³a rasy polskiej czerwo-nej jest w Polsce utrzymywana w hodowli zachowaw-czej (14), co jest fragmentem realizowanego pod aus-picjami FAO, wiatowego programu ochrony zasobów genetycznych zwierz¹t (Project MoDAD, http:// www.fao.org/dad-is). Na tle porównañ z innymi rasami hodowanymi w Europie, byd³o polskie czerwone cha-rakteryzuje siê wysok¹ zmiennoci¹ genetyczn¹. Topo-logia drzewa filogenetycznego, oparta na wartociach ge-netycznego dystansu Dps uzyskanych z analiz
polimor-fizmu mikrosatelitów DNA dowodzi, ¿e 80% osobników objêtych programem hodowli zachowawczej tworzy ge-netycznie odrêbn¹, unikaln¹ grupê rasow¹ (9). Uwa¿a siê, ¿e byd³o rasy polskiej czerwonej pochodzi od tura ma³ego brachycerycznego, tzw. bos taurus brachyceros, a polska hodowla tego byd³a reprezentuje najstarsz¹ ho-dowlê zarodow¹ w Europie, prowadzon¹ w sposób ci¹g-³y od roku 1893 (17). Jest prawdopodobne, ¿e w puli genowej wspó³czesnej populacji mog³y zachowaæ siê uni-kalne warianty genów, takie jak nowo zidentyfikowany wariant AMEL-X(269), które w wyniku ostrej selekcji na cechy produkcyjne zosta³y ju¿ wyeliminowane z po-pulacji innych ras byd³a. Jednoczenie zwraca uwagê fakt, ¿e wariant AMEL-X(269) wyst¹pi³
u krów rasy polskiej czerwonej tylko w for-mie heterozygotycznej, co jest zbie¿ne z mo-delem dziedziczenia rozmaitych funkcjonal-nych anomalii u byd³a. Ogromna wiêkszoæ dziedzicznych anomalii u byd³a to cechy recesywne, ujawniaj¹ce siê w genotypach homozygotycznych. Stan ten sprawia, ¿e fe-notyp heterozygot (nosicieli mutacji) nie
od-biega od typowego dla zwierz¹t nor-malnych. Tak w³anie jest w przy-padku krów pc o genotypie normal-nym 278/278 i osobników heterozy-gotycznych 278/269. W analizowa-nej stawce krów, która obejmowa³a wszystkie osobniki stada podstawo-wego byd³a rasy polskiej czerwonej z dwóch najwiêkszych w Polsce orodków hodowli zachowawczej z pó³nocy i po³udnia kraju (stado O.O. Cystersów w Szczyrzycu, pow. Limanowa oraz stado ze Stacji Ba-dawczej Rolnictwa Ekologicznego i Hodowli Zachowawczej Zwierz¹t PAN w Popielnie, pow. Pisz), nie zidentyfikowano ¿adnego osobnika o genotypie homozygotycznym wzglêdem wariantu AMEL-X(269). Nie daje to jednak podstaw do wnios-kowania na temat ewentualnej funk-cjonalnej natury nowo wykrytego wariantu AMEL-X(269). W tabeli 1 podano frekwencjê alleli AMEL-X(278) i AMEL-X(269), a tak¿e wartoci odnosz¹ce siê do frekwencji obserwowanych i spodzie-wanych genotypów. Odchylenia te nie odbiegaj¹ statys-tycznie istotnie (chi2 = 1,16) od wartoci wynikaj¹cych
z formu³y matematycznej Hardyego-Weinberga. Daje to podstawê do stwierdzenia, ¿e badana stawka krów pc znajduje siê w stanie równowagi genetycznej. Przy frek-wencji allelu AMEL-X(269) = 0,08 (tab. 1), mo¿na by oczekiwaæ wyst¹pienia co najwy¿ej jednego genotypu ho-mozygotycznego 269/269 (wartoæ oczekiwana = 0,96). Nale¿y jednak zauwa¿yæ ¿e analizowana stawka krów pz nie odpowiada kryteriom populacji Mendlowskiej. Jest bowiem nieliczna, kojarzenia nie s¹ losowe, a sam¹ staw-kê wybrano do hodowli zachowawczej nie jako próbê losow¹ populacji, lecz skompletowano na podstawie cech eksterieru arbitralnie uznanego za typowy dla rasy. Brak homozygotycznego genotypu 269/269 w tym materiale mo¿e byæ wiêc przypadkowy. Z kolei w licznej grupie buhajów reprodukcyjnych ró¿nych ras z krajowych SHiUZ (a wiêc u osobników podlegaj¹cych sta³emu nad-zorowi weterynaryjnemu i weryfikowanych pod wzglê-dem przydatnoci do hodowli), wszystkie osobniki po-siada³y w genomie jedynie typowy wariant amelogeniny AMEL-X(278). Bior¹c pod uwagê identyczn¹ funkcjê amelogeniny u ró¿nych gatunków ssaków, a zw³aszcza fakt, i¿ ró¿ne mutacje w ludzkim genie AMEL-X prowa-dziæ mog¹ do istotnych dziedzicznych anomalii AI, celo-we by³oby zcelo-weryfikowanie, czy i w jakim zakresie byd-lêce bia³ko amelogenina bêd¹ca produktem nowo wy-krytego wariantu genu AMEL-X(269) ma sekwencjê
ami-Ryc. 1. Obraz sygna³u detekcji produktu PCR genu amelogeniny po elektroforezie w ¿elu poliakryloamidowym na sekwenatorze ABI Prism 377 uzyskany dla: a) osob-nika ¿eñskiego o genotypie 278/278, b) osobosob-nika mêskiego o genotypie 215/278, c) osobnika ¿eñskiego o genotypie 269/278, d) osobnika mêskiego o genotypie 215/269
Medycyna Wet. 2007, 63 (6) 695 nokwasow¹ i metaboliczne w³aciwoci analogiczne do
typowego wariantu AMEL-X(278). Wydaje siê, ¿e wcze-sne prewencyjne rozpoznanie funkcjonalnej natury tej mutacji by³oby konieczne m.in. ze wzglêdu na wspom-niane ju¿ zagro¿enia wynikaj¹ce z recesywnoci rozma-itych mutacji genowych. Wydaje siê, ¿e by³oby to wska-zówk¹ pomocn¹ przy w³aciwym ukierunkowywaniu programu selekcji i ochronie zasobów genetycznych byd-³a rasy polskiej czerwonej.
Gibson i wsp. (7) przypuszczaj¹, ¿e bia³ko specyficz-ne dla kopii AMEL-Y ma funkcjê nieco odmienn¹ od kopii AMEL-X, konieczn¹ tylko dla formowania szkli-wa zêbowego u samców. Jeli zatem u osobników p³ci homogametycznej jeden z genów AMEL-X ulega inak-tywacji (co by³oby zgodne z normalnym procesem kom-pensowania dawki genów w genotypach XX i XY), a obydwa loci s¹ aktywne u samców, taka charaktery-styczna cecha wyró¿nia³aby geny amelogeniny od innych loci zlokalizowanych na chromosomach p³ci.
Rozpoznane dotychczas defekty genetyczne u ludzi odpowiedzialne za wystêpowanie anomalii amelogene-sis imperfecta, zwi¹zane s¹ z mutacjami w³anie w kopii genu AMEL-X. Sporód 12 opisanych dotychczas pos-taci tej wady dziedzicznej, tylko w przypadku trzech przy-czyn¹ s¹ podstawienia aminokwasów w cz¹steczce ame-logeniny. Pozosta³e przypadki amelogenesis imper-fecta s¹ nastêpstwem delecji nukleotydowych w sekwen-cji kopii genu AMEL-X, które prowadz¹ do zmiany ramki odczytu podczas translacji bia³ka (10). Poniewa¿ przy-padek delecji w koduj¹cej sekwencji genu zachodzi w przypadku nowo wykrytego bydlêcego wariantu AMEL-X(269), celowe by³oby zweryfikowanie poten-cjalnych skutków jego obecnoci w genomie.
U ¿adnego z gatunków zwierz¹t gospodarskich nie opisano dot¹d wady dziedzicznej etiologicznie podobnej do ludzkich hypoplazji lub wadliwie zmineralizowanego szkliwa zêbowego. Nie ma jednak informacji i¿ obser-wacje z tego zakresu kiedykolwiek prowadzono, gdy¿ stomatologii weterynaryjnej nie wydzielano jako odrêb-nego dzia³u praktyki klinicznej.
Z porównania sekwencji genu AMEL u gatunków re-prezentuj¹cych g³ówne linie ssaków (3) wynika, ¿e nowo wykryta delecja 9 pz w bydlêcej kopii AMEL-X jest przy-puszczalnie zlokalizowana w pobli¿u akceptorowego miejsca alternatywnego sk³adania (tzw. splicingu) pier-wotnego transkryptu mRNA. Splicing eksonu 6 dokonu-je siê poprzez intraeksonowe przeciêcie miejsca akcep-torowego. Jest ono identyfikowane jako sygna³ splicin-gu, poniewa¿ wystêpuje na granicy intron/ekson. G³ów-ne miejsce splicingu zlokalizowaG³ów-ne jest w rejonie 3 eks-onu 6. U myszy, szczura, byd³a i wini taki wewn¹trz eksonowy splicing powoduje utworzenie fragmentu LRAP (leucine-rich amelogenin peptide) istotnego w pro-cesie regulowania wzrostu koci i chrz¹stek (3). Central-ny hydrofobowy region cz¹steczki bydlêcej amelogeni-ny, analizowany w niniejszej pracy, odpowiadaj¹cy w przewa¿aj¹cej czêci nukleotydowej sekwencji ekso-nu 6, wykazuje u wszystkich gatunków konserwatyw-noæ pod wzglêdem wysokiej zawartoci proliny i gluta-miny. Wskazuje to, ¿e obecnoæ tych aminokwasów w cz¹steczce ma istotne znaczenie dla funkcji bia³ka. Z ko-lei konserwatywnoæ niektórych pozycji nukleotydowych
w genie amelogeniny u wszystkich ssaków, zw³aszcza w rejonie poprzedzaj¹cym wspomniane miejsce alterna-tywnego sk³adania mRNA sugeruje, ¿e zachodz¹ce tu mu-tacje mog¹ mieæ znaczenie dla funkcji bia³ka i przez to mog¹ oddzia³ywaæ na zdolnoci przystosowawcze okre-lonych genotypów.
Obok potencjalnego, funkcjonalnego znaczenia wystê-powania wariantu AMEL-X(269) w genomie byd³a, jego zidentyfikowanie ma wymierne praktyczne znaczenie dla bie¿¹cych badañ diagnostycznych opartych na analizie DNA. Wyniki prezentowane w niniejszym artykule do-wodz¹, ¿e seksowanie próbek biologicznych byd³a na podstawie polimorfizmu genu AMEL jest bardziej z³o-¿one ni¿ s¹dzono, gdy¿ specyficzne produkty PCR mog¹ byæ mylnie uznawane za artefakty. W szczególnoci nie-trafna okazuje siê dotychczas przyjmowana wyk³adnia wyników seksowania, która zak³ada, ¿e p³eæ homogame-tyczna byd³a (XX) zawsze manifestuje siê fenotypem ho-mozygotycznym (jeden sygna³ detekcji dla produktu PCR o wielkoci 278 pz). Tymczasem obecnoæ w puli geno-wej populacji nowo wykrytego wariantu AMEL-X(269) sprawia, ¿e wród kariotypowo normalnych osobników ¿eñskich mog¹ wystêpowaæ a¿ trzy kombinacje wielko-ci amplifikowanych fragmentów PCR: 278/278, 278/269 i 269/269, a wród osobników mêskich mog¹ wystêpo-waæ dwa genotypy: 278/215 i 269/215.
Pimiennictwo
1.Aoba T.: Recent observations on enamel crystal formation during mammalian amelogenesis. Anat. Rec. 1996, 245, 208-218.
2.Delgado S., Casane D., Bonnaud L., Laurin M., Sire J.-Y., Girondot M.: Mole-cular evidence for Precambrian origin of amelogenin, the major protein of vertebrate enamel. Mol. Biol. Evol. 2001, 18, 2146-2153.
3.Delgado S., Girondot M., Sire J.-Y.: Molecular evolution of amelogenin in mam-mals. J. Mol. Evol. 2005, 60, 12-30.
4.Deutsch D.: Structure and function of enamel gene products. Anat. Rec. 1989, 224, 189-210.
5.Ennis S., Galagher T. F.: A PCR-based sex determinartion assay in cattle based on the bovine amelogenin locus. Anim. Genet. 1994, 25, 425-427.
6.Gibson C., Golub E., Herold R., Risser M., Ding W., Shimokawa H., Young M., Termine J., Rosenbloom J.: Structure and expression of the bovine amelogenin gene. Biochemistry 1991, 30, 1075-1079.
7.Gibson C. W., Golub E. E., Abrams W. R., Shen G., Ding W., Rosenbloom J.: Bovine amelogenin message heterogeneity: Alternative splicing and Y-chro-mosome gene transcription. Biochemistry 1992, 31, 8384-8388.
8.Grzybowski G, Dymnicki E.: Metody oraz ekonomiczne znaczenie sterowania proporcj¹ p³ci u byd³a. Biotechnologia 1997, 3, 38-50.
9.Grzybowski G., Prusak B.: Genetic variation in nine European cattle breeds as determined on the basis of microsatellite markers. III. Genetic integrity of the Polish Red cattle included in the breeds preservation programme. Anim. Sci. Pap. Rep. 2004, 22, 45-56.
10.Hart P. S., Hart T. C., Simmer J. P., Wright J. T.: A nomenclature for X-linked amelogenesis imperfecta. Arch. Oral Biol. 2002, 47, 255-260. 11.Lechniak D., Cumming I. R.: The use of amelogenin gene polymorphism in
PCR embryo sexing in bovine IVF embryos. J. Appl. Genet. 1997, 38, 45-49. 12.Lubieniecka J., Grzybowski G., Lubieniecki K.: Genetic variation in nine
Euro-pean cattle breeds as determined on the basis of microsatellite markers I. Within-breed variation. Anim. Sci. Pap. Rep. 2001, 19, 249-264.
13.Micicka-liwka D., Grzybowski T., Woniak M.: Optimization of a hexaplex DNA amplification from short tandem repeat and amelogenin loci. Electropho-resis 1997, 18, 1627-1632.
14.Reklewski Z.: Hodowla zachowawcza byd³a rasy polskiej czerwonej. Wiadom. Zoot. 2005, XLIII, 98-101.
15.Reklewski T., Grzybowski G., Lubieniecki K.: Sex identification in cattle on the basis of amelogenin polymorphism. ivoèina Výroba 1996, 41, 504-505. 16.Sire J. Y., Delgado S., Fromentin D., Girondot M.: Amelogenin: lessons from
evolution. Arch. Oral Biol. 2005, 50, 205-212.
17.Szarek J., Adamczyk K.: Zarys historyczny byd³a polskiego czerwonego. Wia-dom. Zoot. 2005, XLIII, 3-12.
18.Toyosava S., OHuigin C., Figueroa F., Tichy H., Klein J.: Identification and characterization of amelogenin genes in monotremes, reptiles, and amphibians. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 13056-13061.
19.Veis A.: Amelogenin gene splice products: potential signaling molecules. Cell. Mol. Life Sci. 2003, 60, 38-55.
Adres autora: prof. dr hab. Grzegorz Grzybowski, Jastrzêbiec, ul. Postê-pu 1, 05-552 Wólka Kosowska; e-mail: g.grzybowski@ighz.pl
