Medycyna Wet. 2006, 62 (10) 1183
Praca oryginalna Original paper
Jednym z bardziej toksycznych sk³adników zanie-czyszczeñ powietrza jest ozon. Gaz ten jest g³ównym elementem smogu fotochemicznego i charakteryzuje siê wysok¹ reaktywnoci¹ chemiczn¹. Jego bezpored-nie oddzia³ywabezpored-nie na organizm zachodzi poprzez uk³ad oddechowy. Szkodliwy wp³yw tego gazu na inne ni¿ p³uca tkanki i narz¹dy wi¹¿e siê z uruchomieniem kas-kady reakcji, w wyniku których powstaj¹ wolne rod-niki tlenowe (ROS), cechuj¹ce siê obecnoci¹ niespa-rowanego elektronu. Reaguj¹c z moleku³ami biologicz-nymi, generuj¹ one powstawanie kolejnych wolnych rodników, co prowadzi do zaburzeñ struktury i funk-cji tych cz¹steczek. Zjawisko to dotyczy wszystkich g³ównych szlaków metabolicznych, przede wszystkim lipidów, bia³ek i wêglowodanów (12, 18).
Jednym z wa¿niejszych markerów stresu oksydacyj-nego jest koñcowy produkt peroksydacji lipidów dial-dehyd malonowy (MDA). Zwi¹zek ten uszkadza poli-peptydy, moduluje zjawisko cross-linking w bia³kach, dzia³a mutagennie i karcynogennie (5).
Organizmy ¿ywe wykszta³ci³y szereg mechanizmów obronnych, przerywaj¹cych reakcje wolnorodnikowe i chroni¹cych je przed stresem oksydacyjnym. Jednym z powszechnie wystêpuj¹cych i stosowanych anty-oksydantów jest witamina C (kwas askorbinowy) redukuj¹ca reaktywne formy tlenowe, a jednoczenie aktywnie uczestnicz¹ca w szeregu przemian metabo-licznych (1, 7).
Celem badañ by³o okrelenie, czy wysokie dawki witaminy C ³agodz¹ skutki stresu oksydacyjnego wy-wo³ywanego przez ozon oraz czy wywieraj¹ wp³yw na jego przebieg.
Materia³ i metody
Badania przeprowadzono na 36 doros³ych szczurach sam-cach rasy Wistar Hannower, o redniej masie cia³a 420 ± 10 g i wieku 12 miesiêcy. Wszystkie zwierzêta zosta³y losowo podzielone na 6 grup, oznaczonych nastêpuj¹cymi skrótami (w ka¿dej n = 6): I (K) zwierzêta kontrolne; II (20C + Oz) i III (40C + Oz) zwierzêta ozonowane i otrzymuj¹ce domiêniowe iniekcje witaminy C (Vitami-num C, Pliva Kraków) w dawkach odpowiednio 20 i 40 mg/ /szczura oraz IV (20C) i V (40C) zwierzêta nieozonowa-ne, otrzymuj¹ce ww. dawki witaminy C co 5 dni przez okres 35 dni; VI (Oz) szczury ozonowane bez iniekcji witamin. Szczury z grupy II i III i VI eksponowano na 0,5 ± 0,2 ppm ozonu przez okres 35 dni po 5 h dziennie.
Ozon wytwarzano ze sprê¿onego powietrza w ozonato-rze typu IMPOZ-4 (Instytut Mechaniki Precyzyjnej, War-szawa) i dostarczano go do uszczelnionego chemicznie neutraln¹ foli¹ polietylenow¹ pomieszczenia, gdzie ulega³ samorzutnemu przemieszaniu z obecnym tam powietrzem. Stê¿enie ozonu w komorze ekspozycyjnej kontrolowano metod¹ jodometryczn¹ (14). Podczas ozonowania zwierzêta mia³y swobodny dostêp do wody, natomiast pasza, ze wzglê-du na utleniaj¹cy wp³yw ozonu, by³a odstawiana. Poza piê-cioma godzinami ekspozycji wszystkie szczury
przebywa-Wp³yw wysokich dawek witaminy C i ozonu
na przebieg stresu oksydacyjnego u szczurów
MARIA JEDLIÑSKA-KRAKOWSKA
Zespó³ Patofizjologii Katedry Patologii i Farmakologii Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UWM, ul. Oczapowskiego 13, 10-718 Olsztyn
Jedliñska-Krakowska M.
Influence of high doses of vitamin C and ozone on the course of oxidative stress in rats Summary
The aim of the study was to determine whether high doses of Vitamin C may alleviate the effects of oxidative stress caused by ozone, or whether they actually intensify its course and demonstrate pro-oxidative activity. The experiment was conducted on adult male rats divided into 6 groups: Group I control animals; Group II and III animals which were simultaneously ozonated and administered intramuscular injections of Vit C in doses of 20 and 40 mg/rat respectively; Group IV and V non-ozonated animals, which were administered the above doses of Vit C every fifth day for a period of 35 days; Group VI rats ozonated without Vit C.
The results of the study indicated that the highest level of indexes defining the intensity of oxidative stress occurred both in animals which were ozonated and given high doses of Vit C as well as in non-ozonated animals which were given high doses the vitamin. AST activity and glucose levels were also highest in the above groups and displayed a similar pattern. It may thus be assumed that high doses of Vit C do not prevent organisms from ozone-induced oxidative stress, and may even increase its intensity.
Medycyna Wet. 2006, 62 (10) 1184
³y w identycznych warunkach uwzglêdniaj¹cych sk³ad powietrza, temperaturê i sposób ¿ywienia. Po zakoñczeniu dowiadczenia od wszystkich szczurów, bêd¹cych w narkozie halotanowej (Narcotan, Leciva Czechy), pobrano maksy-maln¹ iloæ krwi metod¹ punkcji serca. Bezporednio po skrwawie-niu zwierzêcia wyciêto fragment w¹troby, nerki oraz gonady w celu oznaczenia w nich koncentracji dialdehydu malonowego (MDA) (16). MDA oznaczano w 20%
ho-mogenacie z ww. tkanek, sporz¹dzonym na bazie p³ynu fizjologicznego. W pe³nej krwi, zaraz po jej pobraniu, ozna-czono aktywnoæ peroksydazy glutationowej (GPx) (10), za w osoczu krwi okrelono koncentracjê dialdehydu ma-lonowego (16) i glukozy (zestaw diagnostyczny Biochem-test, Polskie Odczynniki Chemiczne, Gliwice) oraz aktyw-noæ aminotransferazy alaninowej (ALT) i asparaginia-nowej (AST) (zestawy diagnostyczne Pointe Scientific, Pointe Scientific Polska sp. z o.o., Warszawa).
Statystyczne opracowanie wyników obejmowa³o wyli-czenie rednich arytmetycznych, b³êdu standardowego red-niej i istotnoci ró¿nic w stosunku do grupy kontrolnej.
Badania na zwierzêtach wykonano zgodnie z wytyczny-mi ustawy o ochronie zwierz¹t i zaleceniawytyczny-mi Lokalnej Ko-misji Etycznej ds. Dowiadczeñ na Zwierzêtach przy UWM w Olsztynie (Opinia nr 26/N, wyd. 29.04.2005).
Wyniki i omówienie
U wszystkich ozonowanych szczurów zaobserwo-wano wzrost aktywnoci peroksydazy glutationowej oraz podwy¿szon¹ koncentracjê dialdehydu malono-wego, zarówno w tkankach, jak i we krwi (tab. 1). Najwy¿sza aktywnoæ GPx mia³a miejsce u zwierz¹t ozonowanych oraz w grupach otrzymuj¹cych najwy¿-sze dawki witaminy C. Podobnie kszta³towa³a siê kon-centracja MDA w osoczu, osi¹gaj¹c najwy¿sze war-toci u szczurów ozonowanych i otrzymuj¹cych iniek-cje kwasu askorbinowego (AA). Wzrost poziomu obu tych wskaników we krwi nastêpuje zwykle równo-legle wzrostowi aktywnoci GPx towarzyszy wzrost poziomu MDA (13). Wi¹¿e siê to, z jednej strony, ze zwiêkszonym zu¿yciem antyoksydantów i zredukowa-nego glutationu, z drugiej za, z nasileniem procesu peroksydacji lipidów (1). W tkankach najwy¿szy po-ziom dialdehydu malonowego zaobserwowano w ner-kach, gdzie wzrós³ on statystycznie istotnie (s.i.) we wszystkich grupach dowiadczalnych, w przeciwieñ-stwie do w¹troby, gdzie zanotowano tylko niewielkie, nieistotne jego wahania. Z kolei w j¹drach najwy¿sz¹ koncentracjê MDA zanotowano u zwierz¹t ozonowa-nych oraz otrzymuj¹cych najwy¿sze dawki witaminy C. Zarówno w¹troba, jak i nerki, bêd¹c magazynami glikogenu, odgrywaj¹ kluczow¹ rolê zarówno w syn-tezie, jak i metabolizmie askorbinianów. Istnieje wy-rana wspó³zale¿noæ miêdzy ich poda¿¹ a syntez¹
i katabolizmem. Przy wzrocie stê¿enia askorbinianów (zarówno endo-, jak i egzogennych) spada aktywnoæ oksydazy L-gulonolaktonu, a wiêc i ich wytwarzanie, g³ównie w w¹trobie (1). Ponadto pobieranie witaminy C przez ró¿ne tkanki nie jest jednakowe. Najwiêksze jej iloci wychwytywane s¹ przez narz¹dy o wysokiej aktywnoci metabolicznej. W zwi¹zku z tym anty- b¹d prooksydacyjne dzia³anie kwasu askorbinowego bê-dzie zró¿nicowane w poszczególnych tkankach. Z ko-lei g³ówn¹ drog¹ eliminacji AA i jego metabolitów, jak równie¿ wysoce toksycznego MDA s¹ nerki (1, 3), st¹d ich nara¿enie na stres oksydacyjny jest stosunko-wo wysokie.
W dostêpnej literaturze istniej¹ zró¿nicowane dane dotycz¹ce zarówno anty-, jak i prooksydacyjnego dzia-³ania ró¿nych dawek witaminy C. W du¿ych dawkach, w obecnoci metali aktywnych w reakcjach redox, mo¿e ona dzia³aæ jako prooksydant, przyczyniaj¹c siê do formowania rodników hydroksylowych, jednej z najbardziej aktywnych form ROS. Zachodzi to po-przez reakcjê Fentona, gdzie jony metali przejciowych s¹ systematycznie redukowane przez askorbiniany. Pro-wadzi to do nasilenia procesów utleniania lipidów, bia³ek czy DNA. W uk³adach biologicznych ¿elazo rzadko wystêpuje w stanie wolnym, lecz przewa¿nie w po³¹czeniu z bia³kami, co nie dopuszcza do katali-zowania procesów peroksydacji. Zarówno egzogenne metale przejciowe, jak i askorbiniany zwiêkszaj¹ uwalnianie ¿elaza z bia³ek wi¹¿¹cych, co nasila te pro-cesy (reakcja Fentona) (2, 9). Istniej¹ce w literaturze rozbie¿noci dotycz¹ce ochronnego dzia³ania witami-ny C na lipidy, bia³ka i DNA mog¹ wynikaæ z ró¿nej zdolnoci makromoleku³ do wi¹zania jonów metali i natê¿enia reakcji redox zachodz¹cych z udzia³em tych jonów (2, 9). Nie we wszystkich wiêc narz¹dach taka sama dawka witaminy bêdzie wywiera³a identyczne dzia³anie. Wed³ug Suresh i wsp., w w¹trobie tylko wy-sokie dawki zapobiegaj¹ szkodliwym skutkom stresu oksydacyjnego (15). Z kolei wczeniejsze badania w³asne wykaza³y, ¿e du¿e dawki kwasu askorbinowe-go prowadz¹ w j¹drach do uszkodzeñ nab³onka plem-nikotwórczego i przedwczesnej spermiacji, nawet w grupach zwierz¹t nie eksponowanych na ozon (6).
Wykazano, ¿e witamina C w dawkozale¿ny sposób stymuluje syntezê tlenku azotu (NO). W du¿ych
stê-a k s W /nik a p u r G / (GUP/x)l MD(AµMos/o)lcze MD(µAMj/¹d)lra MD(µAMn/e)lrki MDA(µwM¹/rt)loba K 2192±50,2 6,50±0,13 2,20±0,02 3,20±0,22 3,60±0,12 z O + C 0 2 2315±29,4 7,05*±0,22 2,10±0,06 5,10**±0,28 3,50±0,20 z O + C 0 4 2439**±65,3 8,10**±0,29 2,40*±0,02 5,00**±0,22 4,00±0,08 C 0 2 2095±85,5 6,65±0,08 2,20±0,02 4,35**±0,22 4,10±0,13 C 0 4 2450**±29,8 6,60±0,44 3,40**±0,11 4,55**±0,11 3,80±0,18 z O 2433*±53,9 6,90*±0,02 3,00**±0,15 4,35**±0,22 4,20±0,42 Tab. 1. Poziom wybranych wskaników stresu oksydacyjnego u szczurów (x ± SEM)
Medycyna Wet. 2006, 62 (10) 1185
¿eniach dzia³a on prooksydacyjnie, gdy¿ pod wp³ywem aktywnych form tlenu tworz¹ siê nadazotyny, które same inicjuj¹ procesy peroksydacji. Ponadto NO, podobnie jak kwas askorbinowy, hamuje aktywnoæ niektórych enzymów antyoksydacyjnych (8, 17). Zja-wiska tego nie obserwowano przy ³¹cznym podawa-niu askorbinianów i witaminy E (4). Wczeniejsze ba-dania w³asne wykaza³y, ¿e w ni¿szych dawkach AA wykazuje dzia³anie antyoksydacyjne, najskuteczniej-sze przy podawaniu ³¹cznym w³anie z witamin¹ E (6). We wszystkich dowiadczalnych grupach zwierz¹t zaobserwowano wzrost poziomu glukozy, najsilniej-szy u szczurów ozonowanych oraz ozonowanych pod os³on¹ witaminy C (tab. 2). Podobnie kszta³towa³a siê aktywnoæ aminotransferazy asparaginianowej. Z ko-lei aminotransferaza alaninowa wykazywa³a najwy¿-sz¹ aktywnoæ u zwierz¹t ozonowanych i otrzymuj¹-cych najwy¿sze dawki kwasu askorbinowego.
Glukoza jest podstawowym substratem w syntezie kwasu askorbinowego, jednak¿e przy tak wysokiej poda¿y zewnêtrznej AA proces ten ulega zahamowa-niu. Wzrost jej poziomu mo¿e w niespecyficzny spo-sób wskazywaæ na istniej¹cy w organizmie stan stre-su, przebiegaj¹cy z uruchomieniem uk³adu wspó³czul-no-rdzeniowo-nadnerczowego, a nastêpnie podwzgó-rzowo-przysadkowo-korowo-nadnerczowego. Ponadto sama witamina C uczestniczy w syntezie katechola-min i steroidów nadnerczowych, porednio wp³ywa-j¹c na koncentracjê glukozy we krwi. Wykazano rów-nie¿, ¿e w stanie stresu oksydacyjnego dochodzi do upoledzenia funkcji bia³ka wi¹¿¹cego insulinê, które jest wa¿nym elementem transportera glukozy do wnê-trza komórki (11).
Podobnie nieswoistym, chocia¿ bardzo czu³ym wskanikiem zmian patologicznych zachodz¹cych w tkankach jest aktywnoæ aminotransferaz. Stosunek poziomów AST i ALT mo¿e wskazywaæ na uszkodze-nie innych ni¿ w¹troba tkanek, takich jak: miêsieñ ser-cowy, nerki czy p³uca. Wiadomym jest, ¿e MDA sam bêd¹c produktem patologicznego metabolizmu lipi-dów, przekszta³ca strukturê wielu biomoleku³, m.in. nasilaj¹c procesy mia¿d¿ycowe i uszkadzaj¹c miêsieñ sercowy (3).
Na podstawie uzyskanych wyników mo¿na przy-puszczaæ, i¿ wysokie dawki witaminy C nie tylko nie zapobiegaj¹ wyst¹pieniu stresu oksydacyjnego indu-kowanego przez ozon, ale wrêcz zwiêkszaj¹ jego na-tê¿enie.
Pimiennictwo
1.Banhegyi G., Braun L., Csala M., Puskas F., Mandl J.: Ascorbate metabo-lism and its regulation in animals. Free Radical Biol. Med. 1997, 23, 793-803. 2.Carr A., Frei B.: Does vitamin C act as pro-oxidant under physiological
con-ditions? FASEB J. 1999, 13, 1007-1024.
3.Del Rio D., Stewart A. J., Pellegrini N.: A review of recent studies on malon-dialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 2005, 15, 316-328.
4.Gorbunov N. V., Osipov A. N., Sweetland M. A., Day B. W., Elsayed N. M., Kagan V. E.: NO-redox paradox: direct oxidation of a-tocopherol and a-tocopherol-mediated oxidation of ascorbate. Biochem. Biophys. Res. Com-mun. 1996, 219, 835-841.
5.Hipkiss A. R., Preston J. E., Himswoth D. M., Worthington V. C., Abbot N. J.: Protective effect of carnosine against malondialdehyde-induced toxicity towards cultured rat brain endothelial cells. Neurosci. Lett. 1997, 238, 135--138.
6.Jedliñska-Krakowska M., Bomba G., Jakubowski K., Rotkiewicz T., Jana B.: The impact of oxidative stress and supplementation with vitamins E and C on testes morphology in rats. J. Reprod. Dev. 2006, 52, 203-209.
7.Madej E., Grzêda M.: W³aciwoci, niedobór i zakres zastosowañ witami-ny C w lecznictwie. Medycyna Wet. 2000, 56, 627-631.
8.Mizutani A., Maki H., Torii Y., Hitomi K., Tsukagoshi N.: Ascorbate-depen-dent enhancement of nitric oxide formation in activated macrophages. Nitric Oxide 1998, 2, 235-241.
9.Naidu A. K.: Vitamin C in human health and disease is still a mistery? An overview. Nutr. J. 2003, 2, 7.
10.Paglia D. E., Valentine W. N.: Studies on quantitative and qualitative cha-racterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J. Lab. Clin. Med. 1967, 70, 158-169.
11.Pessler D., Rudich A., Bashan N.: Oxidative stress impairs nuclear proteins binding to the insulin responsive element in the GLUT4 promoter. Diabeto-logia 2001, 44, 2156-2164.
12.Pryor W. A., Squadrito G. L., Friedman M.: The cascade mechanism to explain ozone toxicity: the role of lipid ozonation products. Free Radical Biol. Med. 1995, 19, 935-941.
13.Qujeq D., Aliakbarpour H. R., Kalavi K.: Relationship between malondial-dehyde level and glutathione peroxidase activity in diabetic rats. Clin. Chim. Acta. 2004, 340, 79-83.
14.Saltzman B. E., Gilbert N.: Iodometric microdetermination of organic oxi-dants and ozone. Anal. Chem. 1959, 31, 1914-1920.
15.Suresh M. V., Sreeranjit Kumar C. V., Lal J. J., Indira M.: Impact of massive ascorbic acid supplementation on alcohol induced oxidative stress in guinea pigs. Toxicol. Lett. 1999, 104, 221-229.
16.Ward A. P., Till O. G., Hatherill J. R., Annersley T. M., Kunkel R. G.: Syste-matic complement activation, lung injury and products of lipid peroxidation. J. Clin. Invest. 1985, 76, 517-527.
17.Zaj¹c M., Pawe³czyk E.: Chemia leków. Akademia Medyczna im. K. Mar-cinkowskiego, Poznañ 2000, 629-635.
18.Zieliñski H.: Ozon jego znaczenie i toksycznoæ. Medycyna Wet. 1997, 53, 323-329.
Adres autora: dr Maria Jedliñska-Krakowska, ul. Oczapowskiego 13, 10-718 Olsztyn; e-mail: maried@uwm.edu.pl
Objanienia: jak w tab. 1.
Tab. 2. Poziom wybranych wskaników biochemicznych w osoczu krwi szczurów (x ± SEM)
a k s W /nik a p u r G / G(mlugk/odza)l A(UL/T)l A(US/T)l K 55,7±2,17 33,60±2,82 102,5±4,46 z O + C 0 2 74,22**±4,69 25,60±2,32 167,15*±20,50 z O + C 0 4 81,40**±6,60 42,80*±2,12 144,0*±14,00 C 0 2 66,35±6,57 36,80±2,82 111,7±19,90 C 0 4 66,72±1,27 36,50±2,32 118,7±11,90 z O 79,30**±7,07 41,07±4,86 137,5*±11,70
