Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 63 (4), 448-454, 2007

Praca oryginalna Original paper

Dro¿d¿opodobne grzyby z rodzaju Malassezia od wielu lat stanowi¹ powa¿ny problem, zarówno dla mikrobiologów, jak i dla lekarzy klinicystów. Grzyby te zaliczane do organizmów lipofilnych, wchodz¹ w sk³ad fizjologicznej mikroflory skóry i b³on œluzo-wych ludzi (15) i zwierz¹t (13). Mog¹ byæ równie¿ odpowiedzialne za ró¿nego typu powierzchniowe in-fekcje skóry (16) oraz znacznie rzadziej za grzybice systemowe (16), a nawet fungemie (25). Obecnie przyj-muje siê (14), ¿e rodzaj Malassezia obejprzyj-muje szeœæ lipidozale¿nych gatunków: M. furfur, M. sympodialis, M. slooffiae, M. globosa, M. restricta, M. obtusa i je-den lipidoniezale¿ny gatunek: M. pachydermatis. Do niedawna uwa¿ano, ¿e gatunki obligatoryjnie wyma-gaj¹ce do wzrostu obecnoœci d³ugo³añcuchowych

kwa-sów t³uszczowych (12) izolowane s¹ g³ównie od ludzi (1), podczas gdy M. pachydermatis zwi¹zany jest z organizmem zwierz¹t (4). M. pachydermatis izolo-wano najczêœciej od dzikich i domowych zwierz¹t miê-so¿ernych, jak: psy, koty (13), niedŸwiedzie, ³asice, lisy (22), fretki (3). Wystêpowa³ równie¿ u dromade-rów (13), œwiñ (16), byd³a (8), koni (5), nosoro¿ców (11) i ptaków (4). Szczegó³owe badania dotycz¹ce no-sicielstwa M. pachydermatis by³y przeprowadzane g³ównie u psów; wykaza³y one obecnoœæ dro¿d¿aków u oko³o 49% (11) zdrowych klinicznie zwierz¹t, przy czym w zewnêtrznym przewodzie s³uchowym odse-tek ten wynosi³ oko³o 32,5% (11).

Pod wp³ywem zmian zachodz¹cych w mikroœrodo-wisku drobnoustrojów, os³abienia mechanizmów

ob-Fenotypowa charakterystyka szczepów

Malassezia pachydermatis

ANETA NOWAKIEWICZ, GRA¯YNA ZIÓ£KOWSKA

Zak³ad Mikrobiologii Weterynaryjnej Instytutu Chorób ZakaŸnych i Inwazyjnych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin

Nowakiewicz A., Zió³kowska G.

Phenotypic characteristics of Malassezia pachydermatis strains Summary

Yeast like fungi of Malassezia pachydermatis species are numbered among the opportunistic agents accounting for acute dermatoses or even systemic infections in people and animals. They exhibit the clear heterogeneity pertaining to the phenotypic traits and growth requirements. The objective of the present study was to determine the degree of variation as well as the biochemical profiles of M. pachydermatis strains. The studies were conducted on 40 strains isolated from the auditory canal of healthy dogs and those with otitis externa symptoms recognized. An assessment was conducted of the traits of fungus morphology (size and shape of cells and colony type), expression of extracellular hydrolases (API-ZYM) and the activity of catalase, urease, caseinase, beta-glucosidase, phospholipase and Tween hydrolases: 20, 40, 60 and 80. The obtained results made it possible to determine the general metabolism pattern for this species: no fermentability or capacity for assimilation of most carbohydrates, poor proteolytic properties, high activity of enzymes from the phosphatase and lipolytic enzymes groups. On the grounds of the statistical analysis, the examined strains were classified into 7 separate groups of congenial morphology and a determined level of enzymatic activity. Biotype I includes large, smooth and creamy-white colonies of high metabolic activity; moreover, they exhibit high sensitivity to the inhibitory operation of Tween 20 and Cremophor EL; biotype II exhibits a rough type of colony growth, the lowest metabolic activity and a lack of expression of lipase C14 and enzymes from the arylamidase group; biotype III comprises the strains of large, smooth colonies, poor total enzymatic activity and with no activity of cystynic arylamidase; biotype IV includes the strains of small and smooth colonies, average metabolic activity but with optimal usability of Tween 40 and 60 hydrolysis products for growth; biotype V groups the strains of the average metabolic activity and without phospholipase activity recorded; biotype VI comprises the strains of smooth, large or medium-sized colonies and a relatively high enzymatic activity as well as the highest level for alkaline phosphatase and valine arylimidase, phospholipase, catalase, caseine, Tween 80 hydrolase; biotype VII is characterized by the highest total enzymatic activity, high capacity for eskulin break-down, Tween 40, 60 and 80 hydrolysis. Further studies are needed to demonstrate a correlation between the strain classification into a defined biotype and its ecologic or clinical status.

ronnych gospodarza lub innych, trudnych do okreœle-nia przy obecnym stanie wiedzy czynników, M. pa-chydermatis mo¿e ulec konwersji w patogen. U psów jako czynnik etiologiczny, odpowiedzialna jest za 30--80% przypadków zapalenia zewnêtrznego przewodu s³uchowego (otitis externa) (28). M. pachydermatis izolowana by³a równie¿ od ludzi z przypadków zapa-lenia kana³u s³uchowego (10), ran skóry (16), a nawet fungemii (21).

Profil fenotypowy lipidozale¿nych gatunków Ma-lassezia jest na ogó³ zbli¿ony i charakterystyczny dla poszczególnych taksonów (1, 10, 12), natomiast gatu-nek Malassezia pachydermatis cechuje wysoki stopieñ heterogennoœci w tym zakresie (6, 11). Zmiennoœæ poszczególnych szczepów obserwowano tak¿e odnoœ-nie do ich wymagañ wzrostowych; obok typowych szczepów M. pachydermatis wystêpuj¹ szczepy wy-raŸnie lipofilne, o krótszym okresie inkubacji i inten-sywniejszym wzroœcie w obecnoœci lipidów (19), a na-wet pojedyncze izolaty o cechach lipidozale¿noœci (2). Celem badañ by³o okreœlenie stopnia zmiennoœci oraz profili fenotypowych szczepów M. pachyder-matis.

Materia³ i metody

Badaniami objêto 40 szczepów nale¿¹cych do gatunku Malassezia pachydermatis, pochodz¹cych z kolekcji w³as-nej Zak³adu Mikrobiologii Weterynaryjw³as-nej Instytutu Cho-rób ZakaŸnych i Inwazyjnych Akademii Rolniczej w Lub-linie oraz szczep referencyjny tego samego gatunku z ko-lekcji Cenraalbureau voor Schimmelcultures w Holandii (CBS7925).

Szczepy wytypowane do badañ izolowane by³y z ze-wnêtrznego kana³u s³uchowego psów zdrowych oraz z ob-jawami stanu zapalnego (otitis externa). Po wstêpnej iden-tyfikacji szczepy przechowywano w stanie zamro¿onym (–70°C) jako zawiesinê komórek o gêstoœci 2 × 109 _{jtk ml}–1

w ja³owym p³ynie fizjologicznym z dodatkiem 1,5% glice-rolu. Jako inokulum stosowano zawiesiny komórek Ma-lassezia o gêstoœci 2 × 109 _{jtk ml}–1_{, w p³ynie}

fizjologicz-nym, pochodz¹cych z trzydniowych hodowli na sta³ym pod³o¿u Sabourauda w temperaturze 37°C.

Morfologia M. pachydermatis. Wielkoœæ, barwê i struk-turê powierzchni kolonii M. pachydermatis oceniano po up³ywie 3, 5, 7 i 14 dni inkubacji na sta³ym pod³o¿u Sa-bourauda (4% glukoza, 1% pepton, 2% agar). Kszta³t i wiel-koœæ komórek oceniano mikroskopowo (1000 ×) w prepa-ratach barwionych b³êkitem metylenowym (20 sek.); ma-teria³ do badania stanowi³a pojedyncza kolonia po 3 dniach inkubacji na pod³o¿u sta³ym.

Profil biochemiczny szczepów

Aktywnoœæ hydrolaz zewn¹trzkomórkowych okreœlano pó³iloœciowym zestawem API-ZYM (bio-Merieux), wed³ug instrukcji producenta.

Aktywnoœæ katalazy. Na odt³uszczone szkie³ko nakryw-kowe nakroplono 10% roztwór nadtlenku wodoru, nastêp-nie rozprowadzono w nim pojedyncz¹ kroplê inokulum; obecnoœæ pêcherzyków gazu œwiadczy³a o wyniku dodat-nim; intensywnoœæ reakcji oceniono na podstawie czasu

pojawienia siê pêcherzyków: ++++ reakcja natychmiasto-wa do 2 sek., +++ reakcja do 5 sek., ++ reakcja od 5 do 10 sek., + reakcja powy¿ej 10 sek., – brak reakcji.

Aktywnoœæ b-glukozydazy. Na okreœlony sektor pod-³o¿a o sk³adzie: pepton 0,15%, cytrynian ¿elazowo-amo-nowy 0,01%, eskulina 0,01%, agar 2%, nanoszono metod¹ liniow¹ inokulum o objêtoœci 1 oczko ezy i inkubowano w temperaturze 37°C przez 72 godziny. Za reakcjê dodat-ni¹ przyjmowano br¹zowo-czarne zabarwienie wokó³ ko-lonii grzyba.

Aktywnoœæ ureazy. Badane szczepy wysiewano na zmo-dyfikowane pod³o¿e Christensena o sk³adzie: pepton 0,1%, NaCl 0,5%, KH₂PO₄ 0,2%, glukoza 0,5%, agar 2%, 6 ml/l czerwieñ fenolowa, ja³owy 20% roztwór mocznika 10%. Posiewy inkubowano w temperaturze 37°C przez 1-7 dni. Intensywnoœæ reakcji okreœlano na podstawie zmiany za-barwienia pod³o¿a wokó³ kolonii i czasu wyst¹pienia. Przy-jêto nastêpuj¹cy klucz do oznaczania aktywnoœci enzyma-tycznej szczepów: ++++ zmiana zabarwienia pod³o¿a po 12 godzinach, +++ zmiana zabarwienia pod³o¿a po 24 go-dzinach, ++ zmiana zabarwienia pod³o¿a po 48 gogo-dzinach, + zmiana zabarwienia pod³o¿a po 72 godzinach.

Aktywnoœæ kazeinazy. Inokulum grzyba (pojedyncze oczko ezy) wysiewano metod¹ punktow¹ na pod³o¿e Staiba o sk³adzie: glukoza 2%, KH₂PO₄ 0,1%, MgSO₄ 0,05%, kazeina 10%, agar 2%. Posiewy inkubowano w tem-peraturze 37°C przez 1-7 dni. Jako wynik dodatni przyjêto powstanie strefy precypitacji lub przejaœnienia wokó³ linii posiewu. Aktywnoœæ enzymatyczn¹ grzyba okreœlano uwzglêdniaj¹c wielkoœæ strefy zmian wokó³ kolonii oraz czas ich wyst¹pienia. Przyjêto nastêpuj¹cy klucz do inter-pretacji wyników: ++++ obecnoœæ strefy przejaœnienia po 24 godzinach, +++ obecnoœæ strefy przejaœnienia po 48 godzinach, ++ obecnoœæ strefy przejaœnienia po 72 godzi-nach, + obecnoœæ strefy precypitacji, – brak aktywnoœci en-zymatycznej.

Aktywnoœæ fosfolipazy. Inokulum poszczególnych szczepów nanoszono metod¹ posiewu liniowego na okreœ-lony sektor pod³o¿a o sk³adzie: glukoza 1%, pepton 1%, 0,55g µl–1_{chlorku wapnia, emulsja ¿ó³tka jaja kurzego 8%}

(Egg Yolk Emulsion, firmy Cormay), gentamycyna 0,05 mg/l, aktydion 0,5 mg/l. Posiewy inkubowano w 37°C 1-7 dni. Wytworzenie strefy opalescencji wokó³ kolonii Ma-lassezia œwiadczy³o o rozk³adzie lecytyny (obecnoœæ fos-folipazy) do wolnych kwasów t³uszczowych, które nastêp-nie z jonami wapnia tworzy³y nastêp-nierozpuszczalne sole. Ak-tywnoœæ enzymatyczn¹ oceniano na podstawie czasu wy-stêpowania strefy opalescencji: ++++ po 24 godzinach, +++ po 48 godzinach, ++ po 72 godzinach, + powy¿ej 72 godzi-nach, – brak po 7 dniach.

Tween i Cremophor EL-test. Jako substraty wyko-rzystano: Tween 20 (ester kwasu laurylowego) (Bio-Rad), Tween 40 (ester kwasu palmitynowego) (Fluka), Tween 60 (ester kwasu stearynowego) (Fluka), Tween 80 (ester kwa-su olejowego) (Schuchardt München), Cremophor EL (ester oleju rycynowego) (Fluka). 1 ml inokulum badane-go szczepu dodawano do 15 ml pod³o¿a Sabourauda o tem-peraturze ok. 50°C, nastêpnie wylewano na p³ytkê Petrie-go o œrednicy 10 cm. W zestalonym pod³o¿u korkoborem wycinano 5 studzienek o œrednicy 5 mm, które po

uszczel-nieniu (1% agar) wype³niano 50 µl poszczególnych sub-stratów. Posiewy inkubowano w temperaturze 37°C przez 24, 48, 72 godziny. Oceniano nasilenie wzrostu grzyba wokó³ poszczególnych studzienek, przyjmuj¹c nastêpuj¹-ce kryteria klasyfikacji: ++++ bardzo intensywne nasile-nie wzrostu o œrednicy > 10 mm, +++ intensywne nasilenasile-nie wzrostu o œrednicy od 8 do 10 mm, ++ œrednie nasilenie wzrostu o œrednicy od 5 do 8 mm, + s³abe nasilenie wzros-tu o œrednicy od 2 do 5mm, bw. – brak wp³ywu na wzrost, – hamowanie wzrostu wokó³ studzienek.

Uzyskane wyniki po wstêpnej ocenie poddano analizie statystycznej z wykorzystaniem podobieñstwa metod¹ kwadratu b³êdu okreœlonego na podstawie macierzy podo-bieñstwa dla kwadratu b³êdu (24).

Wyniki i omówienie

Grzyby z rodzaju Malassezia charakteryzuj¹ siê ty-pow¹ morfologi¹, pozwalaj¹c¹ na odró¿nienie tego taksonu od innych grzybów dro¿d¿opodobnych. S¹ to na ogó³ buteleczkowatego kszta³tu blastospory, two-rz¹ce kolonie matowe, szorstkie, o luŸnym kontakcie z pod³o¿em (1). Pocz¹tkowo cechy morfologiczne sta-nowi³y podstawowe kryterium ró¿nicowania miêdzy-gatunkowego tych grzybów (21), jednak ze wzglêdu na niejednoznaczn¹ ich interpretacjê oraz opracowa-nie nowych procedur diagnostycznych (12) stosowa-ne s¹ jedynie jako wspomagaj¹cy etap klasyfikacji, np. w przypadku gatunków M. globosa i M. obtusa (12). Przeprowadzona obecnie morfologiczna ocena szcze-pów M. pachydermatis, wykaza³a, podobnie jak bada-nia innych autorów (19), wysok¹ heterogennoœæ w tym zakresie.

Uwzglêdniaj¹c wielkoœæ, strukturê powierzchni i barwê, wyró¿niono dla szczepów M. pachydermatis szeœæ typów kolonii (tab. 1). Typ kolonii zwi¹zany by³ prawdopodobnie z budow¹ chemiczn¹ ich œciany ko-mórkowej, a dok³adnie z zawartoœci¹ nienasyconych kwasów t³uszczowych (19). Kolonie typu szorstkiego tworzy³y komórki zawieraj¹ce w swoim sk³adzie ma³¹ iloœæ kwasu linolenowego i brak kwasu oleinowego. Na pod³o¿ach wzbogaconych w zwi¹zki lipidowe ros-³y zdecydowanie szybciej, przekszta³caj¹c siê w g³ad-kie formy dysocjacyjne, co mo¿e wskazywaæ na nie-dobór lipidowych sk³adników od¿ywczych w warun-kach in vivo (19). Mikromorfologia blastospor M. pa-chydermatis by³a zró¿nicowana, zarówno co do wiel-koœci, jak i kszta³tu. D³ugoœæ komórek grzyba waha³a

siê od 3,5 do 8 µm, a szerokoœæ od 1,5 do 4 µm, przy czym kolonie szorstkie tworzy³y na ogó³ komórki pa-³eczkowate lub kuliste 3÷4 µm (72,7%). Kolonie g³ad-kie zawiera³y blastospory œredniej wielkoœci (2,5÷5-6 µm) (55,1%) lub du¿e (2-4÷7-8 µm) (27,5%), o kszta³-cie buteleczkowatym (tab. 1). Kszta³t i wielkoœæ ko-mórek grzyba nie ma jednak odbicia w ich ultrastruk-turze, która jest cech¹ sta³¹ (7), natomiast zmiany w mi-kromorfologii mog¹ byæ wynikiem zró¿nicowanego dostêpu do substancji od¿ywczych w œrodowisku (11) lub zmiennej ekspresji enzymów hydrolitycznych.

Spektrum i aktywnoœæ enzymatyczn¹ w zakresie zewn¹trzkomórkowych hydrolaz oceniano na podsta-wie wyników testu API-ZYM, odczytywanych po 4 godzinach inkubacji (tab. 2). Wartoœci uzyskane po 16 godzinach, ze wzglêdu na ich unifikacjê w zakre-sie aktywnoœci poszczególnych enzymów, nie zosta³y uwzglêdnione.

Kompleksowa ocena ekspresji zewn¹trzkomórko-wych hydrolaz (API-ZYM) przez szczepy M. pachy-dermatis, pozwoli³a ustaliæ ogólny profil enzymatyczny grzybów nale¿¹cych do tego gatunku. Wykazano (tab. 2), ¿e podobnie jak szczep referencyjny M. pa-chydermatis, wszystkie badane szczepy charakteryzo-wa³a maksymalna aktywnoœæ w zakresie arylamidazy leucynowej (40 nmoli) i fosfatazy kwaœnej (40 nmoli) oraz brak ekspresji a-galaktozydazy, b-galaktozy-dazy, trypsyny, a-chymotrypsyny, b-glukuronib-galaktozy-dazy, a-glukozydazy, n-acetylo-b-glukozamidazy, a-manno-zydazy, a-fukozydazy (tab. 2). Pozosta³e enzymy jak: fosfataza zasadowa, esteraza C4, esteraza lipazy C8 oraz naftaleno-AS-BI-fosfohydrolaza wystêpowa³y u wszystkich szczepów, a ich aktywnoœæ by³a zró¿ni-cowana i waha³a siê od 5 do 40 nmoli przy ogólnej aktywnoœci œredniej > 10 nmoli (tab. 2).

Stosunkowo nisk¹ aktywnoœæ lub jej brak wykazy-wa³y badane szczepy w zakresie lipazy C14, arylami-dazy walinowej, b-glukozyarylami-dazy i arylamiarylami-dazy cysty-nowej (œrednio < 10 nmoli). Brak ekspresji b-gluko-zydazy odnotowano u 10%, arylamidazy walinowej u 17,5%, lipazy C14 u 42,5%, a arylamidazy walino-wej u 52% badanych szczepów. Gatunek M. pachy-dermatis charakteryzuje na ogó³ brak ekspresji enzy-mów proteolitycnych oraz wiêkszoœci enzyenzy-mów gli-kolitycznych, przy wysokiej aktywnoœci w zakresie fosfatazy i arylamidazy. Podobny wzorzec metaboliz-mu wykazali równie¿ inni autorzy (20), sugeruj¹c rów-noczeœnie, ¿e brak zdolnoœci fermentacji i asymilacji wiêkszoœci wêglowodanów (11), s³abe w³aœciwoœci proteolityczne (19) oraz wysoka aktywnoœæ lipolitycz-na (23) stanowi jeden z mechanizmów adaptacji, umo¿-liwiaj¹cy bytowanie tej grupie grzybów na skórze i b³onach œluzowych gospodarza (17). Wszystkie ba-dane szczepy Malassezia cechuje ponadto wysoka aktywnoœæ enzymów z grupy fosfataz. Enzymy te od-grywaj¹ istotn¹ rolê w procesach metabolicznych wszystkich mikroorganizmów i s¹ odpowiedzialne za metabolizm fosforanów w komórce, tworz¹c, miêdzy

ii n o l o k d ¹ l g y W _<M₁a_m³e_m Œ_1-r₂ed_mn_mie _>D₂u_m¿e_m , e i k d a ³ G b u l e ³ a i b e w o m e r k o n s a j % 0 1 6 7 , 5 7 , 6 6 , * 7 2 23A,2360,%28,32, , 5 5 , 6 4 , 0 4 , 7 3 3 3 1 , 1 8 , 8 7 , 3 6 % 5 , 7 1 , 9 8 , 4 7 , 6 3 , a 4 1 7 4 1 , 4 0 1 , 3 0 1 , e i k t s r o z S e w o m e r k o n m e i c % 5 , 7 1 , 6 8 , 3 7 , 5 6 , 9 5 7 7 , 1 4 1 , 8 3 1 % 5 1 , 4 6 , 3 4 , 8 3 , A 6 2 4 2 1 , 4 9 % 0 1 0 9 , A 7 4 , 4 4 , A 6 1 Objaœnienia: * – nr szczepu

a 4 1 10 20 5 5 40 5 0 0 0 40 5 0 0 0 0 0 0 0 0 130 a 6 1 5 20 10 5 40 5 0 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 150 a 3 2 20 20 10 5 40 5 10 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 160 6 2 30 20 20 5 40 10 5 0 0 40 20 0 0 0 0 0 0 0 0 190 a 6 2 10 20 10 0 40 5 0 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 150 7 2 20 20 20 10 40 5 10 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 175 8 2 30 10 10 10 40 5 10 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 180 2 3 5 20 10 5 40 10 10 0 0 40 10 0 0 0 0 5 0 0 0 155 6 3 20 10 20 10 40 5 10 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 180 7 3 10 30 20 5 40 5 5 0 0 40 20 0 0 0 0 10 0 0 0 185 8 3 40 20 20 5 40 5 10 0 0 40 20 0 0 0 0 20 0 0 0 220 0 4 5 20 20 0 40 0 0 0 0 40 10 0 0 0 0 20 0 0 0 155 3 4 20 10 10 10 40 10 10 0 0 20 5 0 0 0 0 5 0 0 0 140 4 4 30 10 20 10 40 10 5 0 0 40 40 0 0 0 0 5 0 0 0 210 6 4 30 10 10 0 40 5 0 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 160 a 7 4 30 20 20 10 40 5 0 0 0 40 20 0 0 0 0 20 0 0 0 205 5 5 10 30 20 10 40 10 0 0 0 40 20 0 0 0 0 10 0 0 0 190 9 5 10 20 5 0 40 5 0 0 0 30 10 0 0 0 0 10 0 0 0 130 3 6 5 10 10 0 40 0 0 0 0 40 10 0 0 0 0 5 0 0 0 120 4 6 5 20 20 0 40 0 0 0 0 40 10 0 0 0 0 20 0 0 0 155 5 6 30 20 10 10 40 0 0 0 0 40 20 0 0 0 0 20 0 0 0 190 6 6 5 30 10 0 40 0 0 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 135 3 7 10 30 20 10 40 10 0 0 0 40 20 0 0 0 0 10 0 0 0 190 4 7 10 20 10 0 40 5 0 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 150 5 7 10 20 20 10 40 20 10 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 180 6 7 5 20 10 0 20 0 0 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 105 7 7 30 20 10 0 40 5 5 0 0 40 20 0 0 0 0 20 0 0 0 190 8 7 20 10 10 10 40 10 10 0 0 40 20 0 0 0 0 10 0 0 0 180 1 8 40 10 20 5 40 20 5 0 0 40 10 0 0 0 0 5 0 0 0 195 6 8 5 20 5 0 40 0 0 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 120 9 8 20 10 10 0 30 5 0 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 125 0 9 30 20 20 0 40 5 5 0 0 40 40 0 0 0 0 10 0 0 0 210 4 9 30 20 10 5 40 5 5 0 0 30 30 0 0 0 0 5 0 0 0 180 3 0 1 20 10 10 0 40 20 10 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 175 4 0 1 40 10 10 0 40 20 5 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 190 4 2 1 20 20 20 5 40 5 5 0 0 40 10 0 0 0 0 5 0 0 0 170 3 3 1 10 10 10 5 40 5 0 0 0 40 20 0 0 0 0 5 0 0 0 145 8 3 1 10 20 10 5 40 5 0 0 0 40 5 0 0 0 0 20 0 0 0 155 1 4 1 10 30 20 0 40 5 0 0 0 40 5 0 0 0 0 5 0 0 0 155 7 4 1 30 20 10 0 40 5 0 0 0 40 20 0 0 0 0 10 0 0 0 175 S B C 5 2 9 7 30 20 20 5 40 10 10 0 0 40 10 0 0 0 0 20 0 0 0 205

Nr szczepu Fosfataza zasadowa Esteraza c4 Esteraza lipazy c8 Lipaza c14 Arylamidaza leucynowa Arylamidaza walinowa Arylamidaza cystynowa Trypsyna a-chymotrypsyna Fosfataza kwaœna Naftaleno-AS-BI-fosfohydrolaza a-galaktozydaza b-galaktozydaza b-glukuronidaza a-glukozydaza b-glukozydaza

n-acetylo-b-glukozamidaza

a-mannozydaza a-fukozydaza AktywnoϾ szczepu (nmol)

innymi, ich odwracalne po³¹czenia z bia³kami (26). W przypadku dro¿d¿aków bior¹ one udzia³ w biosyn-tezie œciany komórkowej (9), ponadto stanowi¹ enzym „buforuj¹cy”, chroni¹c komórkê np. przed zbyt kwaœ-nym pH (27).

Analiza statystyczna uzyskanych wyników pozwo-li³a wyodrêbniæ spoœród szczepów M. pachydermatis 7 biotypów oraz trzy szczepy o cechach nietypowych (tab. 3). Charakterystykê biochemiczn¹ poszczegól-nych biotypów ilustruje tab. 4.

Poszerzenie charakterystyki fenotypowej szczepów M. pachydermatis o cechy dodatkowe, stosowane jako kryteria miêdzygatunkowego ró¿nicowania rodzaju Malassezia, pozwoli³o na dok³adniejsz¹ charakterysty-kê poszczególnych biotypów. Wyniki przedstawione w tab. 5 wskazuj¹, ¿e katalaza i ureaza wystêpowa³y u 100%, kazeinaza i enzymy rozk³adaj¹ce eskulinê u 95%, natomiast fosfolipaza u 50% izolatów. Hydro-lizê Tweenów 40, 60 i 80 wykazywa³o 100% szcze-pów, podczas gdy dodatek do pod³o¿a Tweenu 20

i Cremophoru EL w wiêkszoœci przypadków, hamo-wa³ wzrost grzybów (tab. 5). Celem u³atwienia anali-zy porównawczej wyników poszczególnych testów, ich interpretacji oraz obiektywizacji, dotychczasowe ozna-czenia „+” lub „–” zast¹piono cyframi, przy za³o-¿eniu, ¿e + = 1, ++ = 2, +++ = 3, ++++ = 4, – = –1, – – = –2, – – – = –3, – – – – = –4, bw = 0. Grupuj¹c wyniki wed³ug ustalonych wczeœniej biotypów wyka-zano, ¿e bez wzglêdu na zastosowane oznaczenia (API--ZYM czy testy dodatkowe), poziom ogólnej aktyw-noœci metabolicznej dla poszczególnych biotypów jest na ogó³ podobny. Odnotowano ponadto, ¿e najwy¿sz¹ zdolnoœæ do hydrolizy fosfolipidów i Tweenu 80 po-siada biotyp VI, a nastêpnie, wed³ug malej¹cych war-toœci: VII, I, IV, III, V i II (tab. 6).

Uwzglêdniaj¹c wyniki API-ZYM (tab. 4), badañ morfologicznych oraz testów dodatkowych (tab. 6), pe³na charakterystyka biotypów szczepów M. pachy-dermatis przedstawia siê nastêpuj¹co.

Biotyp I grupuje szczepy o koloniach du¿ych, g³ad-kich i jasnokremowych oraz wysokiej aktywnoœci metabolicznej, szczególnie w zakresie: naftaleno-AS--BI-fosfohydrolazy, esterazy lipazy C8, lipazy C14, kazeinazy i ureazy, przy niskiej aktywnoœci esterazy C4; ponadto wykazuj¹ one wysok¹ wra¿liwoœæ na in-hibicyjne dzia³anie Tweenu 20 i Cremophoru EL.

Biotyp II charakteryzuje szorstki typ wzrostu kolo-nii, najni¿sz¹ aktywnoœæ metaboliczn¹, brak ekspresji lipazy C14, arylamidazy walinowej i arylamidazy cys-tynowej oraz œladowa aktywnoœæ fosfolipazy.

Biotyp III cechuj¹ na ogó³ kolonie du¿e, g³adkie, o s³abej ogólnej aktywnoœci enzymatycznej i braku ak-tywnoœci arylamidazy cystynowej.

Biotyp IV o koloniach ma³ych, g³adkich, œredniej aktywnoœci metabolicznej ze szcze-gólnie siln¹ ekspresj¹ aktywnoœci w zakresie esterazy C4, œladow¹ dla arylamidazy cystynowej oraz maksy-maln¹ zdolnoœci¹ wykorzystania do wzrostu produktów hydrolizy Tweenu 40 i 60.

Biotyp V o bardzo zró¿nicowanym typie kolonii, œredniej aktywnoœci metabolicznej ze szczególnie wyso-k¹ aktywnoœci¹ arylamidazy cystyno-wej przy braku aktywnoœci fosfoli-pazy.

Biotyp VI charakteryzuj¹ kolonie g³adkie, du¿e lub œrednie, stosunko-wo wysoka aktywnoœæ enzymatycz-na, z najwy¿szym poziomem w zakre-sie fosfatazy zasadowej i arylami-dazy walinowej, a tak¿e najwy¿szej aktywnoœci w zakresie fosfolipazy, katalazy, kazeinazy, hydrolazy Tweenu 80.

Biotyp VII o zró¿nicowanym typie wzrostu, najwy¿szej ogólnej

aktyw-p y t o i B Nrszczepu I 40,90,36,78 II 63,66,76,86 II I 16A,26A,14A,74,89,133 V I 59,138,73,55,147,37 V 75,27,23A,124,141,28,32 I V 46,26,81,103,104 I V 65,94,47A,77,38 e n o z c a n z o e i n 40,64,43

Tab. 3. Biotypy szczepów Malassezia pachydermatis izolowa-nych od zwierz¹t I 2₍₅5_,,₇0₎0_**_**_* 1₍₅2,_,5₀₎0 1₍₅7,_,05₎0 ₍8₂,_,7₅5_{) (}7₂,_,5₈0_{) (}7₂,_,5₈0_{) (}3₁0₁,_,0₅0_{) (}7₂,_,5₈0₎ 1₍1₈6_,8,2₎ II ₍5₀,_,0₀0₎ 2₍0₈,_,0₁0_{) (}8₂,_,7₅5_{) (}0₀,_,0₀0_{) (}0₀,_,0₀0_{) (}0₀,_,0₀0_{) (}6₂,_,2₅5_{) (}5₀,_,0₀0₎ 4₍5₆,_,0₆0₎ II I 1₍₄0_,,₉8₎3 1₍6_5,,6₁₎0 ₍9₂,_,1₀6_{) (}2₂,_,5₇0_{) (}5₀,_,0₀0_{) (}0₀,_,0₀0₎ 1₍6₇,_,6₇₎0 4₍₂,1_,06₎ 6₍4₆,_,8₂5₎ V I 1₍3₈,_,3₁₎3 2₍₅5,_,0₄0₎ 1₍₆4,_,61₎6 ₍5₄,_,0₄0_{) (}6₂,_,6₅6_{) (}0₂,_,8₀3₎ 1₍₆5,_,68₎3 ₍1₄1_,,₀6₎ 9₍₇2,_,447₎ V 1₍6₈,_,4₅₎2 2₍₅0,_,0₇0₎ 1₍₅5,_,37₎1 ₍5₃,_,7₇1_{) (}7₅,_,8₆5_{) (}7₃,_,8₉5_{) (}8₅,_,5₅7_{) (}5₀,_,0₀0₎ 8₍₅7_,,₆1₎1 I V 3₍2₈,_,0₃₎0 1₍₄2,_,0₄₎0 1₍₅0,_,40₎0 ₍2₂,_,0₇0_{) (}1₇5_,,₀0_{) (}5₃,_,0₅0₎ 1₍₄8,_,40₎0 4₍₂,0_,20₎ 9₍₉8,_,700₎ II V 3₍₄2_,,₄0₎0 2₍0₀,_,0₀0₎ 1₍₅4_,,₄00_{) (}6₄,_,0₁0_{) (}4₂,_,0₂0_{) (}4₄,_,0₁0₎ 2₍2_4,,0₄₎0 1₍₇5,_,0₀0₎ 1₍1₉7_,8,0₎

Biotyp Fosfataza* zasadowa Esteraza C4 Esteraza lipazy C8 Lipaza C14 Arylamidaza walinowa Arylamidaza cystynowa Naftaleno-AS-BI- -fosfohydrolaza b-glukozydaza Suma (nmol)

Tab. 4. Aktywnoœæ enzymatyczna biotypów M. pachydermatis w nmol

Objaœnienia: * – uwzglêdniono jedynie enzymy o zró¿nicowanej aktywnoœci; ** – wartoœci œrednie; *** – wartoœæ odchylenia standardowego

noœci enzymatycznej, szczególnie w zakresie fosfatazy zasadowej, es-terazy C4, naftaleno-AS-BI-fosfohy-drolazy i b-glukozydazy; ponadto szczepy te charakteryzuj¹ siê wyso-k¹ zdolnoœci¹ do rozk³adu eskuliny, hydrolizy Tweenu 40, 60 i 80 oraz du¿¹ wra¿liwoœci¹ na Tween 20 i Cremophor EL (hamowanie wzro-stu).

Zró¿nicowanie w³aœciwoœci lipo-litycznych grzybów z rodzaju Ma-lassezia wykorzystane zosta³o do opracowania testów diagnostycz-nych (Tween test, asymilacja Cremo-phor EL), stanowi¹cych wa¿ne kry-terium klasyfikacji gatunkowej Ma-lassezia spp. (12). Równie¿ w przy-padku jedynego gatunku z rodzaju Malassezia, nie wymagaj¹cego sup-lementacji lipidów do wzrostu (11), heterogennoœæ w tym zakresie sta-nowi jedno z wa¿niejszych kryte-riów klasyfikacji szczepów do po-szczególnych biotypów. Stwierdzo-no ponadto wystêpowanie szczepów o cechach czêœciowej lipidozale¿-noœci (18), które bardzo s³abo rosn¹ na klasycznym pod³o¿u Sabourauda i zamieraj¹ po 2-3 pasa¿ach, podczas gdy dodatek lipidów, w sposób wy-raŸny, intensyfikuje ich wzrost i przed³u¿a ¿ywotnoœæ (19). Odno-towano równie¿ pojedyncze przy-padki izolacji szczepów M. pachy-dermatis obligatoryjnie wymaga-j¹cych suplementacji lipidów do wzrostu i nawet kilkukrotne pasa¿e in vitro nie pozwoli³y na ich adapta-cjê do warunków typowych dla dro¿d¿aków tego gatunku (6).

Reasumuj¹c nale¿y stwierdziæ, ¿e ekspresja cech fenotypowych zaraz-ka, znajduj¹ca swoje odzwierciedle-nie w klasyfikacji szczepów M. pa-chydermatis na siedem odrêbnych biotypów potwierdzi³a wysoki sto-pieñ zró¿nicowania w obrêbie tego gatunku, co zgodne jest z wynikami badañ innych autorów (20). Dal-szych badañ wymaga jednak wyka-zanie korelacji cech fenotypowych zarazka (okreœlonego biotypu) z ga-tunkiem zwierz¹t, od których by³ izolowany, miejscem bytowania (skóra i b³ony œluzowe) czy te¿ pa-togennoœci¹ grzyba. u n e e w T a zi l o r d y H 0 2 40 60 80 * a 4 1 ++++ ++++ ++++ – ++++ ––– ––– ++++ + +++ a 6 1 ++ + – ++ – –––– ––– + ++ b.w. a 3 2 ++++ + + ++++ – –––– ––– ++ ++ +++ 6 2 ++++ ++ ++ – ++++ –––– ––– ++ +++ ++++ a 6 2 +++ ++++ + ++ – ––– ––– ++ + +/– 7 2 ++++ +++ ++++ ++ – ––– – ++++ ++++ +++ 8 2 ++ ++ + ++++ – –– ––– +++ ++++ +++ 2 3 ++++ +++ ++++ ++++ – – b.w. +++ + b.w. 6 3 ++++ +++ ++++ ++++ ++ –––– –– +++ +++ ++ 7 3 ++ +++ + ++++ ++ –––– –––– +++ +++ +++ 8 3 ++++ + + ++++ – ––– –––– ++++ ++++ ++++ 0 4 +++ ++ ++ ++ – –––– ––– + +++ + 3 4 +++ +++ + ++ – ––– b.w. ++++ +++ +++ 4 4 ++++ ++ ++++ ++++ ++ –––– –––– ++ +++ + 6 4 +++ ++ ++++ ++ ++ – ––– +++ ++++ ++ a 7 4 ++++ ++++ + ++ ++ ––– –– ++ ++++ +++ 5 5 ++++ ++ ++++ ++++ ++ –– ––– +++ +++ ++ 9 5 +++ +++ + ++ ++ –– b.w. ++++ +++ + 3 6 ++++ +++ + ++++ – ––– –– +++ ++ + 4 6 ++ ++++ ++++ ++ – –– – +++ +++ ++++ 5 6 +++ ++ ++ ++++ ++ –––– ––– ++ ++ ++ 6 6 +++ ++ + ++ ++ –––– –– +++ +++ + 3 7 ++++ +++ + ++++ – –– –––– +++ ++++ ++ 4 7 ++++ +++ + ++ ++++ ––– ––– +++ +++ +++ 5 7 ++ +++ ++++ ++++ – ––– ––– ++ ++ + 6 7 ++ +++ ++++ ++ – –––– ––– +++ ++++ ++ 7 7 ++ +++ ++++ ++++ ++ –––– b.w. ++ +++ +++ 8 7 ++ +++ ++++ ++++ – –– ––– +++ +++ ++++ 1 8 ++++ +++ ++++ ++ ++++ ––– ––– +++ +++ +++ 6 8 ++++ ++++ – ++++ – –– ––– ++ +++ ++ 9 8 +++ ++++ ++++ ++ ++ –– ––– ++ ++ ++ 0 9 ++++ +++ ++++ ++++ ++++ –––– –––– ++ + ++ 4 9 ++++ +++ + ++++ ++ –––– –––– ++++ ++++ ++ 3 0 1 ++++ +++ ++++ ++ ++ –––– b.w. ++ ++ +++ 4 0 1 +++ ++++ ++++ ++ ++ –– b.w. +++ +++ +++ 4 2 1 ++++ +++ + ++++ – –––– b.w. +++ +++ ++ 3 3 1 ++++ +++ – ++ – –––– ––– ++++ ++++ ++++ 8 3 1 +++ +++ + ++ – –– ––– ++ +++ ++ 1 4 1 ++++ +++ ++++ ++ – ––– ––– +++ +++ +++ 7 4 1 ++++ ++ ++++ ++++ ++ –– ––– +++ +++ ++ S B C 5 2 9 7 ++++ +++ ++++ ++++ ++ –– ––– ++ +++ +++ Tab. 5. Aktywnoœæ enzymatyczna szczepów Malassezia – dodatkowe testy bio-chemiczne

Piœmiennictwo

1.Aspiroz C., Ara M., Varea M., Rezusta A., Rubio C.: Isolation of Malassezia globosa and Malassezia sympodialis from patients with pityriasis versicolor in Spain. Mycopathologia 2001, 154, 111-117.

2.Bond R., Anthony R. M.: Characterization of markedly lipid-dependent Malassezia pachydermatis isolates from healthy dogs. J. Appl. Bacteriol. 1995, 78, 537-542.

3.Bond R., Lamport A. J., Lloyd D. H.: Colonization status of Malassezia pachydermatis on the hair and in the hair follicle of healthy beagle dogs. Res. Vet. Sci. 2000, 68, 291-293.

4.Breuer-Strosberg R., Hocheithner M., Kuttin E. S.: Malassezia pachyder-matis isolation from a scarlet mascaw. Mycoses 1990, 33, 247-250. 5.Crespo M. J., Abarca M. J., Cabanes F. J.: Occurence of Malassezia spp. in

horses and domestic ruminants. Mycoses 2002, 45, 333-337.

6.Crespo M. J., Abarca M. L., Cabanes F. J.: Atypical lipid-dependent Malas-sezia species isolated from dogs with otitis externa. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 2383-2385.

7.David M., Gabriel M., Kopecka M.: Unusual ultrastructural characteristic of yeast Malassezia pachydermatis. Scr. Med. 2003, 76, 173-186.

8.Duarte E. R., Melo M. M., Hahn R. C., Hamdan J. S.: Prevalence of Malas-sezia species in the ears of asymptomatic cattle with otitis in Brasil. Med. Mycology 1999, 37, 159-162.

9.Gueho E., Boeghout T., Ashbee H. R., Guillot J., Van Belkum A., Faerge-mann J.: The role of Malassezia species in the ecology of human skin and as pathogens. Med. Mycology 1998, 36, 220-229.

10.Gueho E., Midgley G., Guillot J.: The genus Malassezia with description of four new species. Antonie Van Leeuwenhoek 1996, 68, 337-355.

11.Guillot J., Bond R.: Malassezia pachydermatis: a review. Med. Mycology 1999, 37, 295-306.

12.Guillot J., Gueho E., Lesourd M., Midgley G., Chevrier G., Dupont B.: Iden-tification of Malassezia species: A practical approach. J. Mycol. Med. 1996, 6, 133-110.

13.Guillot J., Gueho E.: The diversity of Malassezia yeasts confirmed by rRNA sequence and nuclear DNA comparisons. Antonie Van Leeuwenhoek 1995, 67, 297-314.

14.Gupta A. K., Kohli Y., Summerbell R. C.: Molecular differentiation of seven Malassezia species. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 1869-1875.

15.Gupta A. K., Kohli Y., Summerbell R. C., Faergemann J.: Quantitative cultu-re of Malassezia species from diffecultu-rent body sites of individuals with or with-out dermatoses. Med. Mycology 2001, 39, 243-251.

16.Inamader A. C., Palit A.: The genus Malassezia and human disease. Indian J. Dermatol. 2003, 69, 265-270.

17.Kesavan K. S., Holland K. T., Ingham E.: The effects of lipid extraction on the immunomodulatory activity of Malassezia spp. in vitro. Med. Mycology 2000, 38, 239-247.

18.Kiss G., Radvanyi S., Szigeti G.: Characteristic of Malassezia pachydermatis strains isolated from canine otitis externa. Mycoses 1996, 39, 313-321. 19.Król J., Staroniewicz Z.: Ocena aktywnoœci enzymatycznej grzybów

dro¿d¿o-podobnych Malssezia pachydermatis izolowanych od psów. Mykologia Lek. 2000, 7, 7-12.

20.Mancianti F., Rum A., Nardoni S., Carazza M.: Extracellular enzymatic acti-vity of Malassezia species. Mycopathologia 2000, 149, 131-135.

21.Mickelsen P. A., Viano-Paulson M. C., Stevens D. A., Diaz P. S.: Clinical and microbiological features of infection with Malassezia pachydermatis in high-risk infant. J. Infect. Dis. 1988, 6, 1163-1168.

22.Nakagaki K., Hata K., Iwata E., Takeo K.: Malassezia pachydermatis isola-ted from a South American Sea Lion with dermatitis. J. Vet. Med. Sci. 2002, 62, 901-903.

23.Plotkin L. I., Squiquera L., Mathov I., Galimberti R., Leoni J.: Characteriza-tion of the lipase activity of Malassezia furfur. J. Med. Vet. Mycol. 1996, 34, 43-48.

24.Ramsay I. O., Silverman B. W.: Applied functional data analysis. Method and case study. Springer Verlag, Nowy Jork 2002.

25.Shattuck K. E., Cochran C. K., Zabrausky R. J., Pasarell L., Davis J. C., Malloy M. H.: Colonization and infection associated with Malassezia and Candida species in a neonatal unit. J. Hosp. Infect. 1996, 34, 123-129. 26.Tuleva B., Vasileva-Tonkova E., Galabova D.: A specific alkaline

phospha-tase from Saccharomyces cerevisiae with protein phosphaphospha-tase activity. FEMS Microbiol. Lett. 1998, 161, 139-144.

27.Vasilieva-Tonkova E., Balasheva D. M., Galabova D.: Influence of growth temperature on the acid phosphatase activity in the yeast Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiol. Lett. 1996, 145, 267-271.

28.Wo³oszyn S., Winiarczyk S.: Rola grzybów z rodzaju Pityrosporum w pato-genezie schorzeñ skórnych. Medycyna Wet. 1986, 42, 131-135.

Adres autora: dr hab. Gra¿yna Zió³kowska prof. nadzw. AR; e-mail: g-ziolkowska@go2.pl

Objaœnienia: * – wartoœci liczbowe wed³ug klucza umieszczonego w tekœcie p y t o i B Katalaza Ureaza Kazeinaza b-glukozydaza Fosfoilpaza CremophorEL Tween20 Tween40 Tween60 Tween80 Suma I *3,50* 3,25 4,0 4,00 2,00 –3,50 –3,25 2,50 2,50 2,25 17,25 II 3,25 3,00 1,5 3,00 0,50 –3,25 –2,50 2,75 3,00 1,50 12,75 II I 3,33 3,16 1,6 1,66 1,66 –3,16 –3,00 2,66 2,16 2,16 12,23 V I 3,33 2,66 2,0 3,33 2,00 –2,33 –2,25 3,00 3,16 2,00 16,90 V 3,40 2,57 2,7 3,42 0,00 –2,85 –2,00 2,85 2,71 2,20 15,01 I V 3,60 2,80 3,5 1,60 2,80 –2,80 –2,00 2,60 3,00 3,00 18,10 II V 3,40 2,60 1,8 3,60 1,60 –3,60 –2,70 2,80 3,40 2,80 15,70 Tab. 6. Aktywnoœæ enzymatyczna biotypów Malassezia pachydermatis – dodatkowe testy biochemiczne